近年来工厂化生产双孢蘑菇模式发展迅速，根据食用菌协会统计，2016年中国双孢蘑菇产量达335万t，占食用菌总产量的10%左右^[1]。

灭蝇胺化学名为N-环丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一种强内吸性的昆虫生长调节剂，通过诱导双翅目幼虫和蛹在形态上发生畸变，使成虫不羽化，从而达到杀虫的目的^[2-4]，主要用于防治茄子、黄瓜、韭菜、豆类和叶菜上的美洲斑潜蝇等害虫^[5-6]。笔者实地调研发现，部分食用菌企业使用灭蝇胺防治菇蝇，但中国灭蝇胺制剂在食用菌中未获登记，也没有制定在食用菌中的最大残留限量 (MRL)。灭蝇胺在动物体内或农作物栽培过程中可以通过脱烷基形成其代谢物三聚氰胺^[7-9]，因此，灭蝇胺施用不仅造成母体残留，也可能造成代谢物三聚氰胺在子实体和培养料中的残留。

灭蝇胺及其代谢物三聚氰胺检测方法有液相色谱、液相色谱-串联质谱和气相色谱-串联质谱等^[10-14]，但由于灭蝇胺和三聚氰胺属于极性化合物，亲水性较强，采用以上方法存在提取回收率低、基质效应强等不足。故本研究拟采用同位素内标法，研究灭蝇胺及其代谢物三聚氰胺在双孢蘑菇子实体及覆土中的残留动态和代谢转化规律，旨在为其风险评估、标准制定和安全使用提供参考。

1 材料与方法 1.1 供试药剂、试剂与仪器设备

99.5%灭蝇胺 (cyromazine) 和98.5%三聚氰胺 (melamine) 标准品 (德国Dr. Ehrenstorfer公司)；99%三聚氰胺-¹³C内标 (北京振翔科技有限公司)；75%灭蝇胺可湿性粉剂 (江西禾益化工股份有限公司)；乙腈和甲醇均为色谱纯 (德国Merck公司)；乙酸铵、甲酸均为色谱纯 (纯度 ≥ 99.0%, 美国Sigma公司)。MCX固相萃取柱 (上海广普达科技有限公司)。

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪 (美国Waters公司)，串联AB 5500型三重四极杆质谱仪 (美国AB SCIEX公司)，配电喷雾离子源 (ESI)；D-37520冷冻离心机 (Thermo公司)；SK8300GT超声波清洗器 (上海科导超声仪器有限公司)；Ultra系列超纯水仪 (上海首立实业有限公司)；N-EVAP-12 氮吹仪 (美国Organomation公司)；PB936奥克斯食品料理机 (中山市欧麦斯电器有限公司)；HWS-250 电热恒温鼓风干燥箱 (上海精宏实验设备有限公司)；CM230 L手推式搅拌机 (江苏吴军机械厂)。

1.2 田间试验 1.2.1 试验条件

试验地点为上海联中食用菌专业合作社，供试双孢蘑菇Agaricus bisporus菌种为美国A15 (由上海联中食用菌专业合作社提供)。覆土和培养料的组成同文献[15]。培养料发酵与出菇栽培过程参考文献[16]，该合作社菇房发菌过程中料温为22~26 ℃，空气相对湿度在75%~80%，二氧化碳浓度在5 000 mg/L以上。本研究结合灭蝇胺基地实际使用情况及部分登记农药的使用剂量，选取梯度差异较大的4个施药水平为有效成分1、10、50和250 mg/kg。

1.2.2 供试药剂在覆土中的消解动态试验

称取80 kg覆土于搅拌机中，边搅拌边喷雾加入灭蝇胺，混匀备用；以清水为对照 (CK)。取二次发酵好的培养料15 kg装入试验筐中，播入菌种，播种量为0.5~0.6 kg/m²，覆土6.65 kg，放入菇房床架进行栽培。分别于施药后2 h以及 1、3、5、7、10、15、21、28、35、42、49 d，按五点采样法采集覆土，每小区200 g，于–20 ℃保存，待测。

