《大熊猫谱系》显示在圈养条件下，1963—1990年国内外大熊猫共产仔74胎115仔，其中包括1个三胞胎、39个双胞胎，多胞胎的比例占产仔胎数的54%，但却从未同时成功养活过双胞胎或三胞胎幼仔，被母兽遗弃的幼仔难以在人工条件下养育成活。通过长期探索，人们逐渐发现大熊猫初乳对幼仔存活具有至关重要的作用。因此，怎样让大熊猫双胞胎幼仔同时吃上初乳成为亟待解决的问题。成都大熊猫繁育研究基地在这一问题上进行了长期艰苦探索，于1990年终于在大熊猫双胞胎哺育技术上取得了历史性突破。研究人员采用在一定时间内互换幼仔到母兽处吃奶的方法，让2只幼仔都吃上初乳(Nancy，2002)，这对提高大熊猫幼仔成活率起到了关键性推动作用。数据统计显示，双胞胎的育幼成活率从1990年前的19.8%上升到2003年的63.4%，从而使整个圈养种群的成活率从33.9%增长到66.9%(侯蓉等，2006)。从1990年到现在的20来年，大熊猫双胞胎的存活率不断提高，如今保持在95%以上。实践证明，养育成活的大熊猫双胞胎幼仔与单胎幼仔相比在生长、发育、繁殖能力上并无显著差异，所以双胞胎存活率的提高直接促进了整个圈养大熊猫种群繁殖效率的提高。然而，与大熊猫双胞胎发生的相关因素并不清楚，甚至于在生产实践过程中，人们只能根据经验推断影响双胞胎发生的因素。本文根据长期积累的大量数据，通过科学的数理统计方法，从年龄、胎次、妊娠天数、配种次数与方式、雌激素等方面综合分析研究大熊猫双胞胎的发生机制以及与之相关的各因素，一方面为大熊猫双胞胎进一步的理论研究打下基础，另一方面对大熊猫繁殖的生产实践活动提供指导。 王海瑞等:大熊猫双胞胎发生相关因素的分析研究 1 材料与方法 1.1 年龄与胎次对大熊猫双胎发生的影响

数据来源：以大熊猫谱系图中的数据为基础，统计分析大熊猫母兽产仔时的年龄、胎次和产仔数量记录完整的个体，剔除母兽出生年度不详的个体，共计276胎415仔。

分析方法：计算每个年龄段、每个胎次大熊猫的双胎率，用SPSS软件的卡方检验对各个年龄段、各个胎次的双胎率进行差异比较。 1.2 妊娠天数与大熊猫双胎发生的关系

数据来源：成都大熊猫繁育研究基地大熊猫产85胎幼仔的配种记录，其中单胎42胎，双胎43胎。

分析方法：妊娠期是从授精开始到分娩为止的一段时间，是新生命在母体内生活的时期。由于大熊猫物种资源珍贵，一年仅发情一次，所以在大熊猫配种工作中常采用多次配种，有的多达10次，配种时间也持续几天，因此妊娠期的起始不易判断。在大熊猫发情期内，会对大熊猫尿液中的雌激素进行实时监控，大熊猫的第一次配种时间与排卵时间较为接近，因此，本试验在统计妊娠期时以开始配种的第一天作为妊娠期计算起点，以产下第一仔的当天作为计算妊娠期的终点。结果采用SPSS的t检验处理。 1.3 配种次数与方式对大熊猫双胎发生的影响 1.3.1 配种次数对双胎发生的影响

数据来源：成都大熊猫繁育研究基地大熊猫产87胎幼仔的配种记录。将自然交配与人工授精的配种总次数做为分析对象。

分析方法：用SPSS的卡方检验分析双胎率与配种次数之间的关系。 1.3.2 配种方式对双胎发生的影响

数据来源：大熊猫谱系图和配种记录。根据大熊猫谱系图和部分配种记录记载，大熊猫平均胎产仔数为1.48仔。1999年之前，在圈养条件下大熊猫的繁殖是通过自然交配完成，1999年之后主要是自然授精和人工授精两种繁殖方式配合完成，少数由单纯的人工授精完成。本次统计将配种方式分为3种：自然交配、人工授精，以及由自然交配和人工授精相结合的混合配种方式。

分析方法：用SPSS的卡方检验分析这3种配种方式与双胎率之间的关系，用SPSS的多重比较方法分析这3种配种方式的胎产仔数之间的差异。 1.4 雌激素与大熊猫双胎发生之间的关系

雌激素检测方法：雌激素检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行。将酶标板用雌激素抗体进行包被，将尿样进行等倍稀释，并与雌激素-3-硫酸盐标准品一起加入到已用雌激素抗体包被的96孔酶标板中。然后在每一孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体 0.05 mL。室温下孵育2 h后加入0.1 mL底液ABTS，根据显色发生的快慢决定孵育时间，30~60 min后用酶标仪读取光吸收值(450 nm，参考波长540 nm)。

