2018, Vol. 20
2. 河北省沽源县小河子乡人民政府，河北 张家口 075000
2. People’s Government, Xiaohezi Township, Guyuan County, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
烟嘧磺隆属于磺酰脲类除草剂，因具有高效、低毒且对玉米无害等优点被广泛应用，但烟嘧磺隆在土壤中不易降解，易对后茬作物如小麦、白菜等敏感作物造成一定程度的药害[1]。土壤生物及微生物修复是目前治理环境污染，特别是农药等化学污染的有效途径之一[2-5]，其中微生物菌剂因具有安全、有效、便于培养加工、抗逆性强等优点而受到广泛关注[6]。季彬等[7]研究表明，农用微生物制剂可大大改善农药、化肥及化学制剂中重金属等对土壤造成的污染，在一定范围内对受损的土壤具有修复作用。马晓亮等[8]研究发现，在土壤中添加粘质沙雷氏菌Serratia marcecens N80可以促进土壤中烟嘧磺隆的降解，当烟嘧磺隆的质量分数为10 mg/kg时，添加降解菌N80的处理，小白菜等的出苗率分别比未添加降解菌N80的处理提高26%~43%。
YB1菌株是杨亚君等从农药厂污水中分离筛选得到的一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，其可在5 d内将2 mg/L的烟嘧磺隆降解86.2%[9]。已有研究表明，YB1对烟嘧磺隆的降解主要是通过分泌胞外酶来实现的[10-12]。为此，笔者将YB1菌株进行固体发酵，同时考虑到微生物颗粒剂具有易加工、且操作方便等优点，通过对菌株载体和保护剂种类的筛选，将YB1发酵产物加工成颗粒剂，并测定其特性。通过室内盆栽法，以小麦为敏感指示植物，研究了YB1颗粒剂对土壤中烟嘧磺隆的降解效果，旨在为解决烟嘧磺隆残留地区的土壤修复问题提供参考。
1 材料与方法 1.1 供试材料枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis YB1菌株 (由河北农业大学植物保护学院农药系实验室筛选获得并保存)。活菌计数板 (北京维欣仪奥科技发展有限公司)；Nikon ECLIPSE E100显微镜 (日本Nikon公司)；湿法制粒机KCB-80(北京开创同和科技发展有限公司)。麦麸、秸秆粉碎后过孔径为0.18 mm的样品筛。供试植物：大白菜、小白菜、小麦、油菜和生菜 (购自保定市农资市场)。载体：白炭黑 (焦作市科邦精细材料有限公司)、膨润土、活性白土和硅藻土 (淄川区天华澎润土加工厂)；保护剂：酪氨酸、羧甲基纤维素钠、腐殖酸 (北京索莱宝科技有限公司)。
1.2 试验方法 1.2.1 YB1菌株载体和保护剂筛选分别以秸秆粉、膨润土、白炭黑、活性白土和硅藻土作为载体，经高压蒸汽121 ℃(1.51 × 107 Pa)灭菌20 min后以5%的质量分数分别与LB固体培养基混合制备平板。取YB1斜面保存的菌种，用无菌水冲洗稀释，制备成活菌含量为103 CFU/mL的菌悬液。取0.1 mL菌悬液涂板，于30 ℃培养48 h后观察单菌落数目。
分别以酪氨酸、羧甲基纤维素钠和腐殖酸为保护剂，于培养皿 (无盖) 中加入10 mL活菌含量为103 CFU/mL的YB1菌悬液，添加保护剂的质量分数分别为1%和3%。于紫外灯下30 cm(垂直距离) 处照射20 min后立即涂LB平板，于30 ℃避光培养48 h后计算单菌落数目。分别以不添加保护剂经紫外灯照射和不经紫外灯照射的处理为对照。每处理3次重复。
1.2.2 YB1颗粒剂加工与生物特性检测将枯草芽孢杆菌YB1菌株接种于新鲜的LB液体培养基中，于30 ℃、150 r/min摇床中培养24 h制备种子液 (活菌数约为1 × 108 CFU/mL) 备用。按照前期已优化的发酵条件进行发酵：麦麸与秸秆质量比为5 : 5，氮源为氯化铵，接种量为1 × 107 CFU/g，培养基固液比为1 : 2、于30 ℃下培养7 d后得到固体发酵产物，统计YB1活菌数。
