2018, Vol. 20
环烷基磺酰胺类化合物具有较高的杀菌活性，与芳基磺酰胺类化合物相比，其具有低毒、低残留等特点[1]，其作用机制有别于现有防治灰霉病的市售杀菌剂[2-3]。前期报道了以化合物环己磺菌胺 (图式1，化合物A) 为先导[4-7]，经还原氨化反应获得了中间体2-氨基环己烷基磺酰胺，最终合成的2-取代苯甲酰氨基、2-烷酰氨基和2-吡啶酰氨基磺酰胺类化合物均具有较好的杀菌活性[8-10]。含杂环酰胺结构的杀菌剂是近年研究的热点[11]，其中噻唑类衍生物因其低毒，生物活性广泛，已成为农药研究的热点之一[12-13]。如噻唑酰胺类杀菌剂噻唑菌胺 (ethaboxam，化合物B) 和噻呋酰胺 (thifluzamide，化合物C)，分别对卵菌纲病原菌引起的病害和水稻纹枯病有很高的防效[14-15]。此外，Bartroli等将噻唑2-位芳基固定为4-氰基苯基，合成得到了含有三唑醇结构的化合物 (化合物D)，对卵菌纲病原菌具有较好的抑制活性[16]；朱有全等在噻唑2-位引入苯氧乙酸酯基团，合成得到的酰胺 (化合物E) 对小麦赤霉病菌具有较好的抑制活性[17]。
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图式1 一些商品化品种和活性化合物的结构式 Scheme1 Structural formula of some commercial products and active compounds |
鉴于此，笔者尝试以噻唑2-位苯环上含有不同取代基的11个噻唑羧酸为原料，将其与2-氨基环己烷基磺酰胺 (图式2，3) 反应，合成了11个未见文献报道的2-噻唑酰氨基环己烷基磺酰胺类化合物，并采用不同的方法测试了其对灰霉病菌的杀菌活性。化合物的合成路线见图式2。
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图式2 目标化合物7a~7k的合成路线 Scheme2 Synthetic route of target compounds 7a-7k |
1 实验部分 1.1 仪器与药剂
Bruker300-MHz型核磁共振仪 (TMS为内标，溶剂为CDC13)；Agilent气相色谱 (7890B)-三重四极杆串联质谱仪 (7000C)；Flash EA 1112型元素分析仪；X-5 型熔点测定仪 (温度计未校正)；WD-9403A型紫外-荧光分析仪。
试剂均为分析纯，二氯甲烷与三乙胺经干燥后使用。缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐 (EDCI) 和1-羟基苯并三唑 (HOBT)，纯度均为98%，购自上海达瑞精细化学品有限公司。对照药剂为腐霉利 (procymidone) 与啶酰菌胺 (boscalid) 原药，纯度95%，由沈阳化工研究院生物测定中心提供。施药器械为W-71型气动喷枪。
1.2 供试菌株灰霉病菌Botrytis cinerea菌株由沈阳农业大学植物保护学院农药科学教研室采集、分离、培养并保存。
1.3 化合物的制备 1.3.1 化合物N-(2-三氟甲基-4-氯苯基)-2-氨基环己烷基磺酰胺 (3) 的合成参考文献[9]的方法合成，收率68% (文献值[9] 72.9%)，熔点252.0~254.0 ℃ (文献值[9] 252.0~254.0 ℃)。
1.3.2 2-取代苯基-4-甲基噻唑-5-甲酸类化合物 (6a~6k) 的合成化合物 (6a~6k) 均为已知化合物，参考文献[18-21]方法制备。以化合物6i的合成为例：冰浴下，在250 mL三口瓶中加入乙醇 (100 mL) 和对三氟甲基硫代苯甲酰胺 (0.07 mol)，保持温度在0~5 ℃，逐滴加入2-氯代乙酰乙酸乙酯 (0.078 mol)，滴加完毕后，移除冰浴，加热至回流。TLC [V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 3:1] 跟踪监测，约3 h反应完毕。降温至零度以下，抽滤，得白色固体。将固体溶于60 mL四氢呋喃中，室温搅拌下，滴加新配制的4 mol/L的氢氧化钠溶液 (75 mL)，常温搅拌反应3 h。用6 mol/L的盐酸调节pH值至2，析出大量固体。抽滤，乙醇洗涤，烘干，得白色固体6i，收率76% (文献[20]收率65%)，熔点：203.3 ~204.0 ℃ (文献值[20]203.7 ℃)。
