黄颡鱼受精卵由湖南省岳阳市华容县田家湖渔业科技有限公司惠赠，受精后立即用黄泥脱粘放入孵化桶中;恒温孵化，孵化温度25 ℃±0.5 ℃，pH7.4左右。 1.2 主要试剂

乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液、0.01 mol·L^-1磷酸盐缓冲液(PBS)、Harris苏木素染液购自广州晶泉生物有限公司，牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司。鱼卵孵化酶一抗由上海佑隆生物科技有限公司合成，免疫组化试剂盒DAB显色剂、兔抗通用二抗购自DAKO公司。其他常见试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。 1.2.1 鱼卵孵化酶HCE一抗制备方法

根据日本青鳉鱼蛋白质序列(序列号:NP_1098293.1)设计3条多肽，序列分别为:LLEGDLVAPTNRNA、TPYDYSSIMHYGRD、GEEGVEEGDEDDFV;将偶联后的多肽-BSA与等体积的福氏佐剂、YOULONG佐剂混合乳化均匀，成油包水状态;皮下免疫新西兰大白兔，经酶联免疫吸咐实验(ELISA)检测，抗血清滴度要求不低于1∶50 000;免疫后采集兔血清，将收集到的抗血清进行纯化，得到鱼卵孵化酶HCE兔多克隆抗体。 1.3 实验方法 1.3.1 鱼卵采集与切片

分别在受精后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时取黄颡鱼鱼卵，用蒸馏水清洗并吸干水分后，迅速将鱼卵放入4%多聚甲醛溶液中，固定24 h后，转移至75%酒精中保存。将固定好的鱼卵经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度为5 μm，粘附于3-氨丙基三乙氧硅烷(APES)粘片剂处理的玻片上，放在40 ℃烘箱中烘干2 h后，放在玻片盒中备用。 1.3.2 免疫组织化学染色

(1)石蜡切片脱蜡至水，用PBS缓冲液(0.01 mol·L^-1，pH7.4)冲洗3次，每次3 min。(2)将组织切片置于盛满EDTA 抗原修复缓冲液(pH9.0)的修复盒中置于微波炉内进行抗原修复。中火8 min，停火8 min，转中低火7 min，在此过程中防止缓冲液过度蒸发。自然冷却后将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5 min。(3)将切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。(4)将切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加用5%BSA按1∶100比例稀释过的一抗覆盖组织，切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。(5)玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加二抗(辣根过氧化物酶标记)覆盖组织，室温孵育50 min。(6)将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB 显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。(7)Harris苏木素复染3 min左右，用自来水冲洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。(8)将切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同。 1.4 光密度分析

在NIKON倒置显微镜下观察切片，每组鱼卵随机挑选2张，在400倍视野下进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片背景光一致。使用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(integrated option density，IOD)。 1.5 数据的统计学分析

用Excel统计数据、SPSS 16.0统计学软件进行方差分析，以P＜0.01(差异具有高度统计学意义)，0.01＜P＜0.05(差异具有统计学意义)，P＞0.05(差异无统计学意义)作为判断标准，数据表示为平均值±标准差(Mean±SD)。 2 结果与分析 2.1 黄颡鱼鱼卵中孵化酶的免疫组织化学定位

免疫组织化学切片结果见图版Ⅰ。黄颡鱼鱼卵孵化酶HCE阳性颗粒呈棕黄色，在各时间点均有明显分布;主要分布在鱼卵外胚层及卵膜内层上，分布较均匀。阴性对照组没有观察到阳性颗粒。

图版Ⅰ 免疫组化检测黄颡鱼鱼卵中HCE的表达(×400) PlateⅠ Expression of HCE in egg of Pelteobagrus fulvidraco by immunohistochemisty method(×400) A. 受精后0 h，B. 受精后1 h，C. 受精后2 h，D. 受精后4 h，E. 受精后8 h，F. 受精后12 h，G. 受精后24 h，H. 阴性对照; ■.卵黄颗粒，▲.卵黄膜内层。 A. 0 h post-fertilization，B. 1 h post-fertilization，C. 2 h post-fertilization，D. 4 h post-fertilization，E. 8 h post-fertilization，F. 12 h post-fertilization，G. 24 h post-fertilization，H. negative control; ■. yolk granules，▲. inside vitelline envelope.

