2018, Vol. 20
随着人们越来越重视污染物对土壤环境的影响，关于土壤有机物污染的风险评估研究得到更多的关注。传统化学方法只能提供土壤中目标污染物的含量，不能反映污染物对土壤生态系统产生的全部影响。土壤农药毒理学针对农药对土壤动植物、微生物的群落结构和种群特征的指标进行探索，进而研究其各项可量化的毒性指标，比如对目标生物的半致死毒性、体内生理生化指标及DNA损伤等，成为农药风险评估有效的补充[1]。
跳虫是土壤中的优势物种之一，具有易室内培养、个体小、繁殖率高、繁殖周期短、土壤适应性强、对污染物敏感及种类繁多等优势。因此跳虫的群落结构和种群特征常被作为土壤质量评估的指标[2-3]。国际标准化组织 (ISO) 在1999年规定了以白符跳Folsomia candida Willem为指示物种的土壤污染物检测标准操作方法[4]。近年来有很多以白符跳以及其他跳虫为研究对象的报道，涉及化学工业品 (包括农药) [5-8]、重金属[9-12] 和转基因作物[13-15]等多种土壤外源污染物，研究终端包括跳虫的生活史[16-17]、存活率[5, 7, 9, 10, 16]、繁殖率[7, 9, 10, 12]、卵孵化率[16]、体长增长[10]、回避和跳跃行为[8-9]、解毒代谢酶[13, 15]以及蛋白质表达和DNA损伤[5-6, 11, 14, 17-18]等。
氯虫苯甲酰胺 (chlorantraniliprole, CAP) 是由美国杜邦公司开发的具有新型邻甲酰氨基苯甲酰胺结构的广谱型杀虫剂，作用机制是其能够与昆虫鱼尼丁受体亚型 (ryanodine receptor，RyR) 选择性地结合，引起受体通道长期处于开放状态，使昆虫细胞内源Ca2+大量释放，从而引起害虫肌肉收缩，最终瘫痪甚至死亡[19-20]。CAP的选择性高，且与其他杀虫剂无交互抗性，可以防治几乎所有鳞翅目和部分半翅目、鞘翅目、双翅目等害虫，且在田间使用剂量下对非靶标生物如哺乳动物、鸟类、鱼类、微生物以及许多非靶标昆虫如天敌赤眼蜂等毒性极低，对蜜蜂安全[20-21]。然而近年来有研究表明，CAP对于土壤中的非靶标节肢动物 (如白符跳) 存在较大的繁殖毒性，并可影响其运动能力[22]，因此有必要进一步研究CAP对非靶标生物的毒性及作用方式。
本研究以外源添加CAP为单一污染胁迫物质，以2种跳虫白符跳 (世界广布种) 和奇裸长跳 (中国广布种) 为研究对象，测定CAP对它们的繁殖毒性，并进一步研究在亚致死浓度暴露下，不同时间段虫体内多种抗氧化胁迫应激指标，分析其与胁迫时间的效应关系，以期为土壤中CAP早期污染和风险评估提供预警，并为下一步研究CAP对非靶标动物的毒性机理拓宽思路。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 受试生物培养与同步化白符跳Folsomia candida由中国科学院上海植物生理生态研究所提供的丹麦种系扩大培养而来；奇裸长跳Sinella insolens由南京农业大学植物保护学院提供并扩大培养。按照ISO标准，培养基采用石膏和活性炭以质量比9 : 1混合，加入等体积的去离子水，放入培养皿内晾干后制成。每周添加去离子水，保持培养基湿润，饲喂酵母粉 (安琪) 2次。根据前期培养和观察的记录，白符跳和奇裸长跳生长繁殖最适宜温度不同，因此将2种跳虫分别置于16 h : 8 h循环光照温度分别为(20 ± 1) ℃和 (26 ± 1) ℃的人工气候箱中分别培养。
同步化：将大量成体跳虫转移至新鲜培养基内使其产卵，48 h后用吸虫器吸出所有成体跳虫，约7 d后跳虫卵基本孵化完成。除去未孵化的卵，并继续分别等待10 d(白符跳) 和7 d(奇裸长跳) 使其长大。试验时白符跳达10~12 d，奇裸长跳为7~9 d。
1.1.2 药剂及试剂95%氯虫苯甲酰胺 (CAP) 原药购自杜邦公司；丙酮 (分析纯) 购自南京宁试化学试剂有限公司。将CAP用丙酮配制成1.0×104 mg/L的储备液，于4 ℃冰箱保存，试验时用去离子水稀释至所需质量浓度。
水藓泥炭购自德国维特泥炭土有限公司，粉碎至无可见植物残体；高岭土购自上海市奉贤奉城试剂厂，高岭石质量分数不低于30%；石英砂购自汤山石英砂厂，50%以上为0.05~0.20 mm粒径的细小颗粒；碳酸钙 (分析纯) 购自天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.1.3 主要仪器ZDX-600智能光照培养箱 (宁波海曙赛福实验仪器厂)；DW-86L828超低温冰箱 (海尔公司)；5 430 R冷冻离心机 (Eppendorf公司)；a-1506紫外-可见分光光度计 (上海谱元仪器有限公司)；1 510酶标仪 (Thermo公司)。