1.3.3 目标化合物7a~7k的合成以N-(2-三氟甲基-4-氯苯基)-2-(2-(4-三氟甲基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰氨基) 环己烷基磺酰胺 (化合物7i) 的合成为例。向100 mL四口瓶中加入40 mL干燥的二氯甲烷，先后加入6i (3 mmol)、EDCI (3.3 mmol)、HOBT (3.3 mmol) 和三乙胺 (5.1 mmol)，保持温度在0~5 ℃，搅拌反应2 h后加入2.4 mmol化合物3，继续反应2~3 h。TLC [V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 2 : 1] 监测反应至完毕。分别用50 mL饱和碳酸钠溶液和50 mL水洗涤，无水硫酸钠干燥。旋转蒸发去除溶剂，粗产物经硅胶柱层析[V (二氯甲烷) : V (乙酸乙酯) = 3 : 1]或重结晶[V (石油醚) : V (二氯甲烷) = 5 : 1]提纯，得1.307 g目标化合物7i，收率87%，熔点198.0~199.5 ℃。
1.4 抑菌活性测定 1.4.1 抑菌活性初筛 1.4.1.1 菌丝生长速率法参考文献[22]方法进行。先将目标化合物和对照药剂用丙酮配制成质量浓度为5 000 mg/L的母液，再用丙酮稀释成1 250 mg/L药液，继而稀释成312.5和78.13 mg/L的药液，最后用PDA培养基稀释得到最终质量浓度分别为50、12.5、3.13、0.78 mg/L的含药培养基。接种直径为5 mm的灰霉病菌菌饼，在 (23 ± 2) ℃下培养3~5 d，测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。采用Excel软件计算EC50值。
1.4.1.2 黄瓜活体叶片法参考文献[23]方法进行。称取0.05 g目标化合物，用0.3 mL甲醇溶解，分别加入0.007 5 g农乳500及0.042 5 g农乳600，混匀，最后用二甲基亚砜 (DMSO) 补足至1.0 mL，得到有效成分质量分数为5%的化合物乳油。用水稀释成200 mg/L备用。以喷洒不含目标化合物的乳油水溶液为空白对照。待黄瓜幼苗长至两片子叶时，均匀喷施药液。每处理重复5次。待药液自然晾干后，在每片子叶中部接种直径为5 mm的灰霉病菌菌饼，置于温室中，在23~25 ℃、相对湿度80%以上条件下培养。待空白对照充分发病后测量病斑直径，计算防治效果。
1.4.2 抑菌活性复筛对于初筛活性较好的化合物进行抑菌活性复筛。
1.4.2.1 凹玻片法采用文献[24]方法测定目标化合物对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制活性。首先用丙酮配制质量浓度为1 000 mg/L的供试化合物药液，然后吸取0.01 mL供试药液加入到0.99 mL新配制的灰霉病菌孢子悬浮液中 (5 × 105个/mL)，得到含有10 mg/L供试化合物的孢子悬浮液。置于23~25 ℃下培养，8 h后镜检，计算孢子萌发率。按公式 (1) 式计算孢子萌发抑制率。
| ${\text{孢子萌发抑制率}} /{\text\%} = \frac{{{\text{空白对照萌发率}} - {\text{药剂处理萌发率}}}}{{{\text{空白对照萌发率}}}} \times 100$ | (1) |
采用文献[25]方法测定部分化合物对番茄叶片上灰霉病的防治效果。以啶酰菌胺和腐霉利为对照药剂，供试药液质量浓度为200 mg/L，配制方法同黄瓜活体叶片法。供试番茄苗均为6~8片复叶 (约30~50片小叶) 或有8~10朵花的番茄幼苗，每处理重复4次。将供试药液均匀喷施到番茄植株上，室温自然风干2 h后，将浓度为5 × 10 5个/mL的灰霉病菌孢子悬浮液均匀喷洒在番茄苗上，置于温室中，保持温度在23~25 ℃，湿度在80%以上。待空白对照发病后，调查所有番茄叶片及花的发病情况，按 (2)~(4) 式计算防治效果。
| ${\text{病情指数}}/{\text\%}\!=\! \frac{{\sum {\left( {{\text{各级病叶数}}\! \times \!{\text{相对级数值}}} \right)} }}{{{\text{调查总叶数}} \times 9}} \!\times \!100$ | (2) |
| ${\text{防治效果}}\left( {{\text{叶}}} \right)/{\text\%} {\rm{ = }}\frac{{{\text{空白对照病情指数}} - {\text{药剂处理病情指数}}}}{{{\text{空白对照病情指数}}}} \times 100$ | (3) |
| ${\text{防治效果}}\left( {{\text{花}}} \right)/{\text\%} {\rm{ = }}\frac{{{\text{空白对照感病率}} - {\text{药剂处理感病率}}}}{{{\text{空白对照感病率}}}} \times 100$ | (4) |
在合成目标化合物7a~7k时，采用了缩合试剂EDCI和HOBT催化羧酸与胺发生缩合脱水反应生成酰胺的方法，产物的收率较高。与先将羧酸制备成酰氯，再与胺反应生成酰胺的方法不同，此法省却了一步反应，避免了使用腐蚀性和刺激性强的氯化试剂。在后处理纯化过程中EDCI易溶于水，水洗即可除去。此法副产物少，杂质与产物极性差别大，易于柱层析分离。目标化合物理化数据、质谱和元素分析数据见表1，1H NMR及13C NMR数据见表2。
