2018, Vol. 20
反枝苋Amaranthus retroflexus L. 是玉米田主要阔叶杂草之一，其种子量大、适应性强、分布广泛，可严重影响农作物产量[1-2]。烟嘧磺隆 (nicosulfuron，结构式见图式 1) 属于乙酰乳酸合成酶 (ALS) 抑制剂类，是目前使用量最大的磺酰脲类除草剂品种之一，因其具有用量少、选择性强、对多数玉米品种安全、药效稳定且可与其他种类除草剂混用等优点，是目前玉米田杂草防治的主要药剂之一，在中国玉米田应用已有近20年历史[3]。但随着该药剂的长期、大量及重复应用，在中国部分玉米产区烟嘧磺隆对杂草的防效已出现下降趋势，尤其是对玉米田常见杂草反枝苋及马唐等已出现防治失败的现象[4]。
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图式1 烟嘧磺隆结构式 Scheme1 Structural formula of nicosulfuron |
靶标基因突变是杂草对除草剂产生抗性的最常见机理之一，迄今为止，已报道50余种杂草的8个ALS位点上共有超过 28 种氨基酸突变均可导致杂草对ALS抑制剂类除草剂抗药性的产生，因此ALS是突变类型最多的除草剂作用靶标[5]。Mei等研究了玉米田杂草马唐对烟嘧磺隆的非靶标抗性，发现马唐可能存在由P450s介导的代谢抗性[4]；Li等报道了马唐对烟嘧磺隆的靶标抗性，发现其突变位点为574位，突变形式为精氨酸替换色氨酸[6]。此外，陈金奕等研究了大豆田反枝苋对同为ALS抑制剂类除草剂的咪唑乙烟酸的抗性，发现其抗性倍数高达14~90[7]。但尚未见有关玉米田反枝苋对烟嘧磺隆抗性的研究报道。
本研究采用整株水平测定法检测了黑龙江省玉米田反枝苋对烟嘧磺隆的抗性水平，并进一步测定了其抗性和敏感种群ALS酶对烟嘧磺隆的敏感性差异，扩增、比对分析了抗性和敏感种群ALS基因差异，以期进一步明确反枝苋对烟嘧磺隆靶标抗性产生的分子机理，为玉米田阔叶杂草治理、科学合理用药以及延缓其抗性种群的发展提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 杂草种子反枝苋疑似抗性生物型 (HLJ-R) 种子于2017年9月采自黑龙江省嫩江县玉米田，敏感生物型 (TA-S) 采自山东省泰安市泰山区非耕地 (表1)。
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表 1 反枝苋种群采集地点及用药历史 Table 1 Collection sites of redroot pigweed seeds and the record of herbicide application |
1.1.2 药剂及试剂
95%烟嘧磺隆 (nicosulfuron) 原药，山东潍坊润丰化工股份有限公司。EasyTaq DNA Polymerase试剂盒及TIANgel Midi Purification Kit试剂盒，天根生化科技 (北京) 有限公司；Trans2K DNA Marker，北京全氏金生物技术有限公司；溴化乙锭 (ethidium bromide，EB)，美国Klontech公司；硫胺素焦磷酸 (TPP)，德国E.MERCK公司；黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)，美国Sigma公司；肌酸、3-羟基-2-丁酮 (乙偶姻Acetion)，阿拉丁试剂 (上海) 有限公司；考马斯亮蓝G-250和牛血清蛋白 (BSA)，上海伯奥生物科技有限公司；6 × DNA Loading Buffer、丙酮酸钠、甘油、二硫苏糖醇 (DTT)、苯甲基磺酰氟 (PMSF)、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 及4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液 (HEPES)，北京索莱宝科技有限公司；硫酸铵、氯化镁、1-萘酚、95%浓硫酸、95%乙醇、85%磷酸、氢氧化钠、磷酸氢二钾及磷酸二氢钾，天津市凯通化学试剂有限公司，均为分析纯。
1.1.3 主要仪器ASS-4 型自动控制农药喷洒系统，北京盛恒天宝科技有限公司; Eppendorf 5427R台式高速冷冻离心机，艾本德中国有限公司；GA110型1/100000电子天平，德国赛多利斯公司；T100 型梯度PCR仪，美国Bio-Rad公司；JY300C型电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；ChampGel 6000型紫外凝胶成像系统，北京赛智创业科技有限公司；3730型全自动DNA测序仪，美国ABI公司；BioTek Epoch酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。