1.2 试验体系预试验和正式试验使用的底物均为OECD人工土壤。其主要成分 (质量分数) 为10%的水藓泥炭、20%高岭土和70%石英砂，用碳酸钙将pH值调节至6.0 ± 0.5。药液配制好后与少量石英砂混合 (每千克土壤10 g石英砂)，置于通风橱内。待丙酮挥发后，将石英砂与土壤混合，再加入适量去离子水，保持水分含量在土壤干质量的30%~40%之间。
土壤配制完成后，按照每瓶30 g分别加入到体积为100 mL的烧杯中，铺平，老化24 h，以封口膜封口。
1.3 试验方法 1.3.1 繁殖毒性试验先进行预试验。设置每千克干土含有效成分0.1、1、10、100和1 000 mg (下面统一表述为 mg/kg) 5个剂量组和1个空白溶剂对照组，每组3个重复。在获得试验所需足量幼体跳虫并制备好染毒人工土壤之后，在每只烧杯内放入同步化后的跳虫 (白符跳孤雌生殖，10只；奇裸长跳两性生殖，20只，雌雄各半)，加入约2 mg干酵母到土壤表层并以封口膜封口。将烧杯放入温度分别为 (20 ± 1) ℃和 (26 ± 1) ℃、昼夜循环16 h : 8 h、光照度为400 lx的光照培养箱中。每周开盖1次以换气和补充干酵母和去离子水，培养结束时用水悬浮的方法将跳虫从人工土壤中分离出来拍照并计数。培养时间：白符跳28 d；奇裸长跳21 d。28 d足够白符跳产2批卵并孵化出幼虫，而21 d足够奇裸长跳产2批卵并孵化出幼虫。
正式试验设置6个剂量组，每组6个重复，试验方法与预试验方法相同。对于白符跳，CAP的剂量设置为4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg/kg，对于奇裸长跳，预试验结果显示EC50 > 1 000 mg/kg，根据ISO标准，设置CAP限度试验浓度为1 000 mg/kg以确认。对照组为溶剂对照组。
1.3.2 CAP对抗氧化防御系统的影响对于每种跳虫，分别设置EC50-repro的10%浓度，以及溶剂对照组，每组设置25个平行，每个平行放入150~200只同步化后的跳虫幼虫。试验开始后，分别于0、2、4、6和10 d时从各平行中随机选取5瓶，采用水悬浮法将跳虫分离出来，放入研钵，加入少许液氮冷冻，使跳虫快速死亡。用少量质量分数为0.9%的预冷生理盐水 (4 ℃) 洗净，吸水纸擦干。加入500 μL生理盐水，研磨至无可见残体后，放入1.5 mL离心管中，于4 000 r/min下冷冻离心10 min，上清液即为酶液。取出上清液分装，置于 –80 ℃冰箱冷冻，待测。
总蛋白含量测定：考马斯亮蓝比色法。
过氧化氢酶 (catalase, CAT) 活性测定：钼酸铵比色法。
谷胱甘肽还原酶 (glutahione reductase，GR) 活性测定：通过检测NADPH的改变，计算GR活力。
总谷胱甘肽 (total glutathione, TG) 活性测定：利用DTNB的循环反应，测定总谷胱甘肽 (TG) 和氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 的活性。
谷胱甘肽-S-转移酶 (glutahione-S-transferase，GST) 活性测定：1-氯-2，4-二硝基苯比色法。
脂质过氧化物 (lipid peroxidation, LPO) 含量测定：显色试剂反应。
金属硫蛋白 (metallothionein，MT) 含量测定：采用ELISA竞争法。
以上测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。所有测定和计算均按照试剂盒说明书指示进行。
1.4 数据处理试验数据采用Microsoft Excel (2016) 进行数据统计，GraphPad Prism 7.00作图。
使用DPS7.05(浙江大学) 计算求得CAP对跳虫的繁殖率半抑制浓度EC50-repro和95%置信区间。采用SPSS 19.0软件作相关性分析，ANOVA单因素方差分析各组死亡率和幼虫数显著性差异、t-检验分析抗氧化酶处理组显著性差异，以字母表示。字母不同者表示差异显著 (P < 0.05)。
