近年来，随着我国工厂化和集约化水产养殖的快速发展，水环境污染状况日趋严重。在各类环境污染物中，重金属由于其遗传毒性、持久性和不可降解性而备受关注(Wang et al., 2013)。Cu²⁺是甲壳动物体内必需的微量营养素，参与了多种生理过程，如血蓝蛋白的合成、酶功能和组织完整性等(Bharadwaj et al., 2014)。但是高浓度的Cu²⁺亦会对甲壳动物产生毒害作用(Santos et al., 2000；Valavanidis & Vlachogianni，2012)。在生产实践中，Cu²⁺作为矿物营养素、除藻剂或病原抑制药物被广泛应用于水产养殖领域，其中的Cu²⁺沉淀积累在池塘中，对生态环境构成了极大的威胁(Liao et al., 2006)。据报道，在我国珠江口地区Cu²⁺的浓度处于污染水平，并具有一定的潜在生物毒性(Wang et al., 2015)。研究表明，Cu²⁺胁迫影响了对虾的体色(Martínez et al., 2014)、存活和繁殖(Rao & Anjaneyulu，2008)，造成鳃和肝胰腺的组织损伤(Frías-Espericueta et al., 2008)，增加了对病菌的易感性，降低其免疫功能(Yeh et al., 2004)。当虾类处于胁迫状态时，其血细胞中的细胞凋亡率、活性氧(ROS)含量、一氧化氮(NO)含量和酯酶活性都会发生改变(Xian et al., 2010, 2013；Guo et al., 2013；郭慧等，2015)，因此可根据这些指标的变化来判断机体的免疫状态。Caspase-3是细胞凋亡关键的执行分子，在凋亡信号传导途径中发挥主导功能，α2巨球蛋白(α-2M)被认为参与了虾类的先天性免疫，而目前关于Cu²⁺胁迫下罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii血细胞参数和caspase-3以及α-2M基因表达量的研究尚未见报道。因此，本文拟采用流式细胞术和实时荧光定量PCR的方法，研究Cu²⁺胁迫对罗氏沼虾血细胞中细胞凋亡率、ROS含量、NO含量、酯酶活性以及caspase-3和α-2M基因表达量的影响，为进一步探究Cu²⁺胁迫对虾类毒性效应提供参考。

罗氏沼虾，又名大头虾、马来西亚大虾，是目前世界上养殖量最大的三大虾种之一，也是我国重要的经济甲壳动物，在水生态系统中分布较为广泛，江河、湖泊等淡水和河口半咸水水域中均有分布，对水环境中各种理化性质的变化反应较灵敏(吴维福等, 2014)。因此，开展重金属Cu²⁺对罗氏沼虾毒性效应的研究具有重要的实践意义，为水环境毒理学和生态风险评价的研究奠定理论基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验用罗氏沼虾购自湛江某养殖场，体质量为10.89 g± 1.42 g，性成熟，非繁殖期。选取大小均匀、体色正常、附肢完整、活力强、无病患且处于蜕皮间期的个体用于实验。将罗氏沼虾在实验室循环水系统中暂养于温度为26 ℃±2 ℃的淡水中2周，所有水质指标均符合《渔业水质标准》的要求(国家海洋局，1989)，暂养及胁迫实验期间24 h不间断充氧。暂养期间每日06: 00和18: 00按虾体质量的2%投喂2次，胁迫实验前24 h停止喂食。

2'，7'-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)、DAF-FM DA购自Sigma公司；二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA)、Annexin V FITC/PI(碘化丙啶)凋亡检测试剂盒、总RNA提取试剂Trizol、琼脂糖购自Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit、rTaq PCR试剂盒、焦炭酸二乙酯(DEPC)、DL2000 Ladder Marker、荧光定量试剂盒(SYBR Green QPCR Super Mix-UDG)购自TaKaRa公司；核酸染料EB替代物、PCR Premix Taq、DNA ladder、6×loading buffer购自东盛公司；其他试剂均为国产分析纯，所用引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 胁迫实验

