2019, Vol. 21
2. 临安区农业农村局，浙江 临安 311300;
3. 建德市林业局，浙江 建德 311600
2. Lin’an Municipal Bureau of Agricultural and Rural Affairs, Lin’an 311300, Zhejiang Province, China;
3. Forestry Bureau of Jiande, Jiande 311600, Zhejiang Province, China
松材线虫病，是中国目前最为严重的森林病害之一。该病是由松材线虫、寄主植物、媒介昆虫、伴生真菌和细菌、经济物流活动及环境因子等多种因素交织作用而形成的复杂病害系统，防治困难[1]。目前，松材线虫病的防治主要采用检疫、清理死树、营林改造、生物防治及化学防治等方法[2]，其中注干施药是化学防治中最有效的手段，能直接杀死树体内松材线虫，保护松树。
注干施药是一种绿色的林木有害生物防治技术，其药剂直接进入树体内，不与周围环境接触，可以降低对环境的污染及对人畜的伤害[3]。其原理是内吸性药物及矿物质等通过自流式或高压注入树体后会随着树体水分运动而发生纵向或横向运动，使药剂分布在树体各个部位，从而实现对病虫害的防治[4]。
甲氨基阿维菌素苯甲酸盐 (emamectin benzoate，以下简称甲维盐)，具有高效、低毒、低残留、无公害等特点[5-7]。Takai等[8-10]报道了甲维盐可作为防治松材线虫病的有效药物，通过施用注干液剂——甲维盐乳油，可显著降低松材线虫病的发生率；潘伟华等[11]采用2%甲维盐微乳剂为注干液剂防治松材线虫病，效果显著，持效期可达3a以上。然而，在中国华南地区，如福建、广东等地，由于常年平均气温偏高，马尾松松脂分泌旺盛，因而会导致在使用甲维盐乳油作注干液剂时，注药器的注入孔会被松脂堵塞而使液体无法注入树体内的现象发生，因此有必要研制甲维盐新剂型，以解决这一难题。鉴于此，笔者选取苯甲酸钠、单水乳糖、可溶性淀粉及羧甲基纤维素为水溶性载体，通过混合载体及甲维盐油相，螺杆挤压造粒的方法研制了注干用10%甲维盐可溶粒剂，对其相关性能指标及其在树体内的溶解性、传导性和防治效果等进行了研究。
1 材料与方法 1.1 仪器与药剂Waters 600 高效液相色谱仪 (美国Waters公司)；IKA RV10 基本型立式旋转蒸发仪 (广州仪科实验室技术有限公司)；超声波清洗仪 (昆山市超声仪器有限公司)；摇摆式万能高速粉碎机 (温岭市林大机械有限公司)；ZGH高速混合机和SET-100单螺杆挤压制粒机 (常州市苏力干燥设备有限公司)。
95.6%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐 (emamectin benzoate) 标准品 (佳木斯兴宇生物技术有限公司)；70%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐原药及辛基酚聚氧乙烯醚 (OP-10) (浙江世佳科技有限公司)；ODS填料 (日本大曹株式会社)；甲醇和乙腈，色谱纯以及正丁醇、苯甲酸钠、单水乳糖、羧甲基纤维素和可溶性淀粉，分析纯 (均为国药集团试剂有限公司)。
1.2 水溶性载体配方的优化 1.2.1 甲维盐油相配制将甲维盐原药溶于正丁醇，加热搅拌至完全溶解后加入OP-10，40 ℃下搅拌30 min，记为甲维盐油相。
1.2.2 均匀试验设计方案及载体吸油率测定以苯甲酸钠、可溶性淀粉、单水乳糖和羧甲基纤维素为水溶性载体，采用魏方林等混料均匀试验设计方案[12]，利用DPS数据处理系统生成U11 (114) 表 (见表1)。
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表 1 U11 (114) 混料均匀试验设计方案 Table 1 U11 (114) uniform design of experiments with mixtures |
根据表1数据，称取各水溶性载体，记初始总质量M0，加入过量的甲维盐油相，充分搅拌后于30 ℃水浴锅中静置10 min，布氏漏斗抽滤至泛白，称重，记为M1。重复3次，取平均值。按 (1) 式计算载体吸油率 (Y：g/100 g载体)。根据载体吸油率测定结果，确定各载体的配比。
| $ Y=\frac{{M_1 - M_0}}{{M_0}} \times 100 $ | (1) |
准确称取优化后的复配载体20 g于500 mL烧杯中，连续搅拌下将其缓慢倒入10 g甲维盐油相中，使油相被载体充分吸收；利用注射器挤压造粒；检测粒剂各项性能，确定粒剂配方。
