猪副伤寒(swine paratyphoid)即猪沙门氏菌病(swine salmonellosis)是由沙门氏菌属细菌引起的一种传染病。该病除了单独感染外，还往往与猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒等病毒性疾病或其他细菌性疾病混合感染，使得发病率与死亡率升高，给养猪业造成了重大的经济损失，而且会严重威胁人类的健康(佐藤静夫，1992)。食品动物尤其猪是沙门氏菌的主要宿主，而且大部分人类感染沙门氏菌的原因是由于人类接触或食用了被沙门氏菌污染的动物性食品，因此沙门氏菌具有重要的公共卫生意义(Ribot et al., 2002)。由于养殖业长期不合理的用药，导致了沙门氏菌多重耐药性的产生。耐药菌株可能从农场流向餐桌，使人类感染耐药沙门氏菌，最终导致使用抗菌药物治疗失败(Barza，2002)。所以动物体内沙门氏菌的携带率和菌株的耐药性与人类健康密切相关。 岳秀英等:四川省猪源沙门氏菌及耐药性变迁调查

我国是世界养猪大国，四川是生猪生产大省，历年生猪出栏和猪肉产量均居全国首位，是全国生猪核心生产区和重要的猪肉供应基地，承担着国家“菜篮子”工程的重要任务，因此必须对猪沙门氏菌病引起足够的关注。对于该地区动物源沙门氏菌的耐药性监测已经开始进行，这些报道主要涉及到了肉品生产链的下游如猪肉来源的沙门氏菌(周佳等，2011；邹立扣等，2012)，关于生产链上游如猪源沙门氏菌的耐药性报道很少，尤其是缺乏近几年猪源沙门氏菌的耐药性变迁数据。因此，本研究收集了2009年至2014年四川省主要的养殖场猪来源的沙门氏菌，调查了这些菌株对临床常用抗菌药物的敏感性，分析了菌株耐药率及多重耐药的年代变迁情况，从而为临床合理用药提供科学依据，进一步保障四川养猪业的健康发展、畜产品质量安全和人类公共卫生安全。 1 材料与方法 1.1 菌株

德尔卑沙门氏菌Salmonella derby ATCC6960，鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium ATCC13311及大肠杆菌Escherichia coli ATCC25922购自美国菌种保藏中心(ATCC)。 1.2 培养基及生化试剂

缓冲蛋白胨水(BPW)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、四硫磺酸盐增菌液(TTB)、MH肉汤、MH琼脂均购自北京陆桥技术有限责任公司；沙门氏菌科玛嘉显色培养基购于郑州博赛生物技术股份有限公司；革兰氏阴性菌鉴定试剂卡(GN)购于法国梅里埃生物技术有限公司。沙门氏菌抗血清购于宁波天润生物药业有限公司。 1.3 主要仪器和设备

微量可调加样器购自德国Eppendorf公司；生物安全柜购自东联哈尔仪器制造有限公司；PCR仪购自成都百乐科技有限公司；Vitek 2 Compact 30高级全自动微生物鉴定/药敏仪购自法国梅里埃生物技术有限公司。 1.4 药品

本研究所选取的受试药物如下：氨苄西林(AMP)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、头孢噻呋(CEF)、庆大霉素(GEN)、大观霉素(SPE)、四环素(TET)、多西环素(DOX)、氟苯尼考(FFC)、磺胺异噁唑(SIZ)、复方新诺明(SXT)、恩诺沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、多粘菌素E(CL)等抗生素标准品购于中国兽医药品监察所。 1.5 菌株的分离与鉴定

菌株分离样品来源于2009—2014年，从四川省各地(成都市金堂县和双流县、乐山市犍为县、资阳市雁江区、遂宁市船山区、宜宾市长宁县、南充市高坪区、德阳市罗江县、眉山市苏坡镇)的主要育肥猪养殖场采集的2660份肛拭子样本(用无菌棉签擦拭猪肛门内部)。样品置于运送培养基内低温环境中(约4 ℃)立即送至实验室进行沙门氏菌的分离鉴定。将肛拭子放入3 mL的BPW中，37 ℃温箱内培养2 h后，每份样品分别吸取300 μL经前增菌的BPW放入3 mL的SC肉汤中和3 mL的TTB肉汤中，37 ℃培养18~24 h。用接种环沾取一环选择性增菌后的菌液，三区划线在科玛嘉显色培养基上，37 ℃培养24~42 h。挑取沙门氏菌疑似菌落进行生化和PCR鉴定。 1.6 菌株的鉴定