2 结果与分析 2.1 CAP对两种跳虫的繁殖毒性试验繁殖毒性试验后，对照组中2种成体跳虫回收率 (试验结束后的跳虫数占试验开始前跳虫数的百分比) 分别为88.3%和86.7%，各瓶繁殖跳虫幼体个数平均大于150只。对于白符跳，随着CAP剂量升高，处理组成虫死亡率逐渐增加，但各处理组死亡率均未超过50%。与之相应的白符跳幼虫数则随着CAP剂量的升高而减少，剂量最高组的幼体数相比对照组减少96.6% (表1)。奇裸长跳组设置的剂量为1 000 mg/kg，试验结束时成虫数16.67 ± 1.63(对照：17.33 ± 1.21) 只，幼虫数168.8 ± 22.3(对照：174.7 ± 20.7) 只，各平行与对照组中的成体与幼体数量没有显著差异 (P > 0.05)。结果显示，白符跳的 28 d-EC 50-repro为 0.533(95%置信限0.370~0.769) mg/kg，回归方程为y = 5.46 + 1.70x，R2 = 0.956；奇裸长跳21d-EC50-repro为 > 1 000 mg/kg。
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表 1 CAP对白符跳成虫和幼虫数量的影响 Table 1 Influence of CAP on numbers of adult and juvenile F.candida |
2.2 CAP对抗氧化防御系统的影响
根据繁殖试验结果，设置白符跳处理剂量为0.053 3 mg/kg，奇裸长跳处理剂量为100 mg/kg。10 d的试验结束后，各处理组和对照组的跳虫成活率在90%~95%之间，回收率在85%~90%之间。随着暴露时间延长，跳虫不断长大，对照组在不同时间点的各项酶活性数据可能存在差异[12]，因此对于对照组的跳虫也在相应的时间点取样测定。
2.2.1 CAT活性变化如图1所示，CAT的活性在2种跳虫的处理组中均出现了先显著上升再下降的过程，到第10天时基本恢复至略高于照组水平，与对照组没有显著差异 (P > 0.05)，处理组CAT活性最高点发生在第2天，其中白符跳组升幅较高，相比对照组提高了113%；奇裸长跳组升幅为108%。
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注：图中数据为平均值 ± 标准误差，n=5。字母a、b、c分别表示处理组与对照组存在显著性差异、各处理组与0 d数值存在显著性差异、对照组与0 d数值存在显著性差异 (P < 0.05)。 Note：Data are presented as mean ± SE, n=5. Significant differences (P < 0.05) are defined as: a-comparison between control and treatment, b-comparison between day 0 and the other exposure time for treatment, c-comparison between day 0 and the other exposure time for control. 图 1 两种跳虫在CAP暴露下CAT的活性变化 Fig. 1 CAT levels in two springtails exposed to CAP |
2.2.2 GR活性变化
如图2所示，试验过程中，2种跳虫处理组的GR活性整体呈现先上升后下降的变化趋势。2 d时，白符跳处理组的GR水平与对照差异相比提高了108%，第4天升幅最高，达141%，呈现较为明显的时间-效应关系。至暴露4 d后，GR活性渐渐下降趋于平缓，第6天、第10天处理组与对照组之间无显著差异 (P > 0.05)。而奇裸长跳处理组GR提高略少，2 d升幅为74.6%，达到最高点。第4天开始，随着暴露时间延长，处理组GR活性不断降低，至第6天时显著低于对照组 ( P < 0.05)，试验结束时恢复至对照组水平。
