2018, Vol. 20
乙烯利，化学名称为2-氯乙基磷酸，是一种低毒、高效的植物生长调节剂，具有打破植物休眠、促进果实成熟等作用，常用于水果催熟[1-2]。有研究表明，乙烯利具有神经毒性、对皮肤、眼睛有刺激作用，对粘膜有酸蚀作用，长期食用会引起慢性中毒或病变[3-4]。因此，中国已规定乙烯利在22种农产品中的最大残留限量[5]。目前，关于乙烯利的检测方法主要有离子色谱法[6]、液相色谱-串联质谱法[7-8]、顶空-气相色谱法[9-10]、自动电位滴定法[11]和重氮甲烷衍生化-气相色谱法[12]等。其中离子色谱法为半定性分析；液相色谱-串联质谱成本高，普及度低，在未知物质的确认上存在不足；顶空-气相色谱法重现性较差，适用范围较窄；电位滴定法检测灵敏度较低，回收率较低，重现性较差。乙烯利碳链较短，极性较强，在色谱柱上保留效果差[13]，对其进行衍生化后再用色谱检测可以克服上述不足。目前，对于磷酸或羧酸类化合物常用的硅烷化试剂主要有N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）和重氮甲烷等，其中MTBSTFA衍生化需在45℃干燥箱中反应至少1 h，耗时长，且反应体系中的乙腈对色谱柱有损害[14]；而重氮甲烷衍生化法具有反应迅速、成本低、副产物较少等优势，但其存在制备过程复杂、易燃易爆、毒性较大，制备后不宜长期存放，且衍生化产物相对分子质量较小，定性不准等不足[12, 15]。因此迫切需要一种低毒且易得的衍生化试剂来替代。三甲基硅重氮甲烷是在重氮甲烷的活泼氢位置引入了三甲基硅（TMS）基团，致使其衍生化产物的相对分子质量增大，色谱检测时可降低背景噪音；同时由于衍生化产物具有高度的立体选择性[16]，更利于质谱定性分析；此外，市售产品通常是其正己烷或乙醚溶液，安全且毒性小。鉴于此，笔者选择以三甲基硅重氮甲烷为衍生化试剂，建立了用三甲基硅重氮甲烷衍生化-气相色谱火焰光度检测器检测果蔬中乙烯利残留的方法，采用气相色谱-质谱联用法对衍生化产物进行定性分析，对衍生化条件进行了优化。旨在为果蔬中乙烯利残留检测方法的标准化提供技术支持。
乙烯利的衍生化反应见图式1。
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图式1 三甲基硅重氮甲烷与乙烯利的衍生反应 Scheme1 The derivatization of ethephon using (trimethylsilyl)diazomethane |
1 材料与方法 1.1 供试材料
2010-Plus气相色谱仪并配有火焰光度检测器 (GC-FPD，日本岛津公司)；5980B+5977气相色谱-质谱仪 (美国安捷伦公司)。乙烯利 (ethephon) 标准品 (纯度98.5%，Dr. Ehrenstorfer公司)。甲醇和无水乙醚均为色谱纯 (Sigma公司)。三甲基硅重氮甲烷 (含0.6 mol/L己烷溶液，梯希爱 (上海) 化成工业发展有限公司)。辣椒、番茄、香蕉、苹果和梨样品购自山东济南某超市。
1.2 样品前处理 1.2.1 提取分别称取匀浆好的辣椒、番茄、香蕉、苹果和梨的样品10 g (精确至0.01 g) 于50 mL聚乙烯离心管中，加入0.5 mL V (甲醇) : V (盐酸) = 9 : 1的溶液和20 mL甲醇，涡旋5 min，超声提取20 min，于8 000 r/min下离心5 min；取上清液，过滤至50 mL聚乙烯容量瓶中，残渣再用20 mL甲醇提取1次。合并提取液，用甲醇定容至50 mL。
1.2.2 衍生化准确吸取10 mL提取液于15 mL聚乙烯离心管中，在干燥氮气流下于30~35 ℃水浴浓缩至约1.5 mL，加入0.5 mL V (甲醇) : V (盐酸) = 9 : 1溶液和8 mL无水乙醚，混合均匀，静置10 min；移取上清液于聚乙烯离心管中，残渣再用1 mL无水乙醚萃取2次，合并萃取液并入上清液中，于30~35 ℃水浴浓缩至约1 mL。在通风柜内，向浓缩液里加入50 μL三甲基硅重氮甲烷溶液，密封静置15 min。将反应液在干燥氮气流下于30~35 ℃水浴浓缩至近干，用1 mL正己烷复溶后，待测。
1.3 检测条件色谱条件：DB-1701 19091J-413色谱柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；柱箱程序升温：50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃，以30 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；进样口温度280 ℃；火焰光度检测器 (磷滤光片)；检测器温度300 ℃；载气 (N2) 流速1.0 mL/min；不分流进样；进样量1.0 μL。
质谱条件：全扫描 (SCAN，用于碎片确证) 和选择离子模式 (SIM，用于线性关系确证)。载气 (He) 流速为1.0 mL/min，恒流模式，不分流进样，0.75 min后打开分流阀，电子轰击电离源 (EI) 70 eV。离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃。溶剂延迟5 min。色谱柱及程序升温同气相色谱。
1.4 标准溶液配制及其衍生化准确称取适量乙烯利标准品，用甲醇配制成1 000 mg/L的标准储备液。根据需要再用甲醇稀释成0.01~2 mg/L的乙烯利标准溶液。按照1.2节的条件处理，GC-FPD检测，外标法定量，以目标物的质量浓度为横坐标 (x)，相应的峰面积为纵坐标 (y)，绘制标准曲线。
2 结果与讨论 2.1 衍生化产物的气相色谱-质谱分析确证对所制备的乙烯利衍生化产物进行质谱全扫描，确定其保留时间为12.404 min。其总离子流图和在全扫描模式下的碎片图分别见图1和图2。
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图 1 乙烯利标准品衍生化产物的总离子流图 Fig. 1 Total ion chromatogram of ethephon standards |