PCR鉴定：采用水煮法粗提菌体DNA作为PCR反应体系中的模板。根据GenBank M90846鼠伤寒沙门氏菌invA基因序列设计引物，上游为：invA-F：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’，下游为：invA-R：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，扩增目的片段大小为284 bp。PCR扩增反应体系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12 μL，ddH₂O 10 μL，上、下游引物各2 μL，模板1 μL。以沙门氏菌标准株ATCC13311为阳性对照，以大肠杆菌ATCC25922作为阴性对照。反应条件为95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环;最后72 ℃延伸10 min，同时设立阴性和阳性对照。

生化鉴定：使用Vitek 2 Compact 30高级全自动微生物鉴定仪对所有invA检测为阳性的菌株进行生化鉴定。用灭菌棉签沾取适量培养18~24 h的菌苔至3 mL 0.45%NaCl溶液中，配成0.5~0.63 Mac单位的菌悬液，将恢复至室温的Vitek GN鉴定卡上的弯管插入配制好的菌悬液中，置于真空填充孔中进行自动填充，然后将已经填充好的卡片置于鉴定仪进行仪器自动读卡和打印结果，主要生化指标鉴定结果见表 1。

参照国标-沙门氏菌检验(GB/T 4789.4-2008)的玻片凝集法进行鉴定，德尔卑沙门氏菌ATCC6960，鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311作为阳性对照，根据Kauffmann-White抗原表判定沙门氏菌的血清型。 1.8 抗菌药物敏感性试验

按美国临床实验室标准委员会(Clinical and Laboratory St and ards Institute，CLSI)推荐的微量肉汤稀释法进行。对所有沙门氏菌进行13种临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)测定。大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。结果判定参照CLSI文件VET01-S2(2013)和M100-S24(2014)标准。CLSI没有规定多粘菌素E对于沙门氏菌的判定标准，采用8 μg/mL作为耐药临界值便于统计。 2 结果 2.1 沙门氏菌的PCR鉴定结果

沙门氏菌疑似菌株经科玛嘉显色琼脂培养后，菌落形态为紫色、淡紫色，边缘光滑。挑选疑似菌株检测invA基因，结果共得到151株阳性菌株。部分菌株的电泳结果如图 1所示，与沙门氏菌标准菌株ATCC13311的电泳结果相比，所有阳性菌株在284 bp的位置处扩增出了特异性条带，而阴性对照ATCC25922则没有扩增出相应条带。将目的PCR产物经过测序公司测序后与GenBank中的核酸序列比对，与鼠伤寒沙门氏菌invA 基因(GenBank序列号：M90846)的同源性达到了99%以上。 2.2 沙门氏菌的生化鉴定结果及分离率

Vitek 2 Compact的GN鉴定卡共有62项生化指标，其中对沙门氏菌的鉴定指标有47项，根据这些生化指标的反应结果与Vitek 2菌种数据库比对最终得到细菌的种属。所有invA 基因检测为阳性的菌株经过Vitek 2 Compact 30微生物仪鉴定后，结果有151株细菌被鉴定为沙门氏菌，鉴定结果的可信度达到了89%~99%，如表 1所示临床沙门氏菌菌株的生化鉴定结果，它被鉴定为猪沙门氏菌的可信度达到了95%，鉴定结果良好。综合PCR和生化鉴定结果，2660份样本中分离出151株沙门氏菌，总检出率为5.68%，不同年份沙门氏菌的分离鉴定情况如表 2所示。从表中数据可以看出，2009—2014年，猪源沙门氏菌的分离率随年份呈动态平稳趋势。

图 1 沙门氏菌invA基因PCR检测的电泳图 Fig. 1 Detection of invA gene by PCR amplification M. Marker(DL2000)，阳. 阳性质控ATCC13311，阴. 阴性质控ATCC25922，1~10. 临床分离阳性株； 11.临床分离阴性株。 M. Marker(DL2000)，Positive. Positive control ATCC13311； Negative. Negative control ATCC25922； 1~10. Positive clinical isolates; 11. Negative clinical isolate.