1.2 试验方法 1.2.1 整株水平测定法分别选取均匀一致的反枝苋疑似抗性 (HLJ-R) 和敏感 (TA-S) 种群种子，直接点播于直径15 cm的塑料盆钵内，每盆播种 15粒，置于15~25 ℃、相对湿度75%、自然光照的温室中培养，常规水肥管理。待幼苗生长至2叶期时进行间苗，每盆留10株[8]。待植株生长至3叶期时进行茎叶喷雾处理，喷液量为 450 L/hm2，喷雾压力 275 kPa。根据预试验结果，确定HLJ-R种群烟嘧磺隆的施药剂量 (有效成分) 分别为30、60、120、240、480和960 g/hm2，TA-S种群分别为3、6、12、24、48和96 g/hm2。
于喷药后 21 d剪取反枝苋植株地上部分，烘干并称量干重，计算干重抑制率。按式 (1) 计算抗性倍数 (RI)。试验采用完全随机设计，每处理设3次重复，整体试验重复2次。
| ${\rm{RI}} = {\rm{G}}{{\rm{R}}_{50}}_{\left( {{\rm{HLJ}} {\text{-}} {\rm{R}}} \right)}/{\rm{G}}{{\rm{R}}_{50}}_{\left( {{\rm{TA}}{\text{-}}{\rm{S}}} \right)}$ | (1) |
式中：GR50为生长抑制中量 (g/hm2)。
1.2.2 DNA提取将反枝苋幼苗培养至3叶1心期，分别剪取HLJ-R和TA-S种群各15株的幼嫩叶片，迅速用液氮处理后置于 –80 ℃冰箱保存。采用CTAB法[9]进行叶片基因组DNA提取。
1.2.3 引物的设计合成与PCR扩增根据NCBI中GenBank登记的反枝苋ALS基因序列 (AF363369.1) 设计ALS基因的扩增引物，交由上海生工生物股份有限公司合成。引物序列为：a-F，CATCCATTTACGCTATCC；a-R，TTCCATCACCCTCTGTTA。扩增长度为1 870 bp，退火温度50 ℃。
PCR反应体系为25 μL：dd H2O 17.25 μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.25 μL，2.5 mmol/L的d NTPs 2 μL，10 × Easy Taq Buffer 2.5 μL，10 μmol/L a-F 1 μL，10 μmol/L a-R 1 μL，模板DNA 1 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共36个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。使用TIANgel Midi Purification Kit回收目的扩增片段，将回收产物送生工生物工程 (上海) 有限公司进行测序，测序结果通过DNAMAN v6软件进行抗性和敏感反枝苋植株ALS基因序列比对及差异性分析。
1.2.4 烟嘧磺隆对离体ALS活性抑制作用测定 1.2.4.1 ALS提取反枝苋ALS提取及活性测定参照Han等[10]和Yu等[11]的方法，并稍有改动。取5~6叶期反枝苋叶片4 g，置于液氮中快速研磨成粉，加入10 mL酶提取液 (0.1 mol/L、pH 7.5 的磷酸缓冲液，其中含10 mmol/L丙酮酸钠、0.5 mmol/L氯化镁、体积分数10%的甘油、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF、0.5 mmol/L TPP和10 μmol/L FAD以及体积分数0.5%的PVP)，涡旋振荡混匀，于4 ℃、25 000 × g下离心15 min；取10 mL上清液，4 ℃下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵至50%饱和度，于0 ℃下低速搅拌10 min，4 ℃下以25 000 × g离心20 min；弃上清液，沉淀用5 mL酶溶解液 (50 mmol/L、pH 7.5的HEPES缓冲液，其中含200 mmol/L丙酮酸钠、20 mmol/L氯化镁、2 mmol/L TPP以及20 μmol/L FDA) 溶解即得粗酶液，直接用于活性测定。试验包含2个生物学重复，每个处理重复 3 次。
1.2.4.2 烟嘧磺隆对ALS活性的抑制作用测定分别取100 μL粗酶液和100 μL不同浓度 (有效成分，0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000及10 000 μg/L) 的烟嘧磺隆药液于1.5 mL离心管中，轻轻混匀后于37 ℃ 恒温水浴暗反应 1 h，加入 40 μL、3 mol/L的硫酸终止反应，60 ℃水浴15 min脱羧。分别加入 190 μL体积分数为0.55%的肌酸和 190 μL体积分数为5.5%的甲萘酚，混匀后于 60 ℃水浴15 min显色。测定530 nm处反应所生成乙偶姻的吸光度值。试验同时设空白对照，在空白对照酶促反应体系中预先加入40 μL 3 mol/L的硫酸以灭活ALS。
1.3 数据处理采用SPSS 17.0软件，就2次试验所得数据进行误差分析，若2次试验结果差异不显著 (P > 0.05)，则合并后进行后续处理。利用SigmaPlot 12.5 软件的双逻辑非线性回归模型 y = C + {(D – C)/[1 + (x/GR50)b]}进行数据处理。式中：y为烟嘧磺隆不同使用剂量下所测杂草地上部分干重或酶活占对照的百分率；x为烟嘧磺隆使用剂量 (g/hm2或μg/L)；C 为剂量反应下限；D 为剂量反应上限；GR50表示生长抑制中量(g/hm2)[以IC50替换GR50，表示酶活性抑制中浓度 (μg/L)]；b 为斜率。