1.3.1.2 中试工艺按照小试工艺确定的粒剂配方造粒。利用ZGH高速混合机将各水溶性载体混合均匀后用喷雾器均匀喷施入甲维盐油相，继续混合一定时间。机器混合物料 (载体与油相) 的时间分别设定为5、10及15 min，混合后随机挑取混合机中不同部位的物料检测甲维盐含量，以检验混合是否均匀，确定最佳混合时间。最后采用SET-100单螺杆挤压制粒机造粒。
1.3.2 性能测定 1.3.2.1 有效成分含量测定利用高效液相色谱 (HPLC) 法检测制剂中甲维盐的含量[11]。
1.3.2.2 乳液稳定性测定参照文献[13]方法进行。将0.5 g甲维盐可溶粒剂加入至100 mL已预热至30 ℃的硬水中，搅拌，得到甲维盐乳液，于30 ℃水浴锅内静置1 h。观察乳液的稳定性，若乳液均一则为合格。
1.3.2.3 pH值测定参照文献[14]方法进行。用经校准的pH计重复测试3次，取平均值。
1.3.2.4 热贮稳定性测定参照文献[15]方法进行。取4粒共计20 g甲维盐可溶粒剂于锥形瓶中，密封，置于 (54 ± 2) ℃培养箱中，14 d后取出，测定其有效含量及乳液稳定性。
1.4 甲维盐可溶粒剂在马尾松内的溶解及传导性测定 1.4.1 粒剂溶解及传导性测定注干试验于浙江省杭州市临安区东湖村马尾松林及福建省泉州市仙公山进行。
注药剂量以马尾松胸径大小为基准：胸径小于10 cm，施用10 g粒剂；胸径为10~20 cm的施用15 g粒剂；胸径大于20 cm的施用20 g粒剂；当胸径超过30 cm时，每增加5 cm胸径需增加5 g粒剂。注药时用Φ10 mm钻头在树的基部，向下倾斜45°钻深为5 cm的孔，将粒剂塞入孔中，用黏土封口。每天打开封口用玻璃棒探查注孔内药剂溶解情况。若无药剂残留说明已全部溶解，统计完全溶解时间。每次观察结束后重新封口。
分别于注药60 d和180 d时用高枝剪取马尾松枝条 (从树冠向下，分上层、中层、下层3段剪取松枝，记为3、2、1，随机取样20株)，自然阴干，高效液相色谱法(HPLC)检测各样本中甲维盐含量，取平均值。以未注药马尾松为对照。
1.4.2 样品前处理 1.4.2.1 样品提取使用粉碎机将马尾松枝条粉碎过筛孔径为75 μm的筛网。准确称取10.0 g样品于 250 mL三角瓶中，加入50 mL V (甲醇):V (水) = 95:5混合溶剂，超声振荡提取1 h，抽滤，用30 mL甲醇淋洗残渣，重复3次。合并滤液及甲醇淋洗相，减压浓缩至干，用甲醇溶解并定容至2 mL，0.45 μm滤膜过滤，待净化。
1.4.2.2 样品净化参考朱昶等[16]方法制备净化小柱。选用5 mL无菌注射器 (不带针头)，在底部放置脱脂棉，真空抽气，依次加入1 mL无水硫酸镁和3 mL ODS填料，备用。
依次用5 mL V (甲醇):V (水) = 95:5混合溶剂和甲醇活化平衡净化小柱，将提取液转入柱中。用5 mL V (甲醇):V (水) = 95:5分数次淋洗，最后用10 mL甲醇洗脱，收集洗脱液至10 mL容量瓶，供HPLC检测。上样和淋洗、洗脱过程中流速均不超过 1 mL/min。
1.4.2.3 HPLC检测条件Waters XBridge C18色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；检测波长244 nm；流动相为V (乙腈) : V (甲醇) : V [水 (含0.1%三乙胺)] = 50 : 42 : 8；流速1 mL/min；进样量20 μL；柱温25 ℃。
1.4.2.4 标准曲线及添加回收试验用甲醇配制1 000 mg/L的甲维盐标准品母液，稀释成0.5、1、5、10和20.0 mg/L的标准溶液。以甲维盐的质量浓度为横坐标，高效液相色谱测定响应值为纵坐标建立标准曲线。
在马尾松枝条中，分别添加甲维盐标准品，添加水平分别为0.1、0.5、2.0、5.0和10.0 mg/kg，进行回收率试验。
1.5 林间防治试验选取福建省泉州市仙公山及浙江省杭州市临安区东湖村马尾松林，两地皆为松材线虫病疫区。东湖村马尾松平均胸径20.6 cm，密度约为1 508株/hm2，平均株高18.05 m；仙公山马尾松平均胸径18.5 cm，密度约为6 054株/hm2，平均株高11.05 m，松脂常年分泌旺盛。在两个林区分别选取2块马尾松死亡率高的林地作为标准样地，其中1块作为施药区，另1块作为空白对照区。分别于2018年1月4日和3月6日进行注干施药东湖村共计施药110株，仙公山共计施药230株。
注干施药后采用喷漆及号码牌标记，记录每棵松树的编号、胸径及施药量。注药当日观察记录马尾松枯死树数量，并于2018年12月统计两地试验林地马尾松枯死树数量。