1.2.3 供试药剂在双孢蘑菇中的富集试验

施药方法同1.2.2节。待每潮双孢蘑菇子实体直径长至5 cm左右 (即25、37、48 d) 时采收500 g，去除根部，用搅拌机打碎，于–20 ℃保存，待测。

1.3 分析方法 1.3.1 标准溶液的配制

分别准确称取灭蝇胺、三聚氰胺、三聚氰胺-¹³C内标标准品，用甲醇溶解，配成10 mg/L的标准品储备液，密封，于–20 ℃保存，备用。根据试验需要对标准储备液进行稀释，配成所需的混合标准溶液，于4 ℃保存，备用。

1.3.2 样品的提取与净化

双孢蘑菇样品提取：准确称取 10 g双孢蘑菇于50 mL玻璃离心管中，加入1 mg/L三聚氰胺-¹³C内标标准溶液100 μL，静置30 min，加入6 mL水和24 mL甲醇，涡旋提取2 min，超声提取20 min，于1 652 g下离心 5 min，转移至50 mL的容量瓶中，加入1 mol/L的盐酸2 mL，用V (甲醇) : V (水) = 4:1定容至50 mL。

覆土样品提取：准确称取5 g覆土样品，由于灭蝇胺在样品中的浓度较高，需对样品进行稀释，即施药量1、10、50和250 mg/kg的样品分别稀释10、100、500和2 500倍，使其检测浓度低于100 μg/kg，加入内标的原则是上机样品质量浓度为10 μg/L，其余步骤同双孢蘑菇样品提取；三聚氰胺在覆土中含量较少，样品提取后不需要进行稀释，加入1 mg/L三聚氰胺-¹³C内标标准溶液100 μL，其余步骤同双孢蘑菇样品提取。

提取液净化：用5 mL甲醇和5 mL水分别预淋洗MCX固相萃取柱，使其活化后，吸取5 mL上述提取液，待溶液全都通过小柱的填料后，分别用5 mL水和5 mL甲醇洗涤，抽干后用8 mL含体积分数5%氨水的甲醇洗脱，收集洗脱液于氮吹仪上40 ℃吹干，最后用1 mL V (乙腈) : V (10 mmol乙酸铵水溶液) = 9:1混合溶液复溶，0.22 μm滤膜过滤后待测。

1.3.3 色谱-质谱检测条件

色谱条件：BEH HILIC色谱柱 (50 mm × 2. 1 mm，1.7 μm)；进样体积2 μL；柱温25 ℃；流速 0.3 mL/min；流动相A相为乙腈，B相为10 mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱程序为0~2.5 min，95%~80% A；2.5~3 min，80%~95% A；3~4 min，95% A。

质谱条件：ESI电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测模式，离子化电压为5 kV；温度500 ℃；喷雾气55 μL/min；气帘气35 μL/min；灭蝇胺定量离子对m/z为167/85、碰撞能量为27 V，定性离子对m/z为167/68、碰撞能量为45 V；三聚氰胺定量离子对m/z为127/85、碰撞能量为19 V，定性离子对m/z为127/68、碰撞能量为33 V；三聚氰胺-¹³C内标定量离子对m/z为130/87、碰撞能量为43 V，定性离子对m/z为130/80、碰撞能量为40 V。

1.4 方法学试验

灭蝇胺和三聚氰胺标准溶液分别稀释成0.01、0.05、0.1、0.5和1 mg/L的标准系列，含三聚氰胺-¹³C内标0.01 mg/L，按照1.3.3节的条件检测，内标法定量。在双孢蘑菇和覆土的空白样品中分别添加0.02、0.1和1 mg/kg的灭蝇胺和三聚氰胺，各加入1 mg/L三聚氰胺-¹³C内标标准溶液100 μL，按照1.3节的法进行分析。重复5次。

