2019, Vol. 21
2. 湖南省农业科学院 湖南省农业生物技术研究所 杂草生物学及安全防控湖南省重点实验室，长沙 410125
2. Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Weeds, Hunan Agricultural Biotechnology Research Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China
从植物性材料中发现和挖掘具有除草活性的物质，不仅是有效创制和研究新农药的热点与前沿，也是对植物资源的合理开发与利用[1-2]。目前已在30多科植物中发现了具有除草活性的近百种化合物，主要是酚醌类、生物碱类、肉桂酸类、萜烯类及氨基酸类等，有些已成功开发成为除草剂[3-6]。棉籽壳是棉花加工过程中产生的副产品，由于其密度小，不易运输和储存，加之外壳坚硬，纤维含量少，纤维短，也不适合做造纸原料[7]，因此被视为废弃物，大部分以焚烧的形式被处理掉。目前，棉籽壳作为资源利用的途径主要有食用菌的培养基底料、发酵生产饲用复合酶和草酸等[8-10]。有关于棉籽壳中的化学成分及药理作用等目前还鲜见报道[11-12]。从植物性农副产品中探索和开发植物源除草前导化合物，不仅是为植物源除草剂的开发提供新资源，也是“变废为宝”的一个可行途径。笔者前期初步研究发现，棉籽壳乙醇粗提物具有一定的除草活性[13]，为进一步明确其活性成分，采用茎叶喷雾法，测定了棉籽壳中分别以无水乙醇、正丁醇、石油醚和乙酸乙酯为溶剂进行索氏提取的粗提物对稗草生长的抑制活性；利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术鉴定了无水乙醇粗提物中的化学成分，并进一步测定了各化学成分的除草活性，旨在为寻找棉籽壳中可能作为除草剂的先导化合物提供依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 试验材料棉籽壳，2017年购于江苏徐州棉壳有限公司。供试稗草Echinochloa crusgalli (L.) Beauv. 种子2017年采自湖南省农业科学院高桥科研试验基地水稻田，由杂草生物学及安全防控湖南省重点实验室保存并提供。
1.1.2 试剂无水乙醇(含量 ≥ 99.7%)、石油醚(60~90 ℃)及乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、二甲亚砜，均为分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司。甘油、三环己基-3-烯-6-辛酮、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、(邻甲基苯酚)-2-溴-2氯-乙酰酯、十四酸、十四酸乙酯、十六烷酸、辛酸异戊酯和亚油酸标准品，均为分析纯，购于麦克林公司。试验用水为蒸馏水。30%氰氟草酯水乳剂安徽远景作物保护有限公司)。
1.1.3 主要仪器SHB-III型循环水式多用真空泵(河南省豫华仪器有限公司)；Agilent 7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)；RE-300旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
1.2 试验方法 1.2.1 棉籽壳中活性成分的提取将棉籽壳粉碎后过300目(孔径0.048 mm)筛。准确称取过筛后的棉籽壳50 g，装入纤维素抽取套管，采用索氏提取法，分别以250 mL无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇为溶剂抽提12 h。抽滤，滤渣再用等体积的溶剂提取，重复3次。合并滤液，旋转蒸发至膏状，得到粗提物。
1.2.2 粗提物的除草活性测定参考文献[14]方法。分别称取各溶剂粗提物，用丙酮溶解后加入吐温-80，设置粗提物的质量浓度分别为1、2、4、8和16 g/L(稀释后丙酮体积分数不高于2%，吐温-80体积分数为0.8%)。以稗草为试验对象，采用茎叶喷雾法，在稗草三叶期时施药。设空白对照，3次重复。将处理后的稗草置于温室[温度27℃ ± 1℃，相对湿度32%，光照度12 000 lx, 光周期 12 h(白天)/12 h (晚上) ]中培养。7 d后测定稗草鲜重，计算稗草生长抑制率。
1.2.3 无水乙醇粗提物中化学成分的鉴定将无水乙醇粗提物用丙酮稀释，采用GC-MS进行化学成分分析。检测条件：Rxi-50色谱柱(30 m × 0.25 mm id，0.25 μm df)。起始温度为60 ℃，保持2.0 min；然后以10.0 ℃/ min升温到240 ℃，保持2.0 min；再以20.0 ℃/ min升温到280 ℃，保持6.0 min。不分流进样，进样量1.0 μL；载气为高纯氦气，流速为1.0 mL/ min；EI离子源，温度为250 ℃，电子能量为70 eV，扫描范围为33~500质谱质量单位。
样品经GC-MS分析后，对总离子流图中的各峰进行质谱扫描，得到质谱图，经NIST05、NIST05s以及WILEY7质谱数据库进行计算机检索，结合人工谱图解析、文献核对及与标准品相对照，鉴定其中的化学成分[15-16]。
