2018, Vol. 20
2. 中国农业大学 昆虫学系，北京 100193
, MA Kangsheng2, LIU Junjie1, LU Liuyang1, XIE Lanfen1, KONG Fanbin1, CHEN Xiling1
, GAO Xiwu2
2. Department of Entomology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
麦二叉蚜Schizaphis graminum Rondan是一种适应性很强的世界性农田作物害虫，不仅通过口针刺吸汁液为害麦类，而且传播黄矮病病毒[1-4]。近年来，麦二叉蚜在禾谷类作物蚜虫种类中占比明显增加，危害日益严重[5]。长期以来，麦蚜的防治以化学农药为主，主要包括新烟碱类、拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类等化学杀虫剂[6-7]，但由于麦蚜繁殖量大，世代交替速度快，造成麦蚜对常用杀虫剂产生了较高的抗性[4, 8]。吡虫啉 (imidacloprid) 属于氯化烟碱类杀虫剂，对飞虱、蚜虫等刺吸式口器害虫具有较高的毒力[9]。目前，一些麦蚜对吡虫啉已产生不同程度的抗性，并有逐渐加重的趋势[10-11]。
研究表明，吡虫啉在渗入麦长管蚜表皮达到作用靶标之前，蚜虫解毒酶会增加对吡虫啉的代谢，进而使吡虫啉变成无毒代谢产物或毒性降低[12-13]。这种代谢机制包含了一系列的解毒酶作用，其中，细胞色素P450单氧化酶系活性增强在麦长管蚜品系对吡虫啉的抗性中起重要作用[14-15]。氟啶虫胺腈 (sulfoxaflor) 是防治蚜虫、飞虱、介壳虫等刺吸式口器害虫的全新杀虫剂，被杀虫剂抗性行动委员会认定为全新Group 4C类杀虫剂中的惟一成员，可作用于烟碱型乙酰胆碱受体 (nAChR) 而发挥杀虫功能[16-17]。昆虫接触杀虫剂后，不仅会导致其生理和行为发生改变，促进抗药性发展，还会影响昆虫体内重要的解毒代谢酶的活力[18-19]。本研究以麦二叉蚜为研究对象，通过转录组测序，筛选出用吡虫啉或氟啶虫胺腈诱导后麦二叉蚜中差异性表达的P450基因，并应用实时荧光定量PCR(qPCR) 对其验证，旨在为进一步阐明麦二叉蚜对吡虫啉或氟啶虫胺腈的解毒代谢机理提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试蚜虫麦二叉蚜Schizaphis graminumRondan，由中国农业大学昆虫毒理与分子生物学实验室提供，于养虫笼中在温度18～25 ℃、相对湿度50%～70%及光周期17 h : 7 h(L : D) 的条件下利用水培麦苗大量饲养麦蚜的技术[19]进行饲养。
1.2 试剂与药品RNeasy plus Micro Kit、QiaQuick PCR extraction kit和DNA快速回收试剂盒 (QIAquick Gel Extraction Kit) 购自QIAGEN公司；TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；rTaq聚合酶、LA Taq聚合酶、DNase I、反转录试剂盒 (PrimeScript 1st strand cDNA synthesize kit) 和pMD18-T vector均购自宝生物工程有限公司 (大连)；核酸染料 (GenecolourTM) 购自北京金博益生物技术有限公司；荧光定量PCR染料 (Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG Kit) 和Dynal Beads Oligo d (T)25 均购自Invitrogen公司；dATP购自GE公司；Illumina Gene Expression Sample PrepKit和Solexa测序芯片 (flowcell) 引物由华大基因合成。吡虫啉 (imidacloprid，纯度96.1%) 和氟啶虫胺腈 (sulfoxaflor，纯度，98.5%) 原药均由深圳诺普信股份有限公司提供，其余化学试剂均为国产分析纯。
1.3 主要仪器Applied Biosystems7500 qPCR System (Applied Biosystems, Foster City，USA)；Mastercycler Personal PCR仪 (Eppendorf，Germany)；mini-sub cell GT型电泳槽和power/PAC 3000型电泳仪 (Bio-Rad产品)；Kodak电泳凝胶成像仪 (Kodak Inc. USA)；Illumina Cluster Station、Illumina Genome Analyzer和Illumina hiseq4000系统 (Illumina Inc. USA)。