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注：图中数据为平均值 ± 标准误差，n=5。字母a、b、c分别表示处理组与对照组存在显著性差异、各处理组与0 d数值存在显著性差异、对照组与0 d数值存在显著性差异 (P < 0.05)。 Note：Data are presented as mean ± SE, n=5. Significant differences (P < 0.05) are defined as: a-comparison between control and treatment, b-comparison between day 0 and the other exposure time for treatment, c-comparison between day 0 and the other exposure time for control. 图 2 两种跳虫在CAP暴露下GR的活性变化 Fig. 2 GR levels in two springtails exposed to CAP |
2.2.3 TG活性变化
如图3所示，总谷胱甘肽 (TG) 活性在CAP暴露过程中缓慢上升，相比其他指标升幅较少。对照组中TG活性随时间变化不大。白符跳处理组中TG活性整体呈现先轻微上升后下降的变化趋势，CAP的诱导表达最高峰发生在第6天，升幅为48.7%，低于奇裸长跳组 (80.6%)。至暴露10 d后，白符跳组的TG水平仍显著高于对照组 (P < 0.05)，奇裸长跳处理组与对照组在第10天的TG水平无显著差异 ( P > 0.05)。两种跳虫的GSSG水平在10 d过程中受到CAP的持续诱导激活，基本保持上升趋势，直至试验结束的第10天，与对照相比，白符跳的GSSG活性升幅为243%，奇裸长跳的升幅为60.2%( 图4)。
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注：图中数据为平均值 ± 标准误差，n=5。字母a、b、c分别表示处理组与对照组存在显著性差异、各处理组与0 d数值存在显著性差异、对照组与0 d数值存在显著性差异 (P < 0.05)。 Note：Data are presented as mean ± SE, n=5. Significant differences (P < 0.05) are defined as: a-comparison between control and treatment, b-comparison between day 0 and the other exposure time for treatment, c-comparison between day 0 and the other exposure time for control. 图 3 两种跳虫在CAP暴露下TG的活性变化 Fig. 3 TG levels in two springtails exposed to CAP |
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注：图中数据为平均值 ± 标准误差，n=5。字母a、b、c分别表示处理组与对照组存在显著性差异、各处理组与0 d数值存在显著性差异、对照组与0 d数值存在显著性差异 (P < 0.05)。 Note：Data are presented as mean ± SE, n=5. Significant differences (P < 0.05) are defined as: a-comparison between control and treatment, b-comparison between day 0 and the other exposure time for treatment, c-comparison between day 0 and the other exposure time for control. 图 4 两种跳虫在CAP暴露下GSSG的活性变化 Fig. 4 GSSG levels in two springtails exposed to CAP |
2.2.4 GST活性变化
CAP持续10 d的暴露过程中，2个处理组GST活性整体呈现先降低后升高，逐渐趋于平稳的变化趋势，如图5所示。与对照组相比，暴露0~4 d期间处理组的GST活性均受到了抑制，与暴露时间呈负相关性。其中，白符跳组GST活性降幅较大 (38.4%，奇裸长跳：21.6%)。6 d后随着暴露时间进一步延长，对照组和处理组中2种跳虫GST活性均不同程度地上升，直至暴露第10 天，对照组与处理组的GST活性水平接近，CAP对GST活性影响与对照差异不显著 (P > 0.05)。
