棕黑锦蛇Elaphe schrenckii、赤峰锦蛇E. anomala和王锦蛇E. carinata是重要的大型经济蛇类，已成为我国人工驯养繁殖的主要无毒蛇，但相关研究很少，养殖状态下的血液学指标等尚未见报道。为此，本研究对实验室养殖的3种锦蛇血细胞参数进行了观测，旨在揭示处于相同生理状态下3种锦蛇的血细胞参数及其差异，丰富爬行类血液学和比较细胞学数据，为蛇类健康状态评估和疾病诊断提供正常血液学参考值。张冰等： 养殖条件下3种锦蛇血细胞比较研究 1 材料与方法 1.1 实验材料

2013年10月人工孵化并饲养2年以上的棕黑锦蛇、赤峰锦蛇和王锦蛇健康个体各6条，雌雄各半。其中棕黑锦蛇体质量628.65 g±117.75 g，体长121 cm±5 cm；赤峰锦蛇体质量490.48 g±97.56 g，体长114.75 cm±5.32 cm；王锦蛇体质量548.30 g±179.11 g，体长113.73 cm±11.22 cm。1.2 实验方法

血液样本在2013年10月23—27日之间(蛇冬眠前)集中采集。以适量的乙醚在干燥器中将蛇麻醉，尾静脉采血。制作血涂片，瑞氏染液(Wrights staining)染色，利用OLYMPUS BH5显微镜观察血细胞形态和测量，并进行白细胞分类计数。利用Neubauer血球计数板进行红细胞和白细胞计数。血细胞测量和计数方法参考Stacy等(2011)的方法。红细胞及胞核大小计算公式：红细胞大小=(π×红细胞长径×红细胞短径)/4，红细胞核大小=(π×红细胞核长径×红细胞核短径)/4(Sevinc et al.，2000；Gul & Tosunoglu，2011；Arikan & Cicek，2014)。利用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，统计值用平均值±标准差表示，设置P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有高度统计学意义。 2 结果2.1 血细胞形态

3种蛇的血细胞均可区分出红细胞、白细胞和血栓细胞；其中白细胞可分为5种，分别是淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。 2.1.1 红细胞

3种蛇的成熟红细胞均呈椭圆形，胞质呈均匀的橙红色，有些红细胞胞质中可见斑块状的淡染区；细胞核多呈椭圆形、深蓝色，分布于细胞中央(图 1)；也可见少量红细胞胞核呈不规则形状，其中赤峰锦蛇不规则核数量最多，达18.72%(图 1：E~F)。在血涂片中常能观察到未成熟红细胞，其较成熟红细胞大而圆，细胞质呈粉红色，细胞核呈蓝紫色。棕黑锦蛇的未成熟红细胞数量最多，约为其红细胞总数的10.88%(图 1：A)。另外，在血涂片中能观察到个别正在进行无丝分裂的红细胞(图 1：E)。

图 1 3种锦蛇的血细胞显微形态 Fig. 1 Microscopic photography of blood cells of three ratsnakesA~D. 棕黑锦蛇的血细胞，E~H. 赤峰锦蛇的血细胞，I~K. 王锦蛇的血细胞。 a. 嗜酸性粒细胞，b. 嗜碱性粒细胞，bl. 大淋巴细胞，de. 无丝分裂红细胞，e. 红细胞，ie. 未成熟红细胞，m. 单核细胞，n. 嗜中性粒细胞，sl. 小淋巴细胞，t. 血栓细胞。 A~D. blood cells of Elaphe schrenckii，E~H. blood cells of E. anomala，I~K. blood cells of E. carinata. a. acidophil leucocyte，b. basophil leucoccyte，bl. large lymphocyte，de. erythrocyte in amotosis，e. erythrocyte，ie. immature erythrocyte，m. monocyte，n. neutrophile leucocyte，sl. small lymphocyte，t. thrombocyte.

图选项

红细胞长径(表 1)依次为王锦蛇>棕黑锦蛇>赤峰锦蛇，王锦蛇和棕黑锦蛇之间差异无统计学意义，王锦蛇和赤峰锦蛇之间差异有高度统计学意义，棕黑锦蛇和赤峰锦蛇之间差异有统计学意义；红细胞短径依次为王锦蛇>赤峰锦蛇>棕黑锦蛇，王锦蛇和赤峰锦蛇之间差异无统计学意义，而棕黑锦蛇与王锦蛇、赤峰锦蛇之间差异均有高度统计学意义。红细胞长、短径比值依次为棕黑锦蛇>王锦蛇>赤峰锦蛇，棕黑锦蛇和赤峰锦蛇、王锦蛇之间的差异均有高度统计学意义，而赤峰锦蛇和王锦蛇之间无统计学意义。每种锦蛇雌、雄性的红细胞长短径及其比值之间的差异均无统计学意义。