1.5 覆土中三聚氰胺转化率计算

覆土样品中三聚氰胺的转化率 (T) 按公式 (1) 计算：

$T = \frac{{R{\rm m} \times W \div M{\rm m} \div 1000}}{{R{\rm c} \times W \div M{\rm c} \div 1000}} = \frac{{R{\rm m} \div M{\rm m}}}{{R{\rm c} \div M{\rm c}}}$

(1)

式中，Rm、Rc分别代表覆土中三聚氰胺、灭蝇胺残留量 (mg/kg)，W代表样品质量 (kg)，Mm、Mc分别代表三聚氰胺、灭蝇胺的摩尔质量 (g/mol)。

2 结果与分析 2.1 方法的准确度和精密度

灭蝇胺在覆土和双孢蘑菇子实体中的线性回归方程分别为：y = 0.701x – 0.66 (R² = 0.999 1) 和y = 0.626x – 0.09 (R² = 0.999 6)，三聚氰胺在覆土和双孢蘑菇子实体中的线性回归方程分别为y = 0.417x + 0.155 (R² = 0.999 1) 和y = 0.353x – 0. 108 (R² = 0.999 3)。在0.02~1 mg/kg添加水平下，双孢蘑菇子实体和覆土中灭蝇胺的回收率为86%~102%，三聚氰胺的回收率为98%~103% (表1)。针对覆土中高浓度的灭蝇胺，进行高浓度灭蝇胺和三聚氰胺-¹³C内标的添加，内标法定量，其添加回收率在上述范围之内。本研究在前期的外标法定量中，灭蝇胺的添加回收率为63%~80%，三聚氰胺添加回收率为53%~75%，而采用内标法后，两种化合物的回收率明显提高；灭蝇胺和三聚氰胺检出限均为0.001 mg/kg，定量限均为0.005 mg/kg，标准品图谱见图1。检测方法符合农药残留检测的要求^[17]。

2.2 灭蝇胺和三聚氰胺在覆土中的变化规律

对照组中未检出灭蝇胺和三聚氰胺。在1、10、50和250 mg/kg 4个施药水平下，灭蝇胺的初始残留量分别为0.92、8.44、46.18和245.34 mg/kg。灭蝇胺和三聚氰胺在覆土中的残留动态见图2，经拟合，灭蝇胺在覆土中的降解符合一级反应动力学指数模型，决定系数R²大于0.95，半衰期为22.4~43.3 d，平均为31.3 d (表2)，其中50 mg/kg处理在施药后42 d (即第2潮菇完全采摘完毕后) 降解率仅为38.41%。因此，栽培后的覆土中，灭蝇胺仍有较高的残留量，影响其再利用。随着覆土中灭蝇胺的残留量降低，其代谢物三聚氰胺的含量呈明显升高趋势，42 d后1、10、50和250 mg/kg 4个施药水平下，三聚氰胺在覆土中的残留量分别为0.06、0.89、4.28和22.95 mg/kg，其转化率分别为8.58%、13.87%、12.19%和12.30%，平均转化率为11.73%。

