生态免疫学(Ecoimmunology)是20世纪90年代逐渐兴起的一门交叉学科，重点研究生态学背景下动物免疫功能发生改变的原因和结果(Sheldon & Verhulst，1996；张志强，王德华，2005)。经过近20年的发展，以免疫为中心，其理论体系和技术手段逐渐成熟，促进了种群动态、生活史进化和寄主-寄生虫之间的相互作用等领域的研究进展(Martin et al., 2011；Brock et al., 2014)。与免疫学家只关注模型动物(如小鼠、大鼠)的免疫系统不同，生态免疫学家更强调自然条件下野生动物免疫功能的变化，以及这种变化与其他生理活动和生活史进化之间的关系。从实验室到野外研究，面临着更多不确定性因素，发展简单实用、稳定性好、易于操作的野外免疫学技术，一直是生态免疫学学科建立以来的努力目标(Boughton et al., 2011；Demas et al., 2011)，也是促进生态免疫学向纵深发展的源动力之一(Sheldon & Verhulst，1996；张志强，王德华，2005；Martin et al., 2011；Brock et al., 2014)。本文以脊椎动物为例，简述了脊椎动物免疫系统的构成，结合本人已有的实验室和野外工作经验及当前的研究进展，介绍了当前生态学研究中使用较广的免疫学参数(含天然免疫、细胞介导的免疫和体液免疫)在野外应用中的优缺点和注意事项。 1 脊椎动物免疫系统的组成概述

脊椎动物的免疫系统是抵御外来刺激的有效屏障，执行区分自身和非自身的功能。尽管脊椎动物免疫系统的组成有差别，但从免疫机制上划分，均可分为天然免疫和获得性(或适应性)免疫，后者又包括细胞介导的免疫和体液免疫(Demas et al., 2011)。

一般来说，天然免疫应答比获得性免疫应答要快，是非特异性的、先天就有的应答，是防御病原体入侵的第一道防线，如身体的解剖学屏障(黏膜、皮肤)、体内的常居菌(非病原菌)、体液因子(溶菌酶、补体和其他的急相蛋白)和细胞应答(嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等类型的吞噬细胞，由嗜碱性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞所产生的炎症介质，以及自然杀伤细胞)等(Demas et al., 2011)。获得性免疫应答通常较慢，是当机体与外来侵害物接触之后才获得的免疫特性，对起诱发作用的抗原有特异性，需激活针对特定病原体的应答后，才可作为后续的防线来起作用(Demas et al., 2011)。 2 动物生态学研究中应用较广的免疫学指标及其优缺点分析

鉴于免疫系统组成的复杂性，野外条件下究竟采用何种免疫学测定方法，除有必要全面理解其免疫应答反应或此反应的生物学意义外，还需要确定寄生感染的种类及由此所导致的免疫能力变化是否真实地反映了寄主对寄生物的反应(Boughton et al., 2011)。Demas等(2011)建议，尽管免疫学技术发展迅速，新的免疫学测定方法不断涌现，但在野外选择免疫学测定方法时，仍应重点考虑以下3个问题：1)所选的免疫学参数应为一套组合，能涵盖免疫的主要组分(天然免疫、细胞介导的免疫和体液免疫)；2)无需提供针对特定物种的昂贵试剂和抗体，且此类技术也可用于非模式动物；3)这些技术不但适用于实验室研究，当遇到重捕或个体麻醉等问题时，也应适用于野外研究。 2.1 形态学和组织学测量方法 2.1.1 淋巴器官的重量

淋巴器官，如脾脏、胸腺或腔上囊(鸟类)的相对大小，可作为判断脊椎动物免疫系统健康状况的初步信息(John，1994；Nelson & Demas，1996；Martin et al., 2008)；尽管对鸟类的研究表明，脾脏大小与免疫功能的强弱表现为正相关关系(Smith & Hunt，2004)，但将其作为判断免疫功能高低的标准仍需谨慎，因在其他脊椎动物中尚无脾脏大小与免疫功能显著相关的实验证据(张志强，王德华，2006；Demas et al., 2011；金晨晨等，2014)。测量脾脏的重量仅需简单的手术器械和精确度为千分之一的电子天平即可完成，可在野外或实验室内进行；测定胸腺的重量，因其质量远小于脾脏，一般需要精确度为万分之一的电子天平。无论哪一种免疫器官，在野外均可用固定剂(如中性甲醛、多聚甲醛或波恩氏液)进行固定处理，运回实验室经石蜡包埋后可长久保存，为将来的组织学或组织化学分析做准备。这种方法的不足之处是：1)必须处死动物；2)对结果的解释有局限性，需依赖后续的组织学观察来定量。 2.1.2 血液学参数