实验设对照组和胁迫组，每组3个重复。根据前人研究(Chen & Wang，2001；Mahmood et al., 2009)及预实验结果，设置理论胁迫浓度为0(对照组)、100 μg·L^-1(胁迫组)，用硫酸铜配置Cu²⁺溶液。将罗氏沼虾置于塑料箱中，每桶25尾，胁迫组加入180 L硫酸铜溶液。每24 h换水50%。分别在胁迫后的0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h从每桶中随机选取3尾(n=9) 罗氏沼虾，参照Guo等(2015)的方法收集血淋巴。

1.3 血细胞悬液的制备

用2 mL的一次性注射器吸取冰上预冷的抗凝剂(葡萄糖20.5 g·L^-1，柠檬酸钠8 g·L^-1，氯化钠4.2 g·L^-1，调pH至7.5) 200 μL，然后从虾的围心腔抽取等量的血淋巴至1.5 mL离心管中，取200 μL用预冷的抗凝剂稀释血细胞浓度约为1×10⁶个/mL，用于流式细胞术指标的检测；余下的血淋巴在800 g、4 ℃离心10 min，弃上清，将血细胞重悬于Trizol中，-80 ℃保存，用于基因表达量分析。

1.4 流式细胞仪及参数设置

实验所用流式细胞仪为美国BD (Becton Dickinson)公司生产的FACSVerse，数据获取和分析软件为Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)。每个样品均获取10 000个细胞。异硫氰酸荧光素(FITC)、FDA、DCF、DAF用绿色荧光通道(第一荧光通道，FL1) 获取荧光数据。PI检测用第二荧光通道(FL2) 获取荧光数据。

1.5 血细胞凋亡率

参照冼健安等(2015)的方法，以Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测血细胞的凋亡率。取200 μL血细胞悬液，加入2.5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI工作液，轻轻震荡混匀，避光染色15 min后加入50 μL 5×Annexin V结合缓冲液，200目筛网过滤后立即上机检测。结果以Annexin V-FITC和PI双参数散点图显示，设门划分细胞类群：活细胞(Annexin V-FITC-/PI-)位于左下象限，前期凋亡细胞(Annexin V-FITC+/PI-)位于右下象限，后期凋亡细胞和死细胞(Annexin V-FITC+/PI+)位于右上象限。从样品制备到上样的整个过程应控制在30 min以内，以避免血细胞离体时间过长对结果造成不良影响。

1.6 ROS含量的测定

以DCFH-DA为标记探针检测ROS含量。取200 μL血细胞悬液，加入DCFH-DA工作液10 μL，混匀后避光孵育30 min，200目筛网过滤后上机检测。

1.7 NO含量测定

以DAF-FM DA为标记探针检测NO含量。取血细胞悬液200 μL，加入10 μM的DAF-FM DA工作液，混匀后避光孵育60 min，200目筛网过滤后上机检测。

1.8 酯酶活性

采用非特异脂溶性底物FDA进行酯酶活性测定。取血细胞悬液200 μL，加入5 μM FDA，混匀后避光孵育30 min，用200目筛网过滤后上机检测。

1.9 基因表达

血细胞总RNA的提取参照Trizol (Invitrogen)说明书进行，cDNA的合成按照TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒说明书进行。引物序列均来自美国国家生物技术信息中心(National center for Biotechnology Information，NCBI)数据库，利用Premier Primer 5.0设计引物。引物序列如表 1所示。荧光定量PCR使用TaKaRa公司的SYBR Premix EX Taq试剂盒，按说明书操作。荧光定量PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火60 s，40个循环。在PCR反应过程中，设计用灭菌超纯水代替cDNA模板的阴性对照，每个样品至少设置3个重复。扩增结束后启动熔解曲线收集程序，根据熔解曲线的温度判断扩增过程的特异性并对扩增曲线进行分析。所得数据以ABI 7500 SDS进行分析，以β-actin作为内参，根据目的基因和β-actin的Ct值用2^-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量(Guo et al., 2015)。

1.10 统计分析

数据用SPSS 18.0进行配对t检验，统计结果均表示为平均值±标准差(Mean±SD)，P＜0.05为差异有统计学意义。用Pearson分析ROS和NO含量与血细胞凋亡率之间的相关性。