1.2.4 无水乙醇粗提液中主要化学成分的除草活性测定将各化合物标准品分别用丙酮溶解，加入吐温-80，用水稀释成质量浓度分别为5、10、20、40和80 mg/L的药液(稀释后丙酮的体积分数不高于2%，吐温-80的体积分数为0.8%)，按照1.2.2节的方法以氰氟草酯为对照药剂测定各化合物的除草活性，其测试质量浓度分别为0.5、1、2、4和8 mg/L。
1.3 数据处理试验数据采用DPS 7.05软件进行统计分析，求出其毒力回归方程，计算抑制中浓度(IC50)、95%置信限及相关系数。
2 结果与分析 2.1 不同溶剂粗提物对稗草的除草活性由不同溶剂粗提物对稗草的IC50值(表1)可以看出，供试各溶剂粗提物对稗草的抑制活性由高到低为：无水乙醇粗提物 > 正丁醇粗提物 > 乙酸乙酯粗提物 > 石油醚粗提物。
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表 1 不同溶剂粗提物对稗草的除草活性 Table 1 Herbicidal activities of the extracts obtained using four organic solvents against Echinochloa crusgalli |
2.2 无水乙醇粗提物中的化学成分
结合图1和表2，经NIST05、NIST05s及WILEY7质谱库检索，并与其标准品对照后可知，无水乙醇粗提物中主要含有9种化学成分，分别为甘油、三环己基-3-烯-6-辛酮、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、(邻甲基苯酚)-2-溴-2氯-乙酰酯、十四酸、十四酸乙酯、十六烷酸、辛酸异戊酯和亚油酸。
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图 1 无水乙醇粗提物的气相色谱-质谱总离子流图 Fig. 1 The total lon chromatography of the ethanol extracts of cottonseed hulls from GC-MS chromatogram |
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表 2 棉籽壳无水乙醇粗提物主要化合物GC-MS联用鉴定结果 Table 2 Results of the GC-MS analysis of cottonseed hulls ethanoli extracts |
2.3 无水乙醇粗提物中主要化合物的除草活性
测定结果(表3)表明：甘油、三环己基-3-烯-6-辛酮、十四酸、十四酸乙酯和十六烷酸对稗草不具除草活性，而亚油酸、辛酸异戊酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚和(邻甲基苯酚)-2-溴-2氯-乙酰酯则表现出一定除草活性，其中，亚油酸的活性最好，IC50值为14.5 mg/L, 与对照药剂氰氟草酯的IC50值(1.69 mg/L)仅差一个数量级，值得进一步研究。
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表 3 无水乙醇粗提物中主要化合物对稗草的除草活性 Table 3 Herbicidal activities of major compounds in the ethanol extract against E. crusgalli |
3 讨论
从植物性农产品副产物中寻找除草化合物是新除草剂研究的一条重要途径，又是资源再利用的新方法。在化学提取流程中，选用何种溶剂能够最大限度地提取和分离出除草活性物质至关重要[17]。本研究在前期工作的基础上，选用了4种不同的有机溶剂对棉籽壳进行了提取，并测定了各粗提物的除草活性。结果发现，不同溶剂粗提物对稗草的抑制效果由高到低的顺序为：无水乙醇粗提物 > 正丁醇粗提物 > 乙酸乙酯粗提物 > 石油醚粗提物。
采用GC-MS联用技术对棉籽壳无水乙醇粗提物的化学成分进行分析，发现其中主要含有甘油、三环己基-3-烯-6-辛酮、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、(邻甲基苯酚)-2-溴-2氯-乙酰酯、十四酸、十四酸乙酯、十六烷酸、辛酸异戊酯和亚油酸等9种化合物，主要为烃类衍生物、烃类、醇类、有机酸类以及酯类物质，而这些成分大多已被前人从其他化感植物性材料中分析得到[18-19]。
除草活性测定结果发现，亚油酸对稗草的IC50值为14.5 mg/L，是9种主要成分中活性最强的化合物。亚油酸是一种C18的有机酸类化感物质，有关其除草活性已有部分报道[20]。Miyuki等证实壬酸的除草作用与膜透性的改变和叶绿素从类囊体中移位所产生的自由基相关[21]。李祖任等发现羊脂酸的除草机理可能与其抑制杂草的光合作用有关[22]。张庭延等发现，用亚油酸处理铜绿微囊藻后，铜绿微囊藻的叶绿素a含量下降，细胞外液中电导率、OD260值增加；细胞
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