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注：图中数据为平均值 ± 标准误差，n=5。字母a、b、c分别表示处理组与对照组存在显著性差异、各处理组与0 d数值存在显著性差异、对照组与0 d数值存在显著性差异 (P < 0.05)。 Note：Data are presented as mean ± SE, n=5. Significant differences (P < 0.05) are defined as: a-comparison between control and treatment, b-comparison between day 0 and the other exposure time for treatment, c-comparison between day 0 and the other exposure time for control. 图 5 两种跳虫在CAP暴露下GST的活性变化 Fig. 5 GST levels in two springtails exposed to CAP |
2.2.5 LPO含量变化
CAP暴露激发了2种跳虫的氧化防御系统，引起细胞脂质的过氧化。LPO含量的变化与CAT和GR变化趋势类似，2种跳虫处理组的LPO水平在0~4 d内均产生幅度较小的上升 (< 60%)，直至第6天时出现了轻微回落，并保持下降趋势，直至10 d后恢复到与对照组无显著差异 (P > 0.05)，如 图6所示。
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注：图中数据为平均值 ± 标准误差，n=5。字母a、b、c分别表示处理组与对照组存在显著性差异、各处理组与0 d数值存在显著性差异、对照组与0 d数值存在显著性差异 (P < 0.05)。 Note：Data are presented as mean ± SE, n=5. Significant differences (P < 0.05) are defined as a-comparison between control and treatmen, b-comparison between day 0 and the other exposure time for treatment, c-comparison between day 0 and the other exposure time for control. 图 6 跳虫在CAP暴露下LPO含量变化 Fig. 6 LPO content in two springtails exposed to CAP |
2.2.6 MT含量变化
CAP暴露后10 d内，2种跳虫的处理组MT含量均未出现较为显著的上升或下降趋势，与对照组无显著差异 (P > 0.05)( 图7)。
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注：图中数据为平均值 ± 标准误差，n=5。字母a、b、c分别表示处理组与对照组存在显著性差异、各处理组与0 d数值存在显著性差异、对照组与0 d数值存在显著性差异 (P < 0.05)。 Note：Data are presented as mean ± SE, n=5. Significant differences (P < 0.05) are defined as a-comparison between control and treatment, b-comparison between day 0 and the other exposure time for treatment, c-comparison between day 0 and the other exposure time for control. 图 7 跳虫在CAP暴露下MT的含量变化 Fig. 7 MT content in two springtails exposed to CAP |
3 结论与讨论 3.1 CAP对跳虫繁殖毒性的影响