1.4 试验方法 1.4.1 杀虫剂毒力测定采用浸渍法[20]。先分别将吡虫啉和氟啶虫胺腈原药用丙酮配制成2 000 mg/L的母液，使用时再用清水按等比或等差稀释成5～7个质量浓度，每浓度重复3次。将带有15头健康一致的3龄无翅若虫的麦苗叶片浸于药液中，10 s后取出，吸干多余药液。以清水作为对照。将处理后带有蚜虫的麦苗叶片置于透明玻璃管内 (直径1.8 cm，高7.2 cm，内表面积40 cm2)，用纱布封口，在室内正常饲养条件下饲养，24 h后检查死亡率，以对照组死亡率小于5%为有效生物测定。所得数据用POLO软件分析，分别计算吡虫啉和氟啶虫胺腈对麦二叉蚜的LC10和LC50值。
1.4.2 转录组测序和qPCR样品处理采用1.4.1节方法对麦二叉蚜和杀虫剂进行处理。吡虫啉或氟啶虫胺腈处理浓度为其LC10值。转录组所用样品每个处理30头蚜虫，每处理2次重复，立即浸入液氮中，于 –80 ℃保存；qPCR所用样品每处理5头蚜虫，每处理3次重复，立即浸入液氮中，于 –80 ℃保存。
1.4.3 总RNA的提取用Trizol试剂提取麦二叉蚜总RNA。用质量分数为0.1%的diethyl pyrocarbonate(DEPC) 处理的无菌水清洗样品3次，加入l mL Trizol试剂，按照Trizol、氯仿和异丙醇3步法提取，将所得总RNA溶解于经DEPC处理的水中。经检测，RNA完整性 (RIN) 数值位于6.7～7.6之间，OD260与OD280的比值在1.85～1.99之间，表明RNA的完整性和纯度均较高，达到了转录组测序的要求。
1.4.4 RNA-seq测序和数字基因表达谱文库(Digital gene expression, DGE)构建采用Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 测定麦二叉蚜RNA样品质量，通过Oligo(dT)磁珠吸附纯的mRNA，并以Oligo(dT)引导反转录合成双链cDNA。利用磁珠沉淀纯化带有 cDNA 3’端的片段，将cDNA 5’末端连接 Illumina接头 1；再通过磁珠沉淀去除 3’片段后，在Tag 3’末端连接Illumina 接头 2，从而获得两端连有不同接头序列的 21 bp 标签 library；进而将经过 PCR 线性扩增的产物通过6％TBE PAGE 胶电泳纯化 85 bp 条带，解链后加到 solexa 测序芯片上并固定，采用边合成边测序法(sequencing by ynthesis, SBS)测序。将产生数百万条原始 Read，Read 的测序读长为 35 bp。对原始数据去除杂质及低质量数据后，得到的 clean tags 进行表达量、试验重复性、饱和度分析以及共有、特有和差异 Tag 的分析。对所有的 tag 进行基因注释及标准化，对基因表达量进行统计，最后进行表达谱之间差异基因的筛选。由公司北京诺禾致远科技股份有限公司对样品进行测序和分析。
1.4.5 测序数据的组装采用短Reads软件Trinity(http://trinitymaseq.Sourceforge.net) 对转录组数据从头组装拼接。首先，Trinity将Overlap的Reads拼接成更长的片段，通过Reads Overlap获得组装片段，称为重叠群Contig；其次，将Reads比对回Contig，由Paired-end Reads确定这些出自同一转录文本的不同Contig及不同Contig之间的距离，Trinity将Contig组合在一起，获得两端不能再延长的序列，即Unigene[21]。将组装获得的Unigene去冗余和再拼接，进行序列同源转录本聚类分析，获得最终的Unigene。
1.4.6 功能注释与序列分析首先，通过Blastx将Unigene序列与蛋白数据库Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(Evalue < IE-5) 进行比对，再通过Blastn将Unigene与核酸数据库Nt(Evalue < lE-5) 进行比对，获得与该Unigene最大相似性的序列蛋白，进而获得该Unigene的蛋白功能注释信息 [22-24]；然后，依据Nr注释的序列信息，通过Blast2GO软件获得Unigene序列的Go注释信息[25]；最后，通过WEGO软件将所有Unigene序列做Go功能分类统计[23]，最终确认该物种的基因功能等。
1.4.7 差异性基因表达量估计及筛选通过Bowtie将所有样品测序获得的Reads与单基因序列库进行比对[26]，获得比对结果Mapped reads，然后进行表达量水平估算，用FPKM(Fragments per kilo base of transcriptper million mapped reads) 表示对应的单基因序列表达丰度。通过EBSeq对每个Unigene差异性表达进行分析，通过Benjamini-Hochberg将原有假设检验获得的显著性 (P < 0.05) 差异值进行校正，最后获得校正后的显著性 P < 0.05值，即FDR(False discovery rate)，并作为筛选差异表达基因 (Differentially expressed genes，DEGs) 的关键指标 [27]。在显著差异性筛选过程中，将FDR < 0.01且差异倍数 (Fold change, FC) 即两样品间FPKM值的比值大于等于1.4作为筛选标准。