2.3 灭蝇胺和三聚氰胺在双孢蘑菇子实体中的残留量

不同浓度灭蝇胺和三聚氰胺在双孢蘑菇子实体中的残留量见表3。试验范围内，灭蝇胺和三聚氰胺在双孢蘑菇子实体中均有残留，且随着施药剂量的增加，灭蝇胺和三聚氰胺的残留量增加，第1潮蘑菇中灭蝇胺和三聚氰胺的最高残留量分别为2.36、1.75 mg/kg。第2潮蘑菇中灭蝇胺和三聚氰胺的最高残留量分别为1.56、1.15 mg/kg。在两个高施药水平 (50、250 mg/kg) 下，灭蝇胺和三聚氰胺在第1潮菇中的残留量明显高于在第2潮菇中的。在1、10、50和250 mg/kg 4个施药水平下，三聚氰胺/灭蝇胺在第1潮双孢蘑菇中的残留比值分别为4、1.5、0.29和0.74，在第2潮双孢蘑菇中的比值分别为7.06、3.67、0.28和0.74。以子实体中三聚氰胺/灭蝇胺残留比值为衡量指标，随着施药剂量增加，同一潮次菇中比值下降，表明三聚氰胺绝对残留量增加、但代谢转化率下降。而且，对两个潮次之间比值进行差异显著性分析，结果表明相同施药量下两潮菇比值差异不显著 (P > 0.05)，说明两潮双孢蘑菇中的三聚氰胺/灭蝇胺的残留比值接近。

3 讨论与结论

三聚氰胺分子小极性强，在检测中受基质效应影响大，高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中三聚氰胺^[18-19]，解决基质效应的途经是基质加标和同位素内标，基质加标的困难在于寻找空白基质，采用同位素内标法可以很好地解决这一问题^[20]。而土壤基质中成分复杂，外标法定量中，灭蝇胺的添加回收率仅为63%~80%，三聚氰胺添加回收率仅为53%~75%，因此本研究选取同位素内标法，对灭蝇胺和三聚氰胺进行定量，灭蝇胺的回收率达86%~102%，相对标准偏差 (RSD) 为2.7%~5.3%；三聚氰胺的回收率达到98%~103%，RSD为1.5%~2.4%，该方法的灵敏度高，准确度强，更为适合试验中灭蝇胺和三聚氰胺的检测。

灭蝇胺在双孢蘑菇覆土中的降解半衰期相比在银耳培养料中的降解半衰期 (5.5 d) 更长^[21]，与啶虫脒在双孢蘑菇覆土中的降解规律相似^[15]。施药后42 d，覆土中三聚氰胺转化率低于灭蝇胺的降解率，因此，覆土中的灭蝇胺还有其他的代谢和降解途径或产物。三聚氰胺在土壤中会被降解，且随施药量的增加降解速率变慢^[22-23]。在低剂量 (1~10 mg/kg) 下，三聚氰胺的形成与降解达到平衡，较高剂量下灭蝇胺代谢产生三聚氰胺的量仍然大于降解量。覆土中施用灭蝇胺可以造成双孢蘑菇子实体中灭蝇胺和代谢物三聚氰胺残留，试验剂量下灭蝇胺最高残留达到2.36 mg/kg，三聚氰胺达到1.75 mg/kg。本研究中尚不能确定子实体中三聚氰胺是来自于子实体中灭蝇胺的代谢，还是来自于覆土对三聚氰胺的吸收，或者二者兼有。因此，需要对双孢蘑菇子实体中灭蝇胺与三聚氰胺的迁移转化开展进一步研究，明确双孢蘑菇中三聚氰胺的来源和代谢转化规律，通过在实际生产中对第1潮菇中残留的监测，可预测其在第2潮菇中的残留水平。

由于灭蝇胺半衰期较长 (22.4~43.3 d)，当施用剂量为 50 mg/kg时，其在覆土中的残留量 (28.44 mg/kg) 较高，且三聚氰胺含量也达到22.95 mg/kg，如果直接作为农业底肥循环利用，会造成对土壤甚至作物的再次污染；双孢蘑菇中三聚氰胺残留量为0.3 mg/kg，低于中国食品中最高限量标准2.5 mg/kg^[24]，但灭蝇胺的残留量高达1.02 mg/kg，高于日本肯定列表标准 (1 mg/kg)^[25]。综合考虑产品安全、出口贸易和生态效应，建议双孢蘑菇生产中拌土施药剂量不超过50 mg/kg。至于具体施用剂量，仍需要继续开展目标病虫害防治效果试验，制定合理用药控制指标，加快推进该药剂的登记和最大残留限量标准制定，为产业健康发展提供技术支持。