在农药的施药区域，较少量的污染也可能造成土壤环境优势动物种群的变化，进而影响土壤中生物的多样性。Bur等和董继新等报道，同一种污染物暴露下，不同的土壤类型和土壤特点，比如土壤的有机质含量 (OM)、pH值、阳离子交换量 (CEC) 等特征对于跳虫的毒性、行为等毒理学指标有着较大程度的影响[23-25]。根据本文作者的另一项研究，采取不同类型的土壤作为试验体系，如湖南红壤、北京潮土、吉林黑土和南京黄壤，CAP对白符跳的毒性数据差异可达数倍，甚至10倍以上 (未发表数据)。因此，本研究采用配比一致的人工土壤作为试验体系，以消除自然土壤对试验结果可能产生的影响，并有利于将不同化合物对跳虫的毒性数据进行比较。
作为生物体应对外界污染的措施之一，繁殖率的变化会直接影响种群的数量。因此繁殖率作为亚致死剂量水平研究的指标一直是土壤污染物毒性研究的一个重要指示因子。根据ISO11267规定，对于化学品设置1 000 mg/kg dw为浓度上限[4]。本研究中CAP对白符跳和奇裸长跳的EC50-repro分别为0.533 mg/kg dw和 > 1 000 mg/kg dw。根据ISO11268 [26]，参照农药对另一种土壤模式动物——赤子爱胜蚓的急性毒性，按14 d-LC50大小分为4个等级：低毒 (LC50 > 10)、中毒 (1.0 < LC 50 ≤ 10)、高毒 (0.1 < LC 50 ≤ 1.0) 和剧毒 (LC50 ≤ 0.1)(单位mg/kg)，则CAP对白符跳的繁殖毒性为高毒，对于奇裸长跳则为低毒。Lavtižar等[22]报道人工土壤中CAP对白符跳的28 d-EC50-repro值为0.14 mg/kg dw，本研究结果与之较接近。Lavtižar等认为，CAP对白符跳的毒性较高，与靶标昆虫接近，远高于其他土壤动物，原因可能是弹尾纲与昆虫纲亲缘关系较近；然而本研究发现，CAP对于同属于弹尾纲的奇裸长跳毒性较低，是否与两种跳虫的食性、在土壤中的生态位不同 (白符跳生活在土壤中，弹器不够发达，迁徙能力不强，取食菌丝体；奇裸长跳生活在土壤表层，弹器发达，活动能力强，取食枯枝落叶) 有关[23]，需要进一步研究。
3.2 CAP对跳虫抗氧化防御系统影响生物体接触到污染物或降解产物后，对其进行代谢过程中会产生大量具有强氧化能力的中间产物，如活性氧中间体 (ROS)、氧自由基等。在未受污染前，生物体产生和清除ROS和自由基的过程处于动态平衡状态。但当外源性污染物进入生物体，平衡被打破，ROS便会持续产生积累，自由基不断增加，进而对生物体内的蛋白质、细胞脂质和DNA等生物大分子造成伤害，导致细胞和组织的损伤，严重时会造成生物体的死亡[27]。作为ROS和自由基的去除系统，抗氧化防御系统在参与活性氧和自由基的清除以及机体的保护性防御反应中发挥巨大作用，可为污染物胁迫下的机体氧化应激提供指示信息。因此，对于CAP这一类新型农药，研究其对生物体的氧化胁迫作用不仅能够客观分析污染物的毒性水平和效应，同时也有助于掌握其毒性机制。
当跳虫受到亚致死剂量的CAP施加的短期氧化胁迫时，抗氧化生物标志物CAT、GR、GST、TG和LPO受到不同程度的激发，说明跳虫机体对CAP产生了氧化胁迫响应，随着时间的延长，机体又产生了一个逐渐适应、响应幅度逐渐下降的过程。如CAT的活性随着暴露时间的延长出现先升高后下降再趋于平稳的趋势，而且响应的速度很快，上升幅度较大。暴露初期跳虫体内积累过量的H2O2，而CAT的功能是将H2O2分解为水和氧气，因此CAT水平也随之上升，第2天即达到最高水平。机体产生自由基和清除自由基的速度较快，CAT的水平在到达顶峰时即出现缓慢回落。短期内CAT活性应激增加是虫体为克服CAP胁迫和防止自身中毒的防御机制；随着胁迫时间延长，胁迫程度增大，到第6天和第10天，CAT活性降低，虫体内防御机制受氧化损伤和农药毒害作用下降，直至活性与对照组差异不大。Stebbing[28]认为，这种现象可称为机体的“毒物兴奋效应”：低浓度的外源污染物诱导细胞产生自由基，从而导致抗氧化酶活性的升高；而暴露时间较长之后，效果可能类似于高浓度污染物短期内的效应，增加自由基反应速率，使得那些未被及时清除的自由基损坏细胞并破坏其结构，加速机体的衰竭，最终导致抗氧化酶的活性降低。CAT水平的上升或下降同样可见于其他农药或重金属对于跳虫的胁迫效应[29-30]。因此CAT可作为污染物对土壤进行短期胁迫的生物标志物，用于监测土壤农药早期污染。