图选项

151株沙门氏菌除9株粗糙型不能分型以外，剩余142株共鉴定出16种血清型。占主导的血清型是德尔卑沙门氏菌，有91株(60.26%)，其次为鼠伤寒 沙门氏菌，有25株(16.56%)，再次为罗森沙门氏菌S. rissen，有10株(6.6%)。 2.4 药敏试验结果 2.4.1 沙门氏菌分离株的耐药情况

13种抗菌药物敏感性试验的结果见表 3。从整体上来说，沙门氏菌对四环素、氨苄西林、大观霉素、阿莫西林/克拉维酸、磺胺异噁唑和复方新诺明6种药物的耐药率最高，分别为95.4%、94.7%、93.4%、92.7%、91.4%和90.1%，其次为恩诺沙星(86.8%)、氧氟沙星(74.8%)、庆大霉素(70.2%)、多西环素(66.2%)、氟苯尼考(65.6%)。对头孢噻呋(35.1%)和多粘菌素E(10.6%)的耐药率相对较低。分析猪源沙门氏菌对不同抗菌药物的耐药率随年份的变化趋势如表 2所示，2009—2014年猪源沙门氏菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、大观霉素、四环素、磺胺异噁唑和复方新诺明6种药物的耐药率维持较高的平稳动态趋势(>90%)，对头孢噻呋、庆大霉素、多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星、氧氟沙星和多粘菌素E这7种药物的耐药率随年份推移基本呈上升趋势，尤其对头孢噻呋和多粘菌素E的耐药率上升显著。头孢噻呋在2010—2011年间耐药率上升明显，多粘菌素在2012—2013年间耐药率上升明显(图 2)。

图 2 2009—2014年猪源沙门氏菌对13种药物的耐药率变迁图 Fig. 2 The trend of resistance rate of pig Salmonella against 13 antimicrobials during 2009 to 2014

图选项

2009—2014年间，多重耐药菌株(耐药数≥3)比例维持在较高水平(>94%)，且不同年份的菌株多重耐药数差别较大，2009年以7耐、11耐为主(59%)，但已经出现了12耐的菌株；2010年以11耐为主(60%)，但已经出现了13耐的菌株，2011年、2012年以12耐为主(73%、53%)，2013年、2014年以13耐为主(37%、31%)。从总体上看，2009—2014年4耐以下的菌株比例先下降后升高，而11耐以上的菌株比例呈上升趋势(表 4)。

对抗菌药物耐药谱型分析，共有23种耐药谱型，其中包括18种多重耐药谱型(耐药数≥3)。这些多重耐药谱的种类复杂，且不同年份菌株显示出不尽相同的耐药谱(图 2)，2009年分离菌株的多重耐药谱种类最为丰富，为9种，2011年多重耐药谱种类最简单，为4种。各个年份主要流行的多重耐药谱型如表 3所示，2013年和2014年菌株以13耐的全耐药谱型为主，2011年、2012年的菌株都以12耐的AMP-AMC-CEF-TET-DOX-SIZ-SXT-ENR-OFL-SPE-GEN-FFC谱型为主，2009年、2010年菌株以11耐的AMP-AMC-TET-DOX-SIZ-SXT-ENR-OFL-SPE-GEN-FFC谱型为主。有些多重耐药谱型在各个年份都有检出，如9耐的AMP-AMC-TET-SIZ-SXT-ENR-OFL-SPE-GEN谱型在2012年、2013年和2014年中都存在，以上占主导的12耐谱型在2009—2014年的每个年份中都存在，且其在2012年分离菌株的比例达到了最高的53%(9/17)。 3 讨论

本研究从2009—2014年四川地区的主要养猪场采集的2660份猪肛拭子样本中，共分离到151株沙门氏菌，总检出率为5.68%，其中2009年检出率最高，为5.9%，2012年检出率最低，为4.5%，这一结果比张玮等(2010)报道的安徽规模猪场健康猪沙门氏菌的分离率(6.11%)偏低，远远低于黄福标等(2012)报道的广西南宁市生猪屠宰场沙门氏菌的分离率(34.35%)。分析原因，可能是不同年龄阶段的猪中沙门氏菌携带率有所差异，本研究中采集样本的对象主要是育肥猪，该年龄段的猪相对于生长期的猪来说抵抗力较强，同时猪场又经过了较长时期的净化和消毒措施，因此沙门氏菌的检出率较低，提示在猪场进行严格的卫生管理和净化淘汰机制，有助于降低沙门氏菌的感染率。

