我国是农药生产和使用大国。据统计，2015年我国农药使用量为92.64万吨(束放等，2016)。农药能有效控制病虫害，确保农作物增产增收，但不合理的使用会造成生态环境污染。目前我国存在农药使用不合理的问题，已经造成严重的生态污染，并危及到人类健康(郭晨，2016)。

氧化乐果化学名为O，O-二甲基-S-[2-(甲胺基)-2-氧代乙基]硫代磷酸酯，是一种高效有机磷杀虫剂，由于价格低，效果好，在国内农业生产中广泛使用。目前，国内外对氧化乐果的研究主要集中在氧化乐果的降解和植物吸收上(潘奇正等，2013；吴虹玥等，2013；Zhang et al., 2014)，对两栖动物的毒理方面研究不多，仅有Isnas等(2012)就其对湖蛙Rana ridibunda各种组织氧化应激标志物的影响，以及张明旺等(2013)对中华蟾蜍Bufo gargarizans蝌蚪进行了氧化乐果的急性毒性研究。

两栖类具有高渗透性的皮肤和无羊膜的卵，对生活环境的化学污染物较为敏感，因此可作为环境监测的指示生物。近年来关于农业污染物对两栖类的影响已有大量报道，但集中在无尾两栖类(卢祥云等，2002；周景明等，2006；尹晓辉，2008；张明旺等，2013)。红瘰疣螈Tylototriton shanjing是分布于我国云南中西部的一种有尾两栖类，国家Ⅱ级重点保护野生动物(赵尔宓，1998)。本文以红瘰疣螈为试验对象，研究了氧化乐果对其胚胎期及蝌蚪期的毒性影响，为更好地保护该物种和合理使用农药提供了依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验材料

2011年5月和2015年6月(由于云南干旱和红瘰疣螈野外栖息地被破坏，2012—2014年野外未收集到足够的待繁殖成体，故于2015年才进行补充试验)，将采自云南大理苍山国家级自然保护区的红瘰疣螈雌雄待繁殖个体带回本实验室的水族箱中饲养，室温19~22 ℃，水族箱底部铺上适量的沙石，并种植标本采集地的水生植物，放入适量的水、水藻和少量田螺及水蚯蚓，3 d更换一次水。待雌性产卵后，立即收集受精卵，镜检，剔除未受精的卵。受精卵一部分直接用于胚胎期毒性试验，另一部分置于大水槽中正常培养至蝌蚪期用于蝌蚪期毒性试验。

1.1.2 试验试剂

氧化乐果为山东大成农药股份有限公司生产的40%氧化乐果乳油。

1.2 方法

胚胎期：参考大田使用的浓度进行预试，找出氧化乐果作用的大致浓度范围，即出现全部死亡的最低浓度。然后依次设计30 mg·L^-1、15 mg·L^-1、8 mg·L^-1、4 mg·L^-1 4个浓度梯度。将同一批次的红瘰疣螈受精卵随机30粒一组，分别放入盛有供试浓度梯度氧化乐果溶液的培养皿内。设2个平行组和1个对照组，试验在室内进行，水温22 ℃±0.5 ℃。按胚胎发育的各个时期(杨国辉等，2011)进行连续观察。畸形胚胎表现为腹部膨胀透明、全身皱缩卷曲、脊柱弯曲等，死亡胚胎表现为胚胎停止发育。试验过程中记录畸形数和死亡数，死亡胚胎予以剔除，统计平均值。

蝌蚪期：试验采用刚出膜的蝌蚪，参照无尾两栖类的gosner分期标准，从后肢芽发育开始为蝌蚪期，红瘰疣螈胚胎发育共22期，试验蝌蚪即处于gosner22期，此时的蝌蚪前肢芽末端分成三叉，后肢芽出现，色斑增多加深，出膜(赵尔宓，1990；杨国辉等，2011)。预试时，将gosner22期的红瘰疣螈蝌蚪进行24 h、48 h、72 h和96 h半致死浓度(LC₅₀)测定，水温22.5~23.5 ℃，pH6.8~7.6，统计染毒个体死亡数，计算LC₅₀和安全浓度(贾春生，2006)。在安全浓度下设5个梯度，每20只蝌蚪为一组，置于大水槽内，设2个平行组和1个对照组，每24 h更换一次培养溶液，清理食物残渣、排泄物和死亡的蝌蚪。蝌蚪体长用生物体视成像系统(NIKON-SMZ1000) 测量、记录，体质量是将蝌蚪从染毒溶液中取出放入赛多利斯分析天平(AB204-S)内1个盛有10 mL水(22 ℃±0.5 ℃)的培养皿内称量，结束后再次放置于染毒溶液中。试验持续25 d，直至蝌蚪变态结束，每5 d测量一次蝌蚪的体长、体质量。

1.3 统计分析

胚胎期试验数据用Excel和SPSS 16.0进行统计分析；对试验前不同浓度组蝌蚪生长指标的差异用单因素方差分析(One-Way ANOVA)及t²检验(双样本等方差假设)，并对试验前后蝌蚪体质量、体长的增长率进行回归分析，数据以平均值±标准误表示，显著性水平设置为α=0.05。

2 结果与分析 2.1 氧化乐果对红瘰疣螈胚胎发育的毒性影响

为便于统计，本文将红瘰疣螈胚胎发育的22个时期分为细胞期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、外腮期、开口期及出膜期，各期历时按60%个体数均发育到此时期为标准。试验发现，氧化乐果对胚胎发育的影响主要在开口期和出膜期，其余各期受毒性影响不明显(图 1，图 2)。