数据来源：本试验将10只产仔大熊猫作为分析对象，其中5只产单胎，5只产双胎。

分析方法：本研究将雌激素峰值的排尿时间记为0 h，将每5 h以内的雌激素值取平均数，在峰值之前的排尿时间记为负值，之后的记为正值。将雌激素水平在-130 h至+25 h之间的雌激素水平进行比较分析。采用SPSS的单变量双因素方差分析对结果进行处理，并将产单胎与产双胎两组的雌激素峰值水平用t检验进行比较分析。 2 试验结果 2.1 年龄与胎次对大熊猫双胎发生的影响

由图 1可知，雌性大熊猫在7岁、8岁、9岁、11岁时的双胎率处于较高水平，均保持在60%以上，但是经过卡方检验，不同年龄阶段的双胎发生率的差别无统计学意义(χ²=18.318，P=0.193>0.05)。由图 2可知，雌性大熊猫在第5胎时的双胎率为75%，处于最高水平，卡方检验结果显示，不同胎次的双胎发生率的差别具有统计学意义(χ²=16.487，P=0.021<0.05)。

图 1 不同年龄大熊猫的双胎率变化情况 Fig. 1 Twin rate at different ages of giant p and as

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图 2 大熊猫不同胎次的双胎率变化情况 Fig. 2 Twin rate of different parities of giant p and as

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图 3 大熊猫产单胎与产双胎的妊娠天数分布图 Fig. 3 The gestation length of conceiving singleton and twins of giant p and as

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由表 1可知，产单胎的大熊猫平均妊娠天数为142.33 d，产双胎的平均妊娠天数为131.63 d，t检验结果显示产单胎的妊娠天数显著大于产双胎的(P＜0.05)。此外，产双胎的妊娠天数的标准差25.10 d也大于产单胎的21.03 d。

对不同配种次数的双胎率进行卡方检验，χ²=10.645，P=0.100>0.05，因此配种次数对双胎率的影响不显著。

不同配种方式的双胎率经过卡方检验，χ²=7.043，P=0.030<0.05，表明不同配种方式对双胎率的影响显著。将3种配种方式的胎产仔数进行多重比较后，混合配种方式的胎产仔数最高，为1.62只±0.49只，显著高于自然交配的胎产仔数1.41只±0.50只(P<0.05)。人工授精组的胎产仔数最低为1.37只±0.50只，但是由于样本量较少，与其他两组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。 2.4 雌激素水平与双胎发生的关系

SPSS分析结果显示产单胎组与产双胎组之间在-130 h~+25 h内组间差异有高度统计学意义(P<0.001)。产双胎的雌激素水平在这段时间之内显著高于产单胎的雌激素水平。将2组在0 h的峰值进行t检验分析，结果产双胎的雌激素峰值水平为221.82 ng/mg±36.14 ng/mg，极显著高于产单胎的雌激素峰值水平143.33 ng/mg±16.95 ng/mg(P=0.002<0.01)。 3 讨论 3.1 年龄与胎次对双胎率的影响

目前，关于年龄、胎次与胎产仔数之间关系的相关报道可见于奶牛(Cady & van Vleck，1978；Silva et al., 2007)、老鼠(Nygrén & Kojola，1997)以及其他动物。母牛在年龄大的胎产仔数大于年轻者，原因可能是年长者在排卵期更易排出双卵，此外，年轻的母牛即使怀上双胎，怀孕后的流产率也高于年长者(Cady & van Vleck，1978)。在本研究中，7~9岁和第5胎次的雌性大熊猫双胎率较高，并且相对集中。原因可能是在这个阶段大熊猫各项生理指标均处于“最佳状态”，繁殖力在这个阶段也处于峰值，并且大熊猫的妊娠天数较短，幼仔在母体内的发育时间只有160 d左右(Zhang et al., 2009)，出生时发育不全，怀双胞胎的大熊猫发生流产的几率很小，因此不会出现牛当中的现象。年龄大的雌性大熊猫在怀双胞胎后均能正常分娩，年龄对双胎率的影响不显著。 3.2 妊娠天数与大熊猫双胎发生的关系

本研究所统计产85胎幼仔的大熊猫的平均妊娠天数为136.92 d±23.66 d，与黄炎(2001)报道的25胎大熊猫的平均妊娠天数140.3 d±20.5 d相近，但目前还未有关于产单胎与产双胎的妊娠天数之间差异的报道。

由表 1可知，产单胎的大熊猫平均妊娠天数为142.33 d，显著高于产双胎的131.63 d(P＜0.05)。产双胎大熊猫的胎儿需要汲取更多的营养，使子宫和机体负担相对较重，当母体不能供给足够营养时，机体会产生分娩机制，因此，产双胎大熊猫的妊娠期相对产单胎的大熊猫短，这与其他哺乳动物类似(常仲乐，2003)。但不同的是，大熊猫妊娠期的变化范围远远大于其他动物，在所统计的85胎中，妊娠期最小值为85 d，最大值为201 d，前后相差116 d，这可能与大熊猫胚胎的延迟着床有关。延迟着床是指早期胚胎在形成后并不立即着床，而在子宫内漂浮游离较长一段时间。在此期间，早期胚胎停止发育，当身体内某种机制启动以后，游离的胚胎开始在子宫内着床，并开始生长分化形成胎儿。大熊猫的胚胎延迟现象被Hodges和Bevan(1984)通过孕激素的检测得到证实，近年又被Zhang等(2009)通过B超检测证实。在本试验所统计的对象中，产双胎大熊猫妊娠天数标准差大于产单胎的，最大值和最小值均出现在产双胎的大熊猫中，因此两者的延迟着床可能存在着不同的机制，双胎的延迟着床比单胎的更为明显。 3.3 配种次数与配种方式对大熊猫双胎发生的影响