2 结果与分析 2.1 复配水溶性载体配方的优化选取苯甲酸钠、单水乳糖、羧甲基纤维素和可溶性淀粉为水溶性载体，采用均匀试验设计方案U11 (114)，计算得到的吸油率结果见表2。
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表 2 吸油率检测结果 Table 2 Test results of oil absorption |
对吸油率结果采用偏最小二乘回归分析，得到其回归方程：
| $ \begin{array}{l} \;\;\;\;\;Y = 40.748\;6111 + 0.295\;135{X_1} - 19.354\;342{X_2} + 11.533\;811{X_3} - 10.577\;839{X_4} + 8.498\;215{X_5} + 0.047\;069{X_1}^2 + \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\; 67.497\;774 {X_2}^2 - 4.680\;967{X_3}^2 - 1.369\;677{X_4}^2 - 10.424\;209{X_5}^2 - 2.629\;590{X_1}{X_2} + 8.832\;560{X_1}{X_3} -\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\; 1.694\;075{X_1}{X_4} -5.807\;226{X_1}{X_5} - 56.974\;893{X_2}{X_3} - 13.403\;980{X_2}{X_4} + 2.978\;263{X_2}{X_5} +\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\; 24.643\;572{X_3}{X_4} + 19.950\;343{X_3}{X_5} - 4.741\;645{X_4}{X_5} \end{array} $ |
该回归方程R2 = 0.989 5，残差 = 2.397 8，说明该模型拟合较好，可用于优化，得到其最佳组合为：吸油率Y = 51.18 g/100 g载体，其中各载体的质量分数为：苯甲酸钠58.08%、羧甲基纤维素7.14%、单水乳糖30.44%、水溶性淀粉4.34%。按照该配比称取各载体，混合后再测定其吸油率，重复测量3次，计算其吸油率平均值为50.65 g/100 g载体。该复配载体可用于造粒。
本研究中用于小试工艺造粒的20 g复配载体的配方为：苯甲酸钠11.6 g、单水乳糖6.1 g、羧甲基纤维素 (黏合剂) 1.4 g和可溶性淀粉 0.9 g。
2.2 中试造粒工艺及相关性能指标检测结果称取优化后的水溶性载体10 kg与甲维盐油相5 kg于高速混合机中混合，分别在物料混合5、10及15 min后检测混合机中各部位甲维盐的含量。结果表明，混合10 min和15 min物料的均匀程度无显著差异(表3)。结合机器耗能及生产效率，选定10 min为生产混合时间。
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表 3 不同混合时间的效果 Table 3 The effect of mixing time |
根据小试工艺试验配方及最佳混合时间，选用SET-100单螺杆挤压制粒机造粒，获得中试产品甲维盐可溶粒剂，为乳白色圆柱状固体粒剂 (Φ10 mm × 5 cm)，粒剂性能指标测定结果显示，甲维盐有效成分质量分数为10.12%，热贮稳定性及乳液稳定性合格，粒剂乳液pH值 6.4 ± 0.3。根据中试结果确定粒剂物料最佳配比为甲维盐10% (折纯)，OP-10 6.7%，正丁醇12.0%，苯甲酸钠39.0%，单水乳糖20.5%，可溶性淀粉3.0%，羧甲基纤维素4.5%。
2.3 粒剂在树体内的溶解及传导性 2.3.1 粒剂在树体内溶解性注药后于不同时间观察注孔内粒剂的溶解情况。结果见表4。
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表 4 可溶粒剂在马尾松树体内溶解性 Table 4 The solubility of soluble granule in P. massoniana |
2.3.2 甲维盐标准曲线及添加回收率
结果表明，在0.5~20 mg/L范围内，甲维盐的响应值与其质量浓度呈良好的线性关系，回归方程为y = 10 076x–1 316.9，相关系数为0.996 6，满足定量分析的需要[?]。添加回收试验结果 (表5) 表明：在0.1~10 mg/kg 5个添加水平下，甲维盐的回收率在82%~88%之间，相对标准偏差在1.5%~4.4%之间。以最低添加水平确定定量限 (LOQ)，文中甲维盐的LOQ为0.1 mg/kg，该方法可用于甲维盐在树体内含量测定。