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表 1 化合物7a~7k的理化数据、质谱及元素分析数据 Table 1 Physico-chemical data, mass spectrometry and elemental analysis data of compounds 7a-7k |
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表 2 化合物 7a~7k 的 1H NMR 及 13C NMR 数据 Table 2 The 1H NMR and 13C NMR data of compounds 7a-7k |
2.1.2 目标化合物构型
由于目标化合物环己烷部分是1,2-二取代，具有两个手性中心，因此，化合物可能存在多种构型。与前文[9]报道的系列化合物2-苯酰胺基环己烷磺酰胺的结构对比可知，本研究所合成的目标化合物也为顺式-1,2-二取代环己烷衍生物，其中，磺酰胺基处于平伏键，酰胺基处于直立键。
2.2 杀菌活性初筛试验结果 (表3) 表明：在离体条件下，目标化合物对灰霉病菌菌丝生长的抑制活性普遍不高，只有化合物7i、7k的EC50值在20 mg/L以下，活性明显低于对照药剂腐霉利和啶酰菌胺。而在活体条件下的黄瓜活体叶片试验中，部分目标化合物对灰霉病菌表现出了较高的活性，其中化合物7a、7b和7c的活性优于腐霉利，化合物7e的防治效果接近于啶酰菌胺。离体条件与活体条件测定结果差别较大的原因可能是目标化合物干扰了病菌对植株叶片的侵染过程，也可能是目标化合物具有诱导植株产生抗病性的作用[26]，具体原因及作用机制有待进一步研究。
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表 3 目标化合物7a~7k对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用及对黄瓜叶片灰霉病的防治效果 Table 3 Inhibitory effect of target compound 7a-7k on mycelium growth of B. cinerea and control effect on B. cinerea of cucumber leaves |
复筛试验结果 (表4) 表明：离体条件下，化合物7a和7b在10 mg/L下对灰霉病菌孢子萌发的抑制率分别为90%与84%，优于对照药剂腐霉利，略低于啶酰菌胺。番茄叶片活体盆栽法试验结果表明，化合物对番茄灰霉病的防治效果较好，其中化合物7a、7b、7c和7d的防治效果优于腐霉利，而7a和7c的防治效果同时还高于啶酰菌胺。
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表 4 部分化合物对灰霉病菌孢子萌发的抑制作用及对番茄叶片灰霉病的防治效果 Table 4 Fungicidal activities of selected compounds determined by spore germination methods and in vivo tomato leaves method |
对复筛活性较好的两个化合物7a和7c又进行了番茄活体盆栽试验。结果 (表5) 表明：在200 mg/L化合物7c对番茄花上灰霉病的防治效果为44%，优于对照药剂腐霉利和啶酰菌胺；化合物7a的防效与两个对照药剂相当。由表5数据还可看出：包括对照药剂在内的所有供试药剂对番茄花上的灰霉病防效均较低。分析原因可能是与田间自然发病相比，人工接种的灰霉病菌孢子浓度较大，导致发病严重；另外，从生产上来看，相对于番茄叶片，番茄花更易被灰霉病菌所侵染。
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表 5 化合物7a和7c在200 mg/L下对番茄花灰霉病的防治效果 Table 5 Fungicidal activities of compounds 7a and 7c against B. cinerea of in vivo tomato flower |
3 结论
在2-氨基环己磺酰胺先导化合物中引入1,3-噻唑环，设计并合成了11个未见文献报道的2-噻唑酰胺基环己烷基磺酰胺类化合物，部分化合物对灰霉病菌表现出较好的杀菌活性，而且活体杀菌活性普遍高于离体活性，其中化合物7a对番茄叶片上灰霉病的杀菌活性高于对照药剂腐霉利和啶酰菌胺，对番茄花上灰霉病的杀菌活性与两个对照药剂相当；化合物7c对番茄叶片及番茄花上灰霉病的杀菌活性均优于对照药剂腐霉利和啶酰菌胺；值得进一步研究。初步的构效关系表明，当噻唑2-位苯环上无取代基或取代基为2,4-二氟或2,4-二氯时，化合物杀菌活性相对较好。有关该系列化合物的作用机制有待进一步研究。
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