1.5 实时荧光定量PCR(qPCR)验证P450基因表达 1.5.1 cDNA第1条链合成根据TaKaRa公司的Recombinant DNase Ι (RNases-Free) 使用说明书，在反转录前进行麦二叉蚜总RNA的基因组DNA消化反应，cDNA第1链的合成按TaKaRa公司反转录试剂盒 (PrimeScript TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit) 说明进行反转录，合成qPCR cDNA模板。
1.5.2 qPCR 标准曲线的绘制及回归方程的建立对质粒进行10 倍配比稀释，以1×1010～1×105 copies/μL这6 个浓度梯度为模板进行qPCR 扩增，并绘制标准曲线。每个梯度进行3 个重复。反应体系：2×One Step qPCR SYBR Solution Buffer 10 μL，模板1 μL、引物各0.3 μL，补水至20 μL。反应程序：92 ℃ 3 min；92 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40 个循环。根据Ct值绘制标准曲线并建立回归方程。
1.5.3 qPCR验证P450基因表达按照Real Master Mix SYBR Green PCR kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 操作说明进行。取相同量的逆转录产物进行qPCR反应，数据用ABI 7 500 System分析。相对表达量的计算按2-ΔΔCt方法[28]进行；另外，同时扩增28S和α-TUB基因作为参照。引物及基因序列信息见附加材料表S1。
1.6 数据分析原始数据采用Microsoft Excel 2010整理和归纳，杀虫剂对麦二叉蚜的毒力测定结果采用POLO (Probit and Logit Analysis)(LeOra Software Company, Petaluma, CA) 软件分析，运用SPSS15.0软件对12个P450基因的qPCR数据进行统计分析 (Student’s t test，P < 0.05)。
2 结果与分析 2.1 两种杀虫剂对麦二叉蚜的触杀毒力采用浸渍法分别测定麦二叉蚜对2种杀虫剂的敏感性。结果表明，吡虫啉和氟啶虫胺腈对麦二叉蚜的LC50值分别为0.106和0.195 mg/L (表1)。
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表 1 吡虫啉和氟啶虫胺腈对麦二叉蚜的触杀毒力 Table 1 Contact toxicity of imidacloprid and sulfoxaflor againstS. graminum |
2.2 测序数据的组装结果
通过对麦二叉蚜吡虫啉处理组 (BT)、氟啶虫胺腈处理组 (FT) 和空白对照组 (CK) 样品进行转录组测序，分别获得48 771 024、48 763 494和45 653 762 Clean Reads，数据已提交到NCBI Short Read Archive(SRA) 数据库，登录号为SRP135911。从数据的各项指标 (见附加材料表S2) 可以看出测序质量较高。
2.3 麦二叉蚜响应吡虫啉或氟啶虫胺腈的P450基因通过对麦二叉蚜进行转录组测序，得到的P450基因最小长度201 bp，最大长度4196 bp，具体信息见附加材料表S3。
用吡虫啉 (LC10) 处理麦二叉蚜3龄若虫24 h后，差异性表达的P450基因表达量总和较对照组提高了约3.11倍，共有19个P450基因上调表达，其中，CYP2 clade和CYP3 clade家族的P450 基因表达量分别占上调总量的12.20%和43.41%；15个P450基因下调表达，其中，CYP3 clade家族的P450 基因表达量占总表达量的40.31%，无CYP2 clade家族P450下调表达 (图1A)。用氟啶虫胺腈 (LC10) 处理麦二叉蚜3龄若虫24 h后，差异性表达的P450 基因表达量总和较对照组提高了约10.47倍，共有18个P450基因上调表达，其中，CYP2 clade和CYP3 clade家族P450基因表达量分别占总表达量的14.11%和37.34%；15个P450基因下调表达，其中，CYP3 clade家族P450 基因表达量占总表达量的27.97%(图1B)。吡虫啉或氟啶虫胺腈诱导差异表达的麦二叉蚜上调和下调的P450基因见表2。