红细胞核长径依次为王锦蛇>赤峰锦蛇>棕黑锦蛇，棕黑锦蛇和赤峰锦蛇之间差异无统计学意义，王锦蛇和棕黑锦蛇、赤峰锦蛇之间差异有统计学意义。红细胞核短径依次为王锦蛇>赤峰锦蛇>棕黑锦蛇，赤峰锦蛇与王锦蛇、棕黑锦蛇之间差异均无统计学意义，王锦蛇和棕黑锦蛇之间差异有统计学意义。红细胞核长、短径比值依次为棕黑锦蛇>王锦蛇>赤峰锦蛇，3种蛇之间差异均无统计学意义。每种锦蛇雌、雄性红细胞核长短径及其比值之间差异均无统计学意义。

红细胞大小依次为王锦蛇>赤峰锦蛇>棕黑锦蛇，王锦蛇和棕黑锦蛇之间差异有高度统计学意义，王锦蛇和赤峰锦蛇之间差异有统计学意义，棕黑锦蛇和赤峰锦蛇之间差异无统计学意义。红细胞核大小依次为王锦蛇>赤峰锦蛇>棕黑锦蛇，王锦蛇和赤峰锦蛇、棕黑锦蛇之间差异均具有高度统计学意义，棕黑锦蛇和赤峰锦蛇之间差异无统计学意义。每种锦蛇红细胞大小及红细胞核大小方面，雌雄性之间差异均无统计学意义。

3种锦蛇的核质比差异均无统计学意义，且每种锦蛇雌、雄性红细胞的核质比之间差异也无统计学意义。 2.1.2 白细胞 嗜酸性粒细胞 3种锦蛇的嗜酸性细胞均呈圆形，胞核呈浅蓝色，常偏位，甚至靠近细胞边缘。胞质中充满了强嗜酸性的杆状和椭圆形颗粒，偶见少量的圆形颗粒(图 1:C，E，I)。嗜酸性细胞是白细胞中最大的细胞，大小在17 μm左右；其中王锦蛇的最大，赤峰锦蛇的最小，但3种蛇之间差异无统计学意义(表 1)。

中性粒细胞 3种锦蛇的中性粒细胞均为圆形，胞核偏位呈浅蓝色，有少量的颗粒覆盖。胞质中的颗粒较小，分布均匀且排列紧密。由于着色不同，可区分出嗜酸性颗粒和嗜碱性颗粒，2种颗粒混合分布于胞质中。但嗜酸性颗粒较多分布于细胞周边，嗜碱性颗粒在近核处较多，且在核的一侧有一颗粒稀疏的淡染区(图 1：A，B，F，J)。细胞大小在15 μm左右，其中棕黑锦蛇的最大，王锦蛇的最小，两者之间差异有统计学意义(表 1)。

嗜碱性粒细胞 嗜碱性粒细胞呈圆形，胞核多为圆形，蓝色，分布于细胞的一侧。胞质中含有大量的圆形或椭圆形的嗜碱性颗粒，常将胞核遮盖，故大多数嗜碱性粒细胞胞核不易观察到(图 1：A，B，H，I)。嗜碱性粒细胞是3种粒细胞中最小的，直径在11 μm左右；王锦蛇的最大，赤峰锦蛇的最小，两者之间差异有高度的统计学意义。

淋巴细胞 淋巴细胞多为圆形，胞质很少，在胞核外仅可见一薄层淡蓝色的胞质。胞核多为圆形，呈蓝紫色。有些淋巴细胞胞质中可见少量的嗜碱性颗粒，有颗粒的部分被染成浅蓝色。淋巴细胞是白细胞中最小的细胞，大小为8 μm左右(表 1)。根据细胞大小和胞质多少，可区分出大、小两类淋巴细胞。在淋巴细胞中可见个别细胞胞质伸出的伪足(图 1：B，G，J)。王锦蛇的淋巴细胞平均值最大，棕黑锦蛇次之，最小的是赤峰锦蛇，但三者之间差异无统计学意义。

单核细胞 单核细胞多为圆形，胞质较丰富，胞核不甚规则，一般呈肾形或马蹄形，多呈偏位(图 1：C，H，I)。细胞大小在12 μm左右(表 1)。2.1.3 血栓细胞

血栓细胞在涂片上常呈聚集状，较常见为3~5个聚在一起，最多数量可达20个以上。由于血栓细胞胞质极少，且基本不着色，环绕在细胞核周围呈透明状，故血栓细胞的形态多为其胞核的形态，呈卵圆形和圆形，偶尔可见不规则形，大小约5~6 μm(图 1：D，F，K)。2.2 血细胞计数及白细胞分类计数