图选项

各孵化时间点的黄颡鱼鱼卵孵化酶(HCE)总光密度略有不同，但差异无统计学意义(表 1)。

表 1 不同孵化时间点孵化酶(HCE)的总光密度(Mean±SD) Table 1 Integrated option density of hatching enzyme(HCE)on different hatching times(Mean±SD)

表选项

目前国内外对于鱼卵孵化酶的研究已有报道，但对于我国常见的、经济价值较高的养殖鱼类孵化酶的研究报道较少，主要在河川沙塘鳢、雌核发育银鲫中发现了孵化酶存在(刘军等，2003，胡先成等，2007)。本实验采用免疫组织化学方法证明了黄颡鱼中也有孵化酶的存在，弥补了对我国主要淡水养殖鱼类孵化酶定位和分布研究的不足。

与逆转录PCR(reverse transcripition PCR，RT-PCR)、快速克隆cDNA末端DNA PCR(rapid amplification of cDNA ends PCR，RACE-PCR)等方法相比，免疫组织化学方法能够体现出目的抗原在组织中的分布情况并进行半定量分析，而且避免了从mRNA到蛋白质合成环节中间诸多因素可能产生的影响(周爱玲等，2014)。然而当前对鱼类孵化酶少量的研究主要停留在基因表达方面，运用免疫组织化学方法对鱼类孵化酶的研究尚未见报道。因此，本研究选用免疫组织化学方法研究孵化酶在不同发育时期黄颡鱼胚胎中的定位和分布，试图揭示黄颡鱼鱼卵中孵化酶的表达情况。

鱼卵孵化酶是一种由胚体的外胚层性或内胚层性的孵化腺细胞所分泌的蛋白分解酶，目前的研究表明:它是一种金属蛋白酶，其酶活性可被 EDTA、邻二氮杂菲、碘乙酸等强烈抑制，在30 ℃左右最稳定，最适pH在8.0~8.5之间，具有嗜盐性(樊廷俊，史振平，2002)。鱼卵孵化酶的主要作用是溶解卵膜，并配合胚胎自身扭动，使胚胎能够从卵膜内孵化出来。目前国外已有研究证明在青鳉(Yasumasu et al.，1989a，1989b)、斑马鱼(Sano & Denuce，2008)、虹鳟(Hagenmaier，1974)、白斑狗鱼(Schoots et al.，1981)等硬骨鱼类中有孵化酶存在。其中，对日本青鳉鱼孵化酶生化特性及分子生物学特性的研究最为深入。从日本青鳉鱼的孵化液中分离出2种蛋白酶:HCE和LCE。HCE通过蛋白裂解活动使完整卵膜发生膨胀，当卵膜最大程度地膨胀后，HCE对卵膜的裂解速率急剧下降，此时膨胀后的卵膜内层就成为 LCE 的底物。而LCE 仅能消化已膨胀的卵膜，并不能消化完整的卵膜内层。这表明对卵膜的完全消化是 HCE和LCE 共同作用的结果(Yasumasu et al.，1989a，1989b)。由于HCE首先在鱼卵孵化过程中开始裂解卵膜，因此本实验用HCE一抗来检测黄颡鱼鱼卵中孵化酶的定位与分布情况。

通过葡聚糖-G-100柱层析法对泥鳅孵化液进行分离纯化，并对层析得到的组分作体外消化卵膜实验，鉴定获得泥鳅的孵化酶(梁宇君，2003)。通过实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)方法证明在河川沙塘鳢胚胎中存在孵化酶，并且发现其在不同的发育阶段表达量不同。从受精卵期到眼晶体形成期的早期发育阶段，HCE基因 mRNA 的表达量较低，在眼黑色素形成期，其表达量达到最大值;随后HCE基因 mRNA 的表达量逐渐降低(罗颖，2010)。利用抑制性差减杂交结合SMART cDNA合成和RACE-PCR技术，共克隆得到雌核发育银鲫4种孵化酶基因的全长cDNA。序列分析表明，4种孵化酶基因cDNA开放阅读框均为795 bp，编码265个氨基酸，进化地位处于日本鳗鲡孵化酶和青鳉孵化酶之间，从尾芽期到幼苗期都检测到表达(刘军等，2003)。本实验证实了在黄颡鱼鱼卵中同样存在孵化酶，在受精期、卵裂期、囊胚期、原肠期、出膜前期等不同发育时期均有表达，但相对表达量在不同时期没有明显变化趋势。这表明，在鱼卵受精期直到出膜前期已有孵化酶被分泌出来并开始作用于卵膜。

据报道，孵化酶是导致鱼卵流水孵化过程中早脱膜现象的重要因素之一。由于鱼卵进入孵化池的时间先后不一，导致先放进孵化池的鱼卵分泌出来的孵化酶溶解了后放进孵化池的鱼卵的卵膜，导致鱼卵提前脱膜。这样早脱膜的鱼苗由于尚未发育成熟，畸形率很高，往往在脱膜后几天内大批量死亡，给鱼苗的人工繁殖造成了巨大的经济损失(唐文联，2000;张奇等，2005)。因此研究鱼卵孵化酶的理化性质及时空分布规律对于预防因鱼卵孵化酶而引起的早脱膜现象具有非常重要的指导意义。

综上所述，虽然本研究证明黄颡鱼鱼卵中存在孵化酶，但目前有关黄颡鱼等其他我国主要淡水养殖鱼类孵化酶的研究较少，对于孵化酶在鱼卵中的时空分布规律及其在鱼卵孵化过程中的作用机制还需要进一步探究。本研究为深入研究黄颡鱼鱼卵孵化酶的生物学特性和生理功能等奠定了一定的理论基础。