本次调查中共检测到16种沙门氏菌血清型，占主导的血清型是德尔卑沙门氏菌(60.26%)，其次为鼠伤寒沙门氏菌(16.56%)，再次为罗森沙门氏菌(6.6%)。该结果与余玮(2005)报道的安徽地区主要流行的猪源沙门氏菌血清型相同。杨保伟等(2010)对2007—2008年陕西部分零售畜禽肉沙门氏菌血清型和基因型调查结果显示猪肉分离的沙门氏菌中德尔卑沙门氏菌(36.8%)占主导地位，本实验结果与之相近。该血清型在这些地区的流行是对公共卫生的一个巨大威胁。国内其他地区主要流行的猪源沙门氏菌血清型与之不同，如华中为鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌(贾爱卿，2006)，说明不同地区占主导的猪源沙门氏菌血清型有所差异。德尔卑沙门氏菌是沙门氏菌常见的血清型之一，它在我国食品中广泛分布，成为食源性疾患的重要隐患(吕素玲等，2012)，由德尔卑沙门氏菌引起的食源性疾病在国内屡见报道(郑华英等，2003；李燕俊等，2005；邱亚群等，2010)。

本研究中的沙门氏菌对四环素、氨苄西林、大观霉素、阿莫西林/克拉维酸、磺胺异噁唑和复方新诺明6种高度耐药(耐药率大于90%)，对恩诺沙星、氧氟沙星、庆大霉素、多西环素、氟苯尼考5种药物耐药率大于60%，对头孢噻呋(35.1%)和多粘菌素E(10.6%)的耐药率相对较低。该耐药水平普遍高于欧洲地区动物源沙门氏菌的耐药水平(Bywater et al., 2004)，而与国内某些报道中沙门氏菌的耐药水平相当(陈玲，2008；Lai et al., 2014)。同时不同省份不同动物源沙门氏菌也呈现出了各自的耐药特点(李郁等，2008)，这与当地的动物用药情况相关。青霉素类和磺胺类药物作为早期治疗猪沙门氏菌病的药物一直在兽医临床上使用，因此国内的猪源沙门氏菌对该类药物耐药率普遍偏高。国外虽然没有批准多粘菌素用于兽医临床，但在国内多粘菌素E可用来治疗动物肠道感染或用于促生长作用，因此动物源沙门氏菌对该种药物的敏感性也开始下降。随着四川养猪业规模化程度提高，饲养数量及密度的增加，该研究结果提示在治疗四川地区猪源沙门氏菌感染时，应避免选择四环素类、磺胺类和青霉素类，而选择相对敏感的药物，才能取得良好的治疗效果。

通过分析2009—2014年猪源沙门氏菌对抗菌药物的耐药性变迁，发现这些菌株对β-内酰胺类、头孢类、氨基糖苷类、氯霉素类、四环素类、氟喹诺酮类、磺胺类以及多粘菌素类下属的13种药物耐药率随年份推移呈现升高趋势，对β-内酰胺类、四环素类和磺胺类则一直保持较高的耐药率。以上药物在国内兽医临床上广泛应用于治疗或预防动物细菌性疾病，它们耐药率的上升充分说明细菌的形成和发展与抗菌药物长期反复使用有着极为密切的关系。虽然这些菌株的多重耐药率增加趋势不明显，但是多重耐药程度更加严重，这与最近几十年抗菌药物的选择性压力持续升高有关。周佳等(2011)试验表明具有多重耐药性的菌株为97.37%(74/76)，有66种耐药谱，本实验的多重耐药谱与之相近。在本研究中，发现某些多重耐药谱在多个年份中普遍存在。多重耐药菌株在抗菌药物的选择性压力下相对于敏感株具有生存优势，可能是这些菌株广泛存在的主要原因。而关于这些菌株耐药性的传播方式——质粒水平转移或是菌株克隆转播，则有待进一步深入研究。

鉴于本研究的结果及沙门氏菌的公共卫生意义，多重耐药沙门氏菌通过食物链传递给人导致人类抗生素治疗失败的风险不容忽略。因此，亟需加强四川省养猪业抗菌药物的合理应用，遏制沙门氏菌耐药性的不断发展，最终保障消费者健康。