由表 2数据可见，本实验观察的7个数据中，3种锦蛇雌雄性之间差异均无统计学意义。

血细胞计数中(表 2)，王锦蛇的血细胞总数和红细胞数均最多，与其他2种蛇之间差异均有高度统计学意义；棕黑锦蛇和赤峰锦蛇在血细胞总数上差异有统计学意义，而在红细胞数上差异无统计学意义。就白细胞总数而言，棕黑锦蛇最多，其与赤峰锦蛇之间差异有统计学意义；王锦蛇的白细胞总数最少，其与棕黑锦蛇、赤峰锦蛇之间差异均有高度统计学意义。王锦蛇血栓细胞数量最多，棕黑锦蛇最低，王锦蛇与棕黑锦蛇、赤峰锦蛇之间差异均有高度统计学意义，而后两者之间差异无统计学意义(表 2)。

3种锦蛇的淋巴细胞数量均在76%以上(表 2)，王锦蛇淋巴细胞的所占比例最高；其次是棕黑锦蛇和赤峰锦蛇，两者比值非常接近。棕黑锦蛇和赤峰锦蛇的嗜中性粒细胞数量在白细胞中所占比例居第2位，而王锦蛇却是嗜酸性粒细胞。棕黑锦蛇和赤峰锦蛇的嗜酸性粒细胞仅为王锦蛇的35%左右。嗜碱性粒细胞数量是有粒细胞中最少的，其中赤峰锦蛇的比例最高，棕黑锦蛇和王锦蛇的嗜碱性粒细胞仅为其46.8%和55.41%。单核细胞是白细胞中数量最少的细胞，棕黑锦蛇为1.41%，赤峰锦蛇和王锦蛇的不足其43%。3 讨论

本文观察的3种锦蛇血细胞形态结构特征与已报道的其他蛇类等基本一致(Saint，1970；陆宇燕，1999；Campbell，2004；Jaime，2006；Stahl et al.，2006；Gul & Tosunoglu，2011；Stacy et al.，2011；Arikan & Cicek，2014)。 3.1 红细胞

蛇类属于变温动物，血液在维持内环境稳定中具有极其重要的作用。因此，血细胞对外界环境变化以及自身生理状态的变化均具有极为敏感的反应。有报道指出红细胞的大小和形态与动物的分类地位有关，低等动物红细胞较大，高等动物红细胞较小，而数量较多(陆宇燕，1999；Arikan & Cicek，2014)。本文观测的3种锦蛇红细胞长径在15.95~17.08 μm之间，红细胞长短径比值在1.59~1.79 μm之间，与其他学者的研究结果基本一致(吴孝兵等，1998；Arikan et al.，2009；Arikan & Cicek，2014)。Arikan和Cicek(2014)对6科17属36种蛇的研究结果表明，红细胞长径为12.71~18.55 μm，红细胞短径7.20~11.16 μm，并且其中26种蛇红细胞长径为15.1~17.9 μm，6种蛇的为14.1~14.9 μm。龟鳖类的红细胞相对较大，长径为17~20 μm；而蜥蜴的红细胞则相对稍小，4科14属25种的长径均小于16.6 μm，其中23种的长径集中在12~15.5 μm。一般认为，喙头蜥、龟鳖和鳄鱼的红细胞最大，蜥蜴的最小(Saint，1970；Sevinc et al.，2000；Arikan & Cicek，2014)。这说明爬行动物红细胞的大小在高级分类阶元具有一定的相似性，但是，在有些属的种间却存在较大的差异。如游蛇科原锦蛇属的外高加索锦蛇Zamenis hohenackeri和欧洲锦蛇Z. longissimus，前者的红细胞长径为17.66 μm，短径为9.91 μm，而后者的分别为12.71 μm和7.38 μm。我们对3种锦蛇研究结果也表现出这样的差异，棕黑锦蛇和赤峰锦蛇在红细胞长径、短径及其比值的差异均有统计学意义或高度统计学意义；而王锦蛇在红细胞短径上与棕黑锦蛇之间差异有高度统计学意义，且在长短径比值上与棕黑锦蛇之间差异有高度统计学意义，这说明3种锦蛇在红细胞形态参数上具有种间差异，并进一步为棕黑锦蛇和赤峰锦蛇这一对亲缘关系最近的姊妹种的分类提供了一个新的证据。