图 4显示的配种次数对双胎率的影响是不显著的，即双胎率不会随着配种次数的增加而增高。这个结果对大熊猫的繁育生产有重要的意义。在生产上，为了确保大熊猫成功配种受孕，往往对其进行多次配种，有的长达一星期。大熊猫在接受人工授精时必须要麻醉，很多报道显示麻醉对胚胎的发育、妊娠率、配种率、生殖内分泌等有影响(Abdel-Rahman & Ismail，2000；Ben-Shlomo et al., 2000)，这对大熊猫的繁殖健康存在潜在危险。如何准确把握大熊猫的排卵时间是今后科研工作的研究方向，不能为了使其成功受孕而一味地进行多次配种。

图 4 大熊猫双胎率随配种次数的变化 Fig. 4 Twin rate of different mating times of giant p and as

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大熊猫的自然交配与人工授精各有优缺点。自然交配的优点主要体现在能够给母兽提供质量最佳的精液，但是自然交配的时间主要还是人为安排，如果雄性与雌性大熊猫还未到交配的最佳时机或者双方中的任何一方没有交配意愿就有可能互相攻击，此外还有可能出现雄性与雌性大熊猫在自然交配时只有交配行为而没有射精的情况。大熊猫的人工授精技术在1999年后逐渐完善和成熟，且伴随着产仔率的提高，该技术在大熊猫的繁殖配种工作中得到越来越广泛地应用。此外，我们采用了雌激素和孕激素结合判断的方法来监测大熊猫发情，大大提高了判断其发情排卵时间的准确性，进而提高了人工授精的产仔率和双胎率，但人工授精输入的精液尤其是冻精质量不够理想，也会降低产仔率。表 2的统计结果显示了混合配种方式利用了两者的优点，其双胎率显著高于自然交配。

在本研究中，大熊猫双胎组在发情高峰的雌激素浓度显著高于单胎组，这与在其他动物上的分析具有一致性。在牛中，卵泡发育阶段不同的优势卵泡数量所检测的促卵泡激素、促黄体生成素和雌激素的水平均有显著的差异(Lopez et al., 2005)。Ginther等(2000)也认为在卵泡发育的早期，雌激素水平可以反映初级卵泡发育成为优势卵泡的数量，并且雌激素水平上升的时间与卵泡发育的时间非常接近。

然而，另外一些研究显示在发情期(Knox et al., 2003)和黄体期(Hunter et al., 1993)内不同的排卵率与雌激素浓度没有明显的联系(Knox et al., 2003)。Knox等(2003)认为这种不同研究间的冲突性结果是由于采样间隔造成的，由于雌激素在发情高峰时变化幅度很大，如果采样间隔过大，那么雌激素的真峰值将不会被检测到，从而导致结果分析的误差。本研究结果也进一步证实了这种情况。

大熊猫雌激素水平在发情期呈现“缓升快降”的变化，尤其在峰值附近雌激素水平会“骤升骤降”(喻述容，2003)，因此如何判断第0小时的峰值成为本试验分析结果的关键。若所测得峰值的时间与前后2次的检测时间相隔越长，则峰值的时间越不准确。反之，如果在峰值附近尿液检测样品的密度越大，峰值的时间就越准确。2007—2009年，成都大熊猫繁育研究基地共有18只大熊猫产仔，分析其在-130 h至+25 h的雌激素水平后发现产单胎与产双胎两组间差异无统计学意义，雌激素峰值差异无统计学意义。分析峰值前后的样品密度后，发现其中有8只雌激素的峰值水平前后相隔时间超过5 h，有的甚至超过十几小时。显然，这些所测得的峰值水平不能代表真正的峰值。本试验所选取的10胎，其雌激素峰值前后的相隔时间均小于5 h，产单胎的相隔时间为3.185 h±0.817 h，产双胎的为2.667 h±1.342 h。所分析的结果(图 5)显示产单胎与产双胎两组之间的差异有高度统计学意义，并且雌激素峰值间的差异也有高度统计学意义。本试验所分析的结果对临床生产实践中判断大熊猫排卵时间也具有指导意义。目前在大熊猫繁殖配种工作中，雌激素峰值出现的时间对于人工授精的最佳时机具有重要的指示作用，本研究的分析结果显示为了获得更为接近的雌激素峰值的时间，在发情高峰期，雌性大熊猫尿液样品的收集最好控制在每5 h收集一次，这样所检测的峰值水平才能代表雌激素分泌的最高水平。

图 5 大熊猫在发情高峰尿液中的雌激素水平变化图 Fig. 5 The estrogen concentration in giant p and as urine during heat period

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