在正常发育条件下，红瘰疣螈胚胎很少发生畸形。本试验中红瘰疣螈从囊胚期开始出现畸形，且随着氧化乐果浓度的增大，畸形率逐渐升高(图 1)。畸形胚胎与正常胚胎在形态上有很大差异：神经胚期前畸形发生在胚胎背唇及胚孔附近，主要表现为腹部膨胀呈透明状，胚体弯曲，全身皱缩卷曲，一段时间后死亡；神经胚期后畸形多发生在胚胎的脊椎部位，主要表现为尾部弯曲，但胚体能继续发育，在蝌蚪早期死亡(图版Ⅰ)。

自然状态下，红瘰疣螈胚胎的死亡率较低，全部都能正常发育。试验结果显示，随着氧化乐果浓度的增大，红瘰疣螈的死亡率逐渐升高，且呈线性增长(图 2)，出膜期和开口期受毒性影响较大，其余各期影响较小。出膜期后胚胎脱离卵胶膜的保护，农药成分可直接渗透进入正在发育中的胚胎，导致胚胎畸形和死亡；而开口期后，蝌蚪开始主动吞咽，氧化乐果随水流进入蝌蚪体内，导致死亡率升高。

2.2 氧化乐果对红瘰疣螈蝌蚪生长的影响 2.2.1 氧化乐果染毒24~96 h红瘰疣螈蝌蚪的LC₅₀及安全浓度

gosner22期红瘰疣螈蝌蚪24 h、48 h、72 h和96 h的LC₅₀分别为1.62 mg·L^-1、0.79 mg·L^-1、0.48 mg·L^-1、0.61 mg·L^-1，安全浓度为0.05 mg·L^-1。

2.2.2 氧化乐果对红瘰疣螈蝌蚪生长的影响

试验前，各浓度组中蝌蚪的各项生长指标差异较小，经单因素方差分析，其体长、体质量差异均无统计学意义(F=1.57，P＞0.05；F=1.38，P＞0.05)。而试验结果显示，与对照组相比，0.03 mg·L^-1浓度下蝌蚪体质量增长量最大，0.05 mg·L^-1浓度下蝌蚪体质量出现负增长，蝌蚪在不同浓度氧化乐果下体长增长量大小依次是0.03 mg·L^-1＞0.02 mg·L^-1＞对照组＞0.01 mg·L^-1＞0.04 mg·L^-1＞0.05 mg·L^-1。在试验中，氧化乐果浓度在染毒早期(0~10 d)对蝌蚪体长、体质量的生长无滞育作用(F=1.44，P＞0.05；F=1.29，P＞0.05)；当染毒到15 d时，氧化乐果浓度在0~0.02 mg·L^-1蝌蚪的体长和体质量变化不明显(F=1.68，P＞0.05；F=1.55，P＞0.05)，随着染毒浓度的增加，蝌蚪的体长和体质量出现停滞，各浓度染毒组之间差异有统计学意义(F=2.16，P＜0.05；F=3.04，P＜0.01)(表 1)。

对各生长指标的增长率与氧化乐果浓度作相关分析，结果表明，红瘰疣螈蝌蚪各个生长指标的增长率与氧化乐果浓度呈显著负相关(表 2)。

3 讨论

众所周知，两栖类动物人工繁殖快，生长周期短，易于培养和观察，其胚胎发育过程对水环境的化学污染物敏感，作为水体有害物质及水质监测的指示生物被广泛应用(周景明等，2006)。目前，对两栖类的毒性影响研究主要集中在无尾两栖类(李贞等，2010)，有尾两栖类的毒性影响与无尾两栖类之间是否存在差异，还有待进一步研究。

3.1 红瘰疣螈发育过程对氧化乐果耐受差

试验中红瘰疣螈蝌蚪安全浓度为0.05 mg·L^-1，低于胚胎期处理浓度，这是因为胚胎发育过程在卵胶膜内进行，卵胶膜能有效阻止毒物进入，而蝌蚪期的个体直接浸泡在毒物中，其安全浓度较胚胎期低。与无尾两栖类相比，红瘰疣螈蝌蚪期的安全浓度也低于中华蟾蜍(6.5 mg·L^-1)(张明旺等，2013)，这可能与红瘰疣螈长期生活在无污染的山涧中有关。

3.2 氧化乐果对红瘰疣螈胚胎及蝌蚪的影响

氧化乐果对红瘰疣螈胚胎具有明显的致畸、致死作用，影响主要发生在出膜期和开口期，其余各期受毒性影响不明显，随着氧化乐果浓度的升高，红瘰疣螈胚胎的畸形率和死亡率逐渐升高，这与其他两栖类研究结果一致(汪学英等，2001)。

氧化乐果对红瘰疣螈蝌蚪的生长具有非常显著的抑制作用，其影响主要表现在10 d以后。随着氧化乐果浓度增大和处理时间延长，蝌蚪的体质量和体长均出现负生长，可能与处理时间延长、毒物在蝌蚪体内富集有关。

在安全浓度内，低浓度(0.03 mg·L^-1)的氧化乐果对红瘰疣螈蝌蚪的生长有一定的促进作用，而高浓度(＞0.03 mg·L^-1)对蝌蚪的生长发育有明显的滞育作用。这与中华蟾蜍的毒性实验(尹晓辉，2008；张明旺等，2013)的研究结果一致，可能与蝌蚪在低浓度农药下能产生一定的应激反应，加强了抵抗力有关。

总之，氧化乐果对红瘰疣螈胚胎具有明显的致畸、致死作用，滥用氧化乐果农药可能导致红瘰疣螈生长发育异常，建议农业生产中尽量科学合理使用。