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图 2 全扫描模式下乙烯利标准品衍生化产物的质谱图 Fig. 2 Spectra of ethephon standards in full scan mode |
由图2可知：衍生化产物经电子轰击电离产生了特征碎片离子m/z 316、m/z 243、m/z 129、m/z 213、m/z 155和m/z 169等。其中m/z 243为基峰，m/z 129为次强峰，m/z 316相对丰度较低。乙烯利衍生化产物的相对分子质量为316，验证了乙烯利是在磷酸的2个酸性位置上发生了三甲基硅甲基化反应。m/z 316的分子离子峰失去1个-Si(CH3)3生成m/z 243的碎片离子；失去 -O-CH2-Si(CH3)3生成m/z 213的碎片离子；m/z316的分子离子峰失去2个 -Si(CH3)3基团，伴随着2个C-Si键的断裂，发生重排生成m/z 169的碎片离子；失去1个 -CH-Si(CH3)3和-Si(CH3)3基团，伴随着C-O键和C-Si的断裂，发生重排生成m/z 155的碎片离子；失去-CH-Si(CH3)3和 -O-CH-Si(CH3)3基团，伴随着C-O键和P-O的断裂，发生重排生成m/z 129的碎片离子。
用选择离子模式检测m/z 243、129、213、155、169和316共6种离子，将不同浓度梯度的标准溶液的衍生化产物分别进样，根据总离子流图的峰面积绘制标准曲线，发现线性关系良好，从而确证衍生化产物正确。从空白样品的乙烯利衍生图谱中发现，在其保留时间附近没有干扰，说明质谱对该分析物具有较高的选择性。
2.2 衍生化条件的优化 2.2.1 衍生化试剂用量的选择在其他试验条件相同的情况下，以1 mL 1 mg/L的乙烯利标准溶液分别与不同体积的三甲基硅重氮甲烷反应15 min，在GC-FPD上测得衍生化产物的峰面积，以三甲基硅重氮甲烷用量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标作图，考察三甲基硅重氮甲烷用量对衍生效果的影响。结果 (图3) 表明：随着三甲基硅重氮甲烷用量的增大，其峰面积逐渐增大，当用量大于50 μL时，峰面积基本不变，此时反应不再产生氮气，溶液呈现黄色，为了避免浪费和减少环境污染，确定三甲基硅重氮甲烷用量为50 μL。
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图 3 三甲基硅重氮甲烷用量对衍生反应的影响 Fig. 3 The effect of the amount of (trimethylsilyl) diazomethane on the derivatization reactions |
2.2.2 衍生化时间的确定
在其他试验条件相同的情况下，以50 μL三甲基硅重氮甲烷与1 mL 1 mg/L的乙烯利标准溶液分别反应不同时间，采用GC-FPD测定，以衍生化时间为横坐标，三甲基硅重氮甲烷峰面积为纵坐标作图，考察衍生化时间对衍生效果的影响。结果表明 (图4)：随着衍生化时间的增加，三甲基硅重氮甲烷峰面积增大，但当衍生化时间大于15 min后，峰面积变化甚微，最终选择衍生化时间为15 min。
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图 4 衍生化时间对衍生化反应的影响 Fig. 4 The effect of derivation time on the derivatization reactions |
2.3 分析方法评价 2.3.1 标准曲线
结果显示：在0.01~2 mg/L范围内，乙烯利的质量浓度与对应的峰面积间线性关系良好，相关系数大于0.999。
2.3.2 方法检出限及定量限在辣椒、番茄、香蕉、苹果和梨的空白样品中分别添加0.01 mg/kg的乙烯利标准溶液，采用GC-FPD测定，确定本方法乙烯利的检出限为0.01 mg/kg，定量限为0.03 mg/kg。中国规定乙烯利在果蔬中的最大残留限量 (MRL) 为1~20 mg/kg[5]，该方法可满足实际检测的要求。典型色谱图见图5和图6。
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图 5 乙烯利标准溶液色谱图 (0.5 mg/L) Fig. 5 Chromatogram of ethephon standard with the concentration of 0.5 mg/L |
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图 6 梨空白样品及添加0.01 mg/kg 乙烯利后的叠加色谱图 Fig. 6 Overlapping chromatograms of pear blank samples and spiked with 0.01 mg/kg ethephon |
2.3.3 方法的准确度和精密度
在辣椒、番茄、香蕉、苹果和梨的空白果蔬样品中分别添加 0.01、0.1 和 1 mg/kg 3 个水平的乙烯利标准溶液，每个水平重复 7 次，按上述试验方法进行测定。结果显示：在 3 个添加水平下，乙烯利的回收率在 93%~102% 之间，相对标准偏差 (n = 7) 在 4.2%~7.3% 之间，符合农药残留分析要求[17]。
2.4 实际样品的检测应用本研究建立的方法对市售辣椒、番茄、香蕉、梨和苹果48个批次的样品进行了检测。结果显示：仅辣椒样品检出1批次，残留量为0.095 mg/kg，远低于中国规定的MRL值5 mg/kg。
3 结论本研究建立了三甲基硅重氮甲烷衍生化-气相色谱测定果蔬中乙烯利残留的检测方法，采用商品化、低毒且易得的三甲基硅重氮甲烷为衍生化试剂对乙烯利进行衍生化，操作过程安全、分析灵敏度和精密度高、定性与定量准确，适合于多种蔬菜、水果中乙烯利残留的快速检测，为将该分析方法进行标准化提供了可行性。
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