抗氧化系统中抗氧化酶GR和GST在清除机体正常代谢及外因引起环境胁迫产生的自由基方面相互协调、促进。GR在生物体的氧化还原反应中具有举足轻重的地位，其作用是催化氧化性谷胱甘肽 (GSSG) 转变为还原型谷胱甘肽 (GSH)。本研究中，与CAT相似，GR的响应速率较快，上升幅度也较大。总谷胱甘肽 (TG) 包括GSSG和GSH，其中GSH是主要的活性状态，占绝大多数。本研究仅用了亚致死剂量CAP进行暴露试验，因此观察到的现象是CAT和TG被诱导，未出现抑制现象。由于TG的总量出现了缓慢增长，GSSG增加幅度较大，故从试验开始到2 d、4 d，GSH呈下降趋势，后期 (6 d) 由于TG出现激发，虽然GSSG也保持较高的浓度，但由于GSSG占比较小 (不到10%)，GSH的含量则呈现上升趋势。直至10 d后，TG含量在白符跳体内较为稳定，在奇裸长跳体内略下降。GSSG水平的上升，有可能是因为细胞调动GSH来抵御ROS和自由基，生成较多的GSSG。在GR作用下，GSH扮演了羟基自由基的“清道夫”角色[31]。
同时，GSH也被GST利用来结合反应物或代谢物[32]。GST广泛存在于生物体各组织中，催化GSH与化学物质的亲电子基团结合，最终形成硫醚氨酸排出体外，具有清除体内过氧化物及解毒的双重功能。本研究中，白符跳在暴露于CAP 4 d内，体内GST水平快速下降，第4天后慢慢恢复。奇裸长跳体内的GST活性变化趋势与白符跳一致，但变化幅度较小。Rodrigues等[29]报道，环境浓度CAP造成生物体内ROS的积累，由于GSH的消耗，作为解毒酶的GST受到了显著抑制。对于跳虫来说，短期暴露于低浓度CAP，体内的CAT、GR、TG和LPO受到激发，GST受到抑制，反映了跳虫机体对于CAP产生的氧化胁迫响应较快，尤其在4 d内发生GSSG上升、GSH下降的过程，导致了GST的下降。GST降低至一定水平后慢慢回升至对照组水平，说明CAP胁迫对跳虫毒害作用累积到一定程度后，虫体GST解毒酶系统从无法及时解毒到系统平衡被打破到恢复解毒能力，最终回到平衡状态。GST活性变化较快，下降幅度较大，适合作为污染物早期预警的标志物。
跳虫暴露于CAP后，除了激活一系列酶，也导致较为严重的脂质损伤—脂质过氧化。跳虫细胞膜的磷脂类含有大量不饱和脂肪酸，由于它们的不稳定性，脂质膜的二硫键氧化导致了膜的穿透性降低，产生细胞毒性和细胞损伤。脂质过氧化可作为细胞和组织中氧化应激的指标。Rodrigues等[29]报道，在短期暴露于环境浓度 (9.6 μg/L) 的CAP中，摇蚊的LPO水平未受到显著影响。本研究中，跳虫受CAP胁迫时，体内LPO含量在6 d内缓慢增加，最终在抗氧化酶的作用下恢复平衡。虽然在试验过程中短暂回落，但整体水平高于对照组且逐渐上升。LPO水平的增幅小于其他抗氧化酶，说明相对于其他较敏感的上升指标，如GR和CAT，LPO可能更适用于作为中长期低浓度或较高浓度的污染物暴露指示因子。
作为金属“清道夫”的金属硫蛋白 (MT)，在重金属对生物的研究中报道相对较多[11]。重金属暴露往往会造成跳虫体内基因表达和蛋白分泌的异常，如Nakamori等[18]发现镉污染能引发白符跳体内编码金属硫蛋白的mRNA异常表达；Nota等[11]也报道4种金属 (Cd、Ba、Co和Zn) 能造成MT的表达。基因表达研究显示，白符跳在暴露于重金属镉2 d后，即出现MT的表达基因上调，4 d后下降，然而游离态的MT则在6 d之后才能检测到[33]。农药对跳虫也可能存在类似的作用，Falfushynska发现，有些农药可能会类似Cd等重金属刺激生物体产生金属硫蛋白[34]。本研究中，白符跳的MT水平在10 d内与对照组的差异均不显著，因此，可以认为MT对CAP并不敏感，MT水平与CAP暴露剂量和时间没有明显的相关性。
总的来说，繁殖毒性试验结果显示，氯虫苯甲酰胺对于土壤中的白符跳毒性较大，白符跳可以作为CAP土壤污染的指示生物，对于同一类型土壤，白符跳种群的数量可在一定程度上反映CAP的污染程度。
短时间的低剂量CAP暴露下，较好的灵敏的生物标志物指标为CAT、GR和GST，而可作为中长期指标的是TG和LPO。MT暂不适用于CAP污染试验。土壤中CAP的半衰期较长，可达数百天，可以考虑运用这些指标，以土壤跳虫为对象评价中国土壤中CAP污染现状。
本研究相关的生物标志物以及金属硫蛋白的检测已经被充分地研究和证实，是研究污染物暴露的新手段，将来可能会和抗氧化物基因表达、DNA损伤等一起，作为污染物毒理学常规的研究指标。
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