血液学测量主要指通过血液中细胞种类、数量和成分的变化来估测动物体的免疫功能。测定的指标包括：红细胞数量、白细胞数量、白细胞分类和红细胞压积，以及白细胞计数及嗜异性粒细胞与淋巴细胞的比值等(Davis et al., 2008；Demas et al., 2011)。这些指标应用较广，常见于动物生态学研究，尤以白细胞计数最为普遍。计数各型白细胞的方法多样，包括血涂片、血液分析仪和流式细胞仪等。血涂片需要载盖玻片、蒸馏水和瑞氏吉姆萨试剂，价格便宜；若在野外使用，也有商品化的快速瑞氏吉姆萨试剂盒出售，配以纯净水，即可完成相关操作。血涂片通常通过计数100个成熟的白细胞，并根据细胞的形状、细胞质的内容物和颜色来区分嗜异性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。血液分析仪和流式细胞仪目前主要应用于哺乳动物，价格较昂贵，且必须经过培训后才可完成；非哺乳动物因为具有有核的红细胞，细胞的分型较为困难。若能获得动物的血液样本，血涂片和血液分析仪对试剂的选择均无特定的依赖性，可用于大多数物种的研究，从一份血液样本中即可同时收集多方面的有效信息，如白细胞的浓度和组成、血液寄生虫的感染状态及是否贫血等。然而，血液学分析仅代表了天然免疫或获得性免疫简单的、总的测量。在感染、受伤或致敏状态下，有机体的白细胞数量都会升高。因此，在实验处理过程中，包括感染状态在内，应确保所有的受试动物都处于同一外部或内部应激物的刺激之下。如能在实验处理前、处理期间和处理后，连续测定白细胞数量的变化，则不失为更好的实验方案(Demas et al., 2011)。对小型哺乳动物来说，通过尾尖、眼眶静脉丛或颈静脉，均可进行连续多次的微量采血，但这些方法需要多次训练后才能较为熟练地掌握。 2.2 天然免疫

测定动物天然免疫的方法较多，包括抗菌肽、补体蛋白的定量、溶血性补体、自然杀伤细胞毒性、杀菌能力测定和巨噬细胞的吞噬能力等。杀菌能力测定(bacterial killing assay，BKA)是在体外测量新鲜全血杀死细菌能力的一种方法(Millet et al., 2007)，需要10 μL血清、培养皿和恒温箱，操作需在无菌的层流罩内完成，所需的大肠杆菌冻干粉和细菌培养用试剂均已商品化，可通过购买获得。金晨晨(2014)曾对中华蟾蜍Bufo gargarizans对大肠杆菌Escherichia coli杀菌能力的季节变化进行过测定分析。 BKA对样品的保存时间有要求。虽然可以使用冻融后的血清或血浆样品来代替全血，但在采集后数小时或数天内使用效果最好。血浆样品被反复冻融或较长时间贮存(超过20 d)，杀菌能力将显著降低(Liebl & Martin，2009)。需要强调的是，物种的杀菌能力可随实验条件或生活史背景而变化，为了确定血清或血浆及菌株的最适稀释浓度，必须做预实验(Demas et al., 2011)。计算杀菌能力的方法有2种：经典的方法为经平板培养细菌后通过人工计数来计算菌落数，进而估测血液样品的杀菌能力；另一种方法为通过分光光度计对细菌菌株进行定量，此种方法可靠性更好，且所需的样品量较少(Liebl & Martin，2009)。通过BKA可估测有机体消除急性病原体的能力，在功能上更与寄主的免疫功能相关。 2.3 获得性免疫

获得性免疫的测定方法包括体外淋巴细胞增殖和迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity，DTH)。尽管淋巴细胞增殖是一种重要的免疫学分析方法，但需在离体、无菌的条件下，并在获得细胞或血样的24 h内进行实验，通常要求备有贮存活细胞的介质；同时，尽管在某种实验条件下免疫细胞可能增殖多或少，但较多的增殖并不代表对病原体具有较大的破坏能力，体外淋巴细胞增殖情况并不能等值反映动物体免疫功能的变化，这使得这项技术难以在野外推广使用(Demas et al., 2011)。 植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)和2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitro-1-fluorobenzene，DNFB)(Dhabhar，1998；Bilbo & Nelson，2003)是最为常见的用于诱导产生DTH反应的抗原(Demas et al., 2011)。2种抗原都作为T细胞的丝裂原起作用，均来源于红肾豆Phaseolus vulgaris。与DNFB相比，PHA广泛应用于两栖动物(Brown et al., 2011)、爬行动物(Finger et al., 2013)、鸟类(Smits et al., 1999)和哺乳动物(Gouy de Bellocq et al., 2006；张志强等，2011)。外源注射PHA将导致注射部位T细胞的增殖，肿胀总量大体上与免疫应答的强度相当，更多的肿胀等价于巨噬细胞和淋巴细胞的浸润和增殖。这种初始的反应伴随着T细胞的增殖，再次暴露将比初次暴露产生更强的反应(Tella et al., 2008)。然而，关于PHA反应的确切机制，目前仍有争论，它除参与细胞介导的免疫反应外，也可能与天然免疫(Tella et al., 2008；Turmelle et al., 2010；Brown et al., 2011)和免疫记忆能力有关(Finger et al., 2013)。建议使用具感应能力的数显卡尺(0.01 mm)来测定PHA注射前后皮肤组织的增厚程度，这样可尽量减少测量中的人为误差；微量进样器(50 μL)也是必备的工具之一，其精确度高于注射器。PHA的反应强度表示为注射部位皮肤厚度的改变或注射部位的肿胀程度，所以必须测量基准值或对照部位的厚度。在DTH研究中，有2种有效的对照方法：第一种是先测量拟注射部位抗原注射前的基准厚度；第二种是在整个研究过程中，以对侧的厚度作为对照(Martin et al., 2006a)。DTH反应具有反应快速、操作简单和不需要特定的抗体等优点，适用于大多数物种的室内研究，也有在野外测量成功的例子(Brown et al., 2011)。 2.4 体液免疫-总的Ig水平和抗原刺激