2 结果 2.1 血细胞凋亡率

在胁迫后的3 h，Cu²⁺对血细胞凋亡率无显著影响，在胁迫后的6~48 h，血细胞凋亡显著升高，在48 h时达到39.01%，是对照组的5.38倍(图 1)。

2.2 ROS含量

ROS含量的变化趋势和血细胞凋亡率较为一致(图 2)，在胁迫后的3 h，ROS含量无显著变化(P＞0.05)，在胁迫后的6~48 h，ROS的含量显著升高(P＜0.05)，在48 h由对照组的86.32上升到106.31。

2.3 NO含量

Cu²⁺对罗氏沼虾血细胞中NO含量的影响如图 3所示，在胁迫的3 h，NO含量变化不显著(P＞0.05)，在胁迫后的6~48 h，NO含量持续增加，并与对照组有显著性差异(P＜0.05)，最高值出现在48 h，为126.08。

2.4 酯酶活性

酯酶活性在胁迫后的3~48 h都呈显著下降的趋势(P＜0.05)，最低值出现在48 h，由对照组的117.78下降到88.40(图 4)。

2.5 ROS含量与血细胞凋亡率的相关性

在胁迫48 h后，ROS含量与血细胞凋亡率呈显著正相关(P＜0.001)，Pearson相关性系数为0.83(图 5)。

2.6 NO含量与血细胞凋亡率的相关性

在胁迫48 h后，NO含量与血细胞凋亡率呈显著正相关(P＜0.001)，Pearson相关性系数为0.93(图 6)。

2.7 caspase-3相对基因表达量

在胁迫后的3 h，Cu²⁺对罗氏沼虾caspase-3的相对基因表达量无影响，在胁迫后的6~48 h，caspase-3的相对基因表达量均显著增加(P＜0.05)，并在24 h达到最高值，由对照组的1.01增加到1.56(图 7)。

2.8 α-2M相对基因表达量

在胁迫后的0~6 h，Cu²⁺对罗氏沼虾α-2M基因表达量无影响，在胁迫后的12 h，α-2M基因的表达量显著升高(P＜0.05) 并达到峰值，24 h时有短暂的降低，但与对照组相比仍有显著增加的趋势(P＜0.05)，在48 h，α-2M基因的表达量显著降低(P＜0.05)(图 8)。

3 讨论

血细胞在甲壳动物的免疫功能中起着举足轻重的作用(Havanapan et al., 2016)，血细胞参数和血细胞凋亡率是评价机体免疫、生理状态和细胞过程的重要指标(Xian et al., 2010；Silva-Aciare et al., 2013)，血细胞的损伤会降低免疫功能，甚至会威胁虾类的生存(Lorenzon et al., 1999；Xian et al., 2010)。据报道，受温度(Chang et al., 2009)、亚硝酸盐(Guo et al., 2013)和脂多糖(Xian et al., 2013)等非生物因素刺激时，凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei和斑节对虾Penaeus monodon的血细胞凋亡率均显著增加。本文的研究也发现，在受到Cu²⁺胁迫时，罗氏沼虾的血细胞凋亡率也显著增加，说明当虾类受到各种环境因子胁迫时，可诱导血细胞发生凋亡。

ROS是一类高活性的化学物质，参与了细胞存活、生长、增殖和分化，并在先天性免疫防御机制中发挥重要作用(Yang et al., 2013)，正常情况下ROS的产生与消除处于平衡状态。当机体受到外界刺激或病菌感染时，细胞会行使功能吞噬外来物，在行使吞噬功能的过程中，细胞还会产生一些有毒物质(如ROS)抑制或杀死外来物。而持续不断的刺激会使ROS含量迅速上升，打破了机体内ROS含量的平衡，过高的ROS含量对细胞自身造成伤害，甚至导致细胞凋亡(Gill & Tuteja，2010)。NO是一种广泛存在于各组织器官中的重要信使分子，能维持体内微循环内环境恒定和保护机体非特异性免疫功能(汪义军，1997)。研究表明，ROS和NO具有协同作用，共同调控应答胁迫反应的基因表达(Scheler et al., 2013)。NO和ROS都具有双重的生理效应，低浓度的NO和ROS可以抑制细胞凋亡，对机体是有益的，而高浓度的ROS和NO会对机体产生严重的伤害，诱导细胞凋亡的发生(Simon et al., 2000；Brown，2010)。本研究相关性分析结果显示，ROS、NO和血细胞凋亡率的Pearson相关性系数分别为0.83和0.93，进一步验证了ROS和NO会诱导细胞发生凋亡。