2 结果与分析 2.1 反枝苋对烟嘧磺隆的抗性水平室内整株水平测定结果表明，疑似抗性种群 (HLJ-R) 对烟嘧磺隆已产生中等水平抗性，抗性倍数为13.7 (表2)。
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表 2 反枝苋疑似抗性种群HLJ-R对烟嘧磺隆的抗性水平 Table 2 Resistance ratio to nicosulfuron of HLJ-R population of A. retroflexus |
2.2 烟嘧磺隆对反枝苋抗性和敏感种群ALS活性的抑制作用
靶标酶ALS敏感性测定结果表明，烟嘧磺隆对反枝苋抗性种群 (HLJ-R) ALS的IC50值是对敏感种群 (TA-S) ALS IC50值的43.9倍 (表3)。
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表 3 烟嘧磺隆对反枝苋抗性及敏感种群乙酰乳酸合成酶的抑制活性差异 Table 3 ALS activity diversity of HLJ-R population and TA-S population of A. retroflexus |
2.3 反枝苋抗性及敏感种群ALS基因差异
将反枝苋抗性种群HLJ-R及敏感种群TA-S的ALS核苷酸序列与模式植物拟南芥的ALS序列进行比对，结果表明：与TA-S种群相比，HLJ-R种群不同植株的ALS基因均发生了不同形式的突变 (表4)。其中，单株F3、F4、F6、F7、F8、F9、F10、F11和F12的ALS基因第616位碱基发生了突变，导致第205位氨基酸由丙氨酸 (Ala) 突变为缬氨酸 (Val)；单株F1、F5、F13、F15的ALS基因第 1 723位碱基发生了突变，导致第574位氨基酸由色氨酸 (Trp) 突变为亮氨酸 (Leu)。由此可见，反枝苋抗性种群ALS基因均发生了突变，且种群中不同株之间存在2种不同形式的突变，其中第205位基因突变的频率更高 (60%)。
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表 4 反枝苋抗性及敏感种群乙酰乳酸合成酶基因氨基酸序列 Table 4 The amino acid sequence of specific site in resistant and susceptive A. retroflexus population |
3 结论与讨论
基因突变是导致杂草抗药性产生的重要原因，目前有关由除草剂靶标酶基因氨基酸突变产生的杂草抗性方面的报道较多[12]。陈金奕等报道，反枝苋对咪唑乙烟酸 (imazethapyr) 已产生4.67倍的抗性，且其ALS基因的574位色氨酸突变是导致抗性产生的主要原因[7]。本研究所用的反枝苋疑似抗性种群HLJ-R采自黑龙江省嫩江县玉米田，有着多年烟嘧磺隆用药历史，通过整株水平法测定发现，其抗性倍数已达13.7。进一步通过离体ALS活性测定，发现烟嘧磺隆对反枝苋HLJ-R种群ALS活性的抑制作用IC50值是对TA-S种群IC50值的43.9倍。此外，在HLJ-R种群不同单株的ALS基因中同时检测到了205和574位2种突变类型，推测这可能是反枝苋对烟嘧磺隆产生抗性的重要原因之一。
近年来，已有多种杂草对ALS抑制剂类除草剂产生抗性的报道[5-8]。多数情况下，ALS基因靶标位点突变是导致抗性产生的主要原因[13]。到目前为止，共有 37种杂草ALS基因发生了第574和205位点的突变，其中32种杂草ALS基因第574位由色氨酸突变为亮氨酸，5种杂草ALS基因第205位由丙氨酸突变为缬氨酸[14]。ALS基因第574位是其活性中心构象的关键位点，若发生氨基酸突变则会导致构象改变，进一步导致除草剂结合位点的缺失[15]。发生在不同位点上的突变会导致杂草产生不同的多抗性谱。据报道，ALS第205位氨基酸突变会导致杂草对咪唑啉酮类药剂产生抗性，对磺酰脲类则表现为低抗或敏感；而其第574位氨基酸突变则会导致杂草对上述两类药剂同时产生抗性[15]。本研究中，反枝苋抗性种群HLJ-R ALS基因同时存在第574位或第205位突变，推测这可能是该种群对烟嘧磺隆产生抗性的重要原因。而其15个单株中，205位丙氨酸突变占60%，574位色氨酸突变占26.7%，可见其205位点的氨基酸更容易发生突变。这可能与不同抗性水平所对应的ALS突变位点不同有关[15]。
杂草对除草剂的抗性机制目前主要分为靶标抗性和非靶标抗性两大类[5]，非靶标抗性也是导致杂草产生抗药性的重要原因。本研究主要就反枝苋对烟嘧磺隆的靶标抗性机制进行了研究，至于其抗性产生中是否同时涉及非靶标抗性，则需进一步研究确定。
此外，反枝苋对烟嘧磺隆抗性的产生，除与其本身生物学特性有关外，还与玉米田不合理施用除草剂密切相关。因此，在实际农业生产中，将农业措施 (如玉米和大豆轮作) 与药剂防治措施相结合，合理选择并轮用不同作用机制的除草剂，是控制玉米田反枝苋危害及延缓其抗药性发生、发展的有效手段。
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