脊椎动物中，可产生抗体反应的常见抗原包括匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin，KLH)、白喉破伤风毒素和绵羊红血细胞(Nelson & Demas，1996；Hanssen et al., 2004)等。此外，在生态学背景下，动物也可能与相关的病原体(如肺炎和疟疾)发生相互作用，或被特定疾病的定量抗体所攻击(Demas et al., 2011)。

KLH是一种来源于火山透火螺Megathura crenulata的软体动物抗体，与脊椎动物的亲缘关系较远，在注射后第5 d和第10 d，血清中的IgM和IgG值分别达到最高值。通过酶联免疫吸咐测定方法(ELISA)和酶标仪可测定这2种免疫球蛋白的含量(Demas et al., 1997；张志强，王德华，2006)。KLH抗原刺激需要注射备选抗原，整个反应过程需10 d以上，且在中间需重复采血一次，适用于实验室研究。若在野外执行，需保证动物易于重捕。经低温(-20 ℃)冷冻处理后的血清样品，长时间的保存对实验结果的影响也不大。

除了本文所介绍的免疫学参数外，一些学者还发展了整合性测量免疫功能的手段，包括细胞因子谱(cytokine profiles)、伤口愈合、发热/疾病反应和传染病模型等(Boughton et al., 2011；Demas et al., 2011)。此外，对各种较为成熟的技术手段，在www.ecoimmunology.org的网站上均有较为详细的操作步骤，感兴趣的读者可自行查阅。 3 脊椎动物免疫学参数间的复杂关系

经验数据表明，未经免疫刺激处理或经外源刺激处理的脊椎动物，反映其本底(非诱导型)水平免疫功能的多种免疫学参数都展示出了不同的季节或年变化模式(Lochmiller et al., 1994；Nelson & Demas，1996；张志强，王德华，2006；Martin et al., 2008；Hegemann et al., 2012，2013)。在生活史理论框架下，受资源分配的限制，某一种或多种免疫指标的下降并不等同于免疫功能的降低，因为免疫系统的其他组分此时可能会升高。某一类免疫应答的下降可能会由免疫细胞的再次分配来补偿，或者通过某一未知的免疫路径来上调，这需要在相近的时间内同时测量多个免疫指标(张志强，王德华，2005；Buehler et al., 2011；Demas et al., 2011)，同时需用外源的刺激来处理目标动物(Martin et al., 2006a，2006b，2008；Pedersen & Babayan，2011)。

早期研究表明，脊椎动物中辅助性T细胞(helper T cells，Th)的Th₁和Th₂之间有明显的权衡关系存在，其中Th₁主要介导细胞免疫，而Th₂主要调节体液免疫(Mosmann & Coffman，1989)。对雌性白足树 Peromyscus leucopus的研究发现，预先暴露的伤口对细胞介导的免疫反应有阻碍作用，而细胞介导的免疫活动的诱导则会改变伤口的愈合速度(Martin et al., 2006b)。限食情况下，红腹滨鹬Calidris canutus的获得性免疫功能维持稳定，不受食物条件的影响，但为了维持能量摄入，耐受限食处理的红腹滨鹬的急性期反应受到了抑制，同时产热能力下调(Buehler et al., 2009)。经内毒素处理后，云雀Alauda arvensis的10项免疫学指标中6项受内毒素的影响，即裂解度和嗜异性粒细胞的比例增加，但珠蛋白含量、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的比例下降，但5年内上述指标均无年际波动，说明针对某种类型的免疫反应，免疫系统其他部分的反应也是复杂的(Hegemann et al., 2013)。 4 结语及展望

免疫学方法介入动物生态学研究，为动物生理生态学和生活史进化研究提供了新的思路和途径。实验室受控条件下，继续寻找和筛选适用于野外研究的免疫学指标体系，仍是一项艰巨的任务，新的技术手段仍有待发掘，多种免疫学参数的有效性尚需确证。受所研究的目标动物的物种特异性和野外操作条件的限制，在生态学背景下，结合全球变暖和食物可利用性等因素的变化来研究免疫系统内部各参数之间的权衡关系，多层次和全面地对免疫学指标体系进行选择仍是筛选适用“靶标”的必由之路。