另外，红细胞作为氧气的主要携带者，其数量以及所含血红蛋量均对运输氧气的量有着直接的影响。实验室饲养观察显示，当年孵化的棕黑锦蛇仔蛇在冬眠前的体重净增重为8.85 g±3.01 g，而王锦蛇则可达38.86 g±4.67 g，两者之间的差异有高度统计学意义。虽然蛇体增重主要取决于消化系统对食物的消化吸收等功能，但是也与机体的代谢能力有着密切的关系。王锦蛇在红细胞大小和数量上均显著大于棕黑锦蛇，说明其可为机体代谢输送更多氧气。在养殖状况下王锦蛇生长速度快，野生状况下王锦蛇体型也较棕黑锦蛇大，这些现象是否与其红细胞参数值大直接相关，还有待于进一步探讨。 3.2 白细胞

白细胞的主要功能是通过吞噬、消化及免疫反应，实现机体的保护防御功能，抵抗外来微生物对机体的损害。血液中白细胞的总数和不同白细胞的数量变化反映了机体的生理和健康状态，与年龄、季节、蜕皮、生殖、生态学和病理学因素等有关(Arikan & Cicek，2014)。

相对于血细胞形态参数的研究，对蛇白细胞计数和分类计数的研究较少。Arikan和Cicek(2014)汇总了国外自1957年以来对23种蛇的研究，其中涉及中南美洲的4种人工养殖的Bothrops属蝮蛇。国内李殿伟等(2007)对黑龙江10种野生蛇血细胞参数进行了报道，指出蛇的白细胞总量均不超过血细胞总量的3%，比例最高者是赤练蛇Lycodon rufozonatus(2.75%)，其中棕黑锦蛇为2.03%。本研究结果显示棕黑锦蛇和赤峰锦蛇的白细胞总量占血细胞总量的比值分别为3.76%和3.46%，这可能是由于蛇类进入秋季后，在冬眠前以提高白细胞总量的方法来防御生存环境中各种微生物的侵袭，并为进入冬眠提供一定的抗感染能力。

在动物体内，嗜中性颗粒细胞、淋巴细胞和单核细胞均与动物体防御机能有密切关系。在白细胞中淋巴细胞所占的比例均为最高，其次是嗜中性颗粒细胞(吴孝兵等，1998；Troiano et al.，1999；李殿伟等，2007)。本研究结果也表明3种锦蛇白细胞中淋巴细胞数量最多，达76%~80%。不同的是王锦蛇嗜酸性颗粒细胞数量远远超过了其他2种锦蛇的近3倍，而嗜中性颗粒细胞仅为其他2种锦蛇的一半。 3.3 血栓细胞

蛇的血栓细胞与哺乳动物的血小板具有类似的功能，其可释放凝血酶导致纤维蛋白原发生聚合反应。先前对各种蛇血细胞观察中仅报道了血栓细胞的形态和结构，对其总量计数则很少(吴瑞敏，1983；吴孝兵等，1998；Stahl，2006；李殿伟等，2007；Arikan et al.，2009；Arikan & Cicek，2014；Monfared，2014)。本文对3种锦蛇的血栓细胞总量计数，发现王锦蛇的血栓细胞总量高达(0.49±0.07)×10⁸/cm³，是棕黑锦蛇和赤峰锦蛇的2倍。

有研究报道王锦蛇血清可中和蝮亚科3种蛇毒，其中注射了尖吻蝮Deinagkistrodon acutus蛇毒和王锦蛇血清的小鼠，其平均死亡时间是单独注射尖吻蝮蛇毒的5.4倍，小鼠的LD₅₀也随着王锦蛇血清量的增加而增加(于晓虹等，2000)。王春森等(1994)指出，给日本大耳兔静脉注射尖吻蝮蛇毒0.075 mg/kg，10 min后即可观察到血液中血小板数量明显减少，且与对照组间差异有高度统计学意义；同时蛇毒可使血小板内5-羟色胺含量下降，引起血小板聚集。而被五步蛇咬伤的(乐冬友等，2010)患者，检查其血液细胞组分结果显示血小板数量也呈现明显降低的特征，且与救治时注射抗蛇毒血清量存在一定关联。那么，王锦蛇血液中血栓细胞高含量是否是其拮抗蛇毒的一种生理储备和适应，起到缓解蛇毒性即发毒性；另外，血栓细胞是否能与其血清中抗蛇毒成分协同抵御蛇毒，值得重视和进一步研究。

本文第一次报道了人工驯养繁殖的3种锦蛇的血液学参数，其中王锦蛇在血栓细胞、嗜酸性颗粒细胞和嗜中性颗粒细胞数量方面与棕黑锦蛇和赤峰锦蛇存在着明显的差别。这种现象值得进一步通过其野生状态和血液年周期变化等比较来探究。