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表 5 甲维盐在马尾松枝条中的添加回收率 Table 5 Recovery of emamectin benzoate in the branches of P. massoniana |
2.3.3 甲维盐在树体内的残留消解动态
对临安东湖村及泉州仙公山马尾松注药后，分别于60 d和180 d取枝条检测甲维盐的残留量，结果见表6。可以看出：注干施药后，仙公山松树中甲维盐的残留量小于东湖村的，说明松脂分泌对药剂的吸收与传导会产生一定影响。粒剂完全溶解需要一定时间，先溶解的药剂被树体组织吸收传导。随粒剂的溶解，甲维盐不断向上传导运输，所以松树各部位甲维盐含量随着时间的延长而逐渐增加。
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表 6 甲维盐在马尾松树体内传导分布动态 Table 6 The property of distribution and tranlocation of emamectin benzoate in P. massoniana |
2.4 林间防治效果
统计两试验地的病死树数量。结果 (表7) 表明，采用10%甲维盐可溶粒剂注干施用后，两地试验区马尾松的死亡率大幅下降，表明甲维盐在树体内溶解释放并经树体内传导分布，可杀死松材线虫，起到防治作用。
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表 7 甲维盐可溶粒剂对林间松材线虫病的防治效果 Table 7 Field tests of controlling with 10% emamectin benzoate soluble granule against the pine wilt disease under field conditions |
3 结论与讨论
本研究选取苯甲酸钠、单水乳糖、羧甲基纤维素和可溶性淀粉为水溶性载体，采用混料均匀试验设计及偏最小二乘回归分析法对水溶性载体的配方进行了优化，以溶于正丁醇和OP-10的甲维盐为油相，采用中试机械制粒法，确定载体的配方。以小试工艺为基础，初步建立了粒剂的中试生产工艺，最终研制了注干用10%甲维盐可溶粒剂。粒剂外观为乳白色圆柱体，各项性能指标合格。其中载体苯甲酸钠在具备高吸油率的同时兼具有一定防腐作用，可以保护注孔周围不被微生物侵染而病变；单水乳糖及可溶性淀粉吸油后能使粒剂具有一定硬度，林间施用易塞入注孔；羧甲基纤维素为黏合剂，可提高制粒率。
将所研制的10%甲维盐可溶粒剂注入马尾松内，粒剂在试验地马尾松注孔内溶解时间为3.9~13 d，注药60 d后，在马尾松枝条中均能检测到甲维盐，说明粒剂能有效传导。泉州松枝样本中甲维盐平均残留量为 (60 d) 0.97 mg/L、(180 d) 1.56 mg/L，说明甲维盐可溶粒剂能在松脂分泌旺盛地区施用。本文仅研究了甲维盐可溶粒剂能否在马尾松树体内溶解传导，今后需进一步探讨粒剂在树体内的传导效率及其分布影响因子。从整体上看，10%甲维盐可溶粒剂注干后能够在树体内吸收传导，且施药60 d后树体内甲维盐残留量大于松材线虫的LC90值 (0.75 mg/L)，为进一步林间施用奠定了基础。
林间防治试验表明，甲维盐可溶粒剂对松材线虫病有良好的防治效果，但泉州仙公山防治区仍有马尾松因松材线虫病死亡，分析可能是该地区松墨天牛羽化时间早所致。据报道，福建泉州、厦门等闽南地区松墨天牛羽化高峰期在每年4月，天牛数量占全年羽化成虫的31%[17-18]，而泉州地区施药时间是3月中旬，在甲维盐还未传导分布于松树各部位时，松墨天牛已羽化，其取食传入松树的松材线虫并在松树内扩增繁殖，对松树的水分输导组织造成了破坏，导致松树水分运输失衡[19]，进而阻碍了甲维盐的传导运输。对该地施药后死亡的松树枝条进行了取样检测，也未检测到甲维盐。结合泉州市松墨天牛发生时期，该地区注干施药最佳时间应在12月至来年2月。
现代农药制剂正朝着颗粒化、水基化发展，固体粒剂具有结构稳定、生产工艺简单、使用安全及环境污染小等优点[20]。本研究所制备的甲维盐可溶粒剂兼具以上特性，同时造粒工艺简单，可实现机械化大批量生产。在使用时，不易造成对儿童的意外伤害；由于无塑料瓶包装，故也不会造成塑料容器等载体的浪费和环境污染，在森林及城市绿化树病虫害防治中[21]具有较好的应用前景。
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