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表 2 受吡虫啉或氟啶虫胺腈影响的麦二叉蚜P450基因 Table 2 P450 genes ofS. graminumaffected by imidacloprid or sulfoxaflor |
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图 1 不同杀虫剂处理后麦二叉蚜P450 基因的表达量变化 Fig. 1 Expression of the different clades of P450 genes of S. graminum treated by different pesticides |
2.4 qPCR法验证麦二叉蚜P450基因表达 2.4.1 标准曲线
选择以吡虫啉处理的麦二叉蚜样品提取总RNA，以反转录所得的cDNA为模板按一定比例进行梯度稀释。看家基因 (28S和α-TUB) 和P450 基因分别按不同浓度模板进行qPCR。结果表明，麦二叉蚜看家基因 (28S和α-TUB) 以及P450基因的扩增效率具有一致性，且均接近2，故基因相对表达量的计算均使用2作为底数 (附加材料表S4)。
2.4.2 qPCR验证吡虫啉对麦二叉蚜P450基因表达的影响选择DGE文库显示的受吡虫啉影响程度不同的12个P450基因，通过qPCR测定其对吡虫啉的响应情况，继而验证转录组测序的结果。结果显示，10个P450基因表达受吡虫啉影响显著，2个表达未受吡虫啉影响，这与DGE文库结果基本一致 (图2)。
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图 2 P450 基因的荧光定量PCR验证 Fig. 2 Validation of P450 genes by qPCR |
3 结论与讨论
昆虫中的P450基因会被很多物质诱导上调或下调表达[29]。本研究结果表明，用防治麦蚜的杀虫剂吡虫啉和氟啶虫胺腈分别处理麦二叉蚜后，麦二叉蚜中很多P450基因产生了上调或下调的变化。
在麦二叉蚜转录组中共发现32个基因已被NCBI Refseq、Protein和SwissProt等数据库注释为线粒体CYP家族的P450基因，是数量较小的一个基因家族，主要分为2种类型：保守的P450 基因和快速进化的P450基因[29]。CYP314A1、CYP315A1和 CYP302A1属于线粒体CYP基因家族中的保守P450基因，在果蝇中发现，其很多线粒体CYP基因会参与昆虫激素合成代谢[30-31]。本研究结果表明，麦二叉蚜中有2个unigenes被NCBI Refseq、Protein和Swissprot等数据库注释为线粒体CYP家族315A1(3821-4) 和305A1(5247-1)，并且能够被吡虫啉或氟啶虫胺腈诱导而显著升高，表明麦二叉蚜315A1和305A1可能与昆虫激素合成或杀虫剂解毒代谢密切相关；有4个P450基因被NCBI Refseq、Protein和Swissprot等数据库注释为CYP2家族的基因。有报道指出，果蝇中CYP2家族的CYP18A1参与了蜕皮激素失活的过程[30]，而麦二叉蚜CYP18A1能够被吡虫啉或氟啶虫胺腈显著诱导，表明CYP18A1可能不仅与内源物质代谢相关，而且与外源物质代谢相关。有24个基因被NCBI Refseq、Protein和Swissprot等数据库注释为CYP3 家族，进一步分为CYP6 和CYP9 基因家族，该家族的P450基因被认为与杀虫剂等外源化合物的代谢有关[31]。本研究发现，麦二叉蚜中有6个属于CYP3家族的P450 unigenes (2792-2、2199-8、3482、7641、1826-3和5247-1) 表达量被吡虫啉或氟啶虫胺腈诱导升高。由此推测，麦二叉蚜对吡虫啉或氟啶虫胺腈的代谢也应与该家族的一些P450基因有着密切关系。有22个P450 基因被NCBI Refseq、Protein及SwissProt等数据库注释为CYP4家族的P450基因。本研究中，麦二叉蚜有4个CYP4家族的P450 基因 (1463-2、1826-3、3821-4和5247-1) 被吡虫啉或氟啶虫胺腈显著诱导，这与很多其他昆虫的CYP4家族P450基因能够被外源化合物所诱导相类似[29]。这些能被杀虫剂显著诱导的P450基因可能在蚜虫适应外源化合物的生理代谢功能中发挥着重要作用，具体功能仍需RNAi等技术进一步研究。
本研究利用Illumina RNA-seq测序技术对经吡虫啉或氟啶虫胺腈处理过的麦二叉蚜的转录组进行测序和分析，获得一批可能与吡虫啉或氟啶虫胺腈解毒代谢相关的P450基因序列，为深入开展麦二叉蚜适应杀虫剂进而形成抗性过程中P450基因功能和调控研究提供了丰富的数据资源。
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