酯酶是一种广泛存在于各种细胞内的水解酶，与外源性物质的消除和降解有关，虽然并不直接参与重金属的解毒，但酯酶系统的状态反映了机体抵抗外界不良环境的能力(Zvereva et al., 2003)。因此，酯酶是毒理学领域具有重要意义的一种酶(Rashid et al., 2013)，在农业生产中，被用作检测药物残留的“指示器”(Begum et al., 2008)，也用于检测细胞活性。当细胞的酯酶活性下降时，被认为是细胞活性下降，会导致细胞凋亡(郭慧等，2015)。研究表明，斑节对虾在受到Cd²⁺刺激时，血细胞中的酯酶活性显著降低(Xian et al., 2014)。本研究也发现，在受到Cu²⁺胁迫时，罗氏沼虾血细胞的酯酶活性也被显著抑制。在胁迫3 h后，酯酶的活力开始显著降低，至48 h时，由对照组的117.78显著下降到88.40。酯酶活性的降低与ROS、NO和细胞凋亡率的升高大体一致。郭慧等(2015)对亚硝酸盐胁迫下凡纳滨对虾的血细胞毒性研究发现，酯酶活性在24 h才开始显著降低，这可能与胁迫因子和实验对象不同有关。

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导途径中发挥主导功能，因此，细胞或组织中Caspase-3的活性是检测细胞是否发生凋亡的重要方法(Zvereva et al., 2003)。对caspase-3进行RNA干扰以后，对虾的死亡率显著降低(Rijiravanich et al., 2008)，说明caspase-3在细胞凋亡中有着举足轻重的作用。本研究发现，在Cu²⁺胁迫的12 h、24 h和48 h，caspase-3的表达量均显著升高，24 h达到峰值后在48 h略降低，caspase-3的这种表达模式与低温胁迫下凡纳滨对虾血细胞中caspase-3的表达模式类似，即都在表达高峰后出现轻微降低，但与对照组相比仍有显著差异(Chang et al., 2009)。caspase-3表达量的显著升高在12 h出现，而ROS和NO的显著升高是在6 h，推测是ROS和NO的升高诱导了caspase-3的表达。

α-2M是一种在无脊椎动物中参与宿主防御机制的非特异性蛋白酶抑制剂(Shanthi & Vaseeharan，2014)，在抑制和清除有害蛋白酶的过程中发挥重要作用(Gonias，1992)。据报道，罗氏沼虾、保罗美对虾Farfantepenaeus paulensis和印度明对虾Fenneropenaeus indicus在注射细菌、真菌和病毒后，血细胞中α-2M的表达量被显著诱导，认为α-2M与虾类的先天免疫有关(Ho et al., 2009；Perazzolo et al., 2011；Shanthi & Vaseeharan，2014)。本研究发现，在Cu²⁺胁迫下，α-2M的表达量发生了显著变化，推测甲壳动物的α-2M表达模式不仅可以被微生物和病毒调控，还会受到重金属胁迫的影响。α-2M的表达量在12 h和24 h时显著上升，并在24 h达到峰值，在48 h又显著下降，推测在Cu²⁺胁迫早期，血细胞中的α-2M被激活参与到机体的免疫反应中，在胁迫48 h时，血细胞中的NO和ROS含量以及血细胞的凋亡比例都达到最高值，此时机体的免疫功能显著降低，因此α-2M的表达量也受到显著抑制。

综上所述，在Cu²⁺胁迫下，机体的酯酶活性受到显著抑制，免疫功能受到影响，机体通过诱导NO和ROS的产生以及免疫相关基因α-2M的表达来对抗Cu²⁺胁迫带来的损伤。随着胁迫时间的延长，过高浓度的NO和ROS对机体自身造成了氧化损伤，诱导了凋亡相关基因caspase-3的表达，导致细胞凋亡的发生，说明Cu²⁺对虾类具有免疫抑制性和毒性。相关性分析表明，NO和ROS的升高可能是细胞凋亡的主要诱因。