将YB1固体发酵产物与筛选后的载体按质量比1:1混合，加入质量分数为3%的保护剂和5%的淀粉进行挤压造粒，得到枯草芽孢杆菌YB1颗粒剂。按文献方法[13]测定YB1颗粒剂的生物特性，包括有效活菌数与杂菌数、含水量及pH值等。
1.2.3 YB1颗粒剂对土壤中烟嘧磺隆降解效果的测定采用室内盆栽法[14]测定不同供试植物对烟嘧磺隆的敏感性。将提前催芽露白的供试植物分别播种于含不同质量分数 (0、0.156 3、0.312 5、0.625、1.25 和2.5 mg/kg) 烟嘧磺隆的土壤中，于室温通风处培养7 d后，拔出植物幼苗，洗净后测量株高。每处理3次重复。通过SPSS19.0软件计算烟嘧磺隆对各供试植物的有效抑制中浓度 (IC50)，以确定对烟嘧磺隆最敏感的植物。
选用筛选到的敏感指示植物进行试验。每1 kg土壤中分别添加1 mg烟嘧磺隆和0、5、10、20、40、80 g YB1颗粒剂。以不添加烟嘧磺隆和YB1颗粒剂的处理为对照组。将各处理土壤置于室温通风处，每隔7 d取该土壤种植敏感植物，于室温通风处培养7 d后拔出幼苗，洗净，测量株高和根长，以确定对土壤修复效果最好的颗粒剂的添加量；在最优颗粒剂添加量的基础上，分别设烟嘧磺隆在土壤中的质量分数为0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/kg，同法处理后测量幼苗株高和根长，以确定YB1颗粒剂对含不同质量分数烟嘧磺隆的土壤的修复效果。
2 结果与分析 2.1 YB1菌株载体和保护剂的筛选结果由表1数据可见，在5种供试载体中，活性白土和白炭黑对YB1菌株活菌抑制效果均较低，且与硅藻土、秸秆粉和膨润土的处理存在显著差异。因此，最终选择以活性白土为菌株载体。
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表 1 YB1颗粒剂中菌株载体的筛选结果 Table 1 Result of vector screening of YB1 granules |
保护剂筛选试验结果见表2，其中，添加腐殖酸和羧甲基纤维素钠的处理与未添加保护剂经紫外光照射的处理差异显著，而以添加3%酪氨酸的处理对YB1菌株的紫外保护效果最好。
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表 2 YB1颗粒剂中保护剂的筛选 Table 2 Protective agent screening of YB1 granules |
2.2 YB1颗粒剂的生物特性
经测定，YB1菌株固体发酵产物中有效活菌数为1.9 × 109 CFU/g。以活性白土为菌株载体，以酪氨酸为保护剂，按1.2.2节加工方法进行造粒，得到YB1颗粒剂。对颗粒剂中有效活菌数、杂菌率、水分及pH值进行检测，结果见表3。各项指标基本符合农用微生物菌剂标准[13]。
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表 3 YB1颗粒剂的生物特性 Table 3 The biological characteristics of YB1 granules |
2.3 供试植物对烟嘧磺隆的敏感性
测定结果 (表4) 表明：小麦对烟嘧磺隆最为敏感，IC50 值为0.259 g/kg；油菜次之。因此选择小麦作为指示植物。
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表 4 对烟嘧磺隆敏感植物筛选结果 Table 4 The screening result of plants sensitive to nicosulfuron |
2.4 YB1颗粒剂对含有烟嘧磺隆土壤的修复效果
以小麦为指示植物，在土壤中添加不同剂量的YB1颗粒剂，测定不同时间小麦的生长情况。结果 (表5) 表明：当颗粒剂的添加量小于20 g/kg土时，即使延长处理时间至35 d，小麦的根长和株高均比空白对照明显缩短，表明此时添加的YB1颗粒剂对烟嘧磺隆的降解作用较弱，对土壤的修复效果不理想；而当颗粒剂的添加量大于等于20 g/kg土并处理28 d以上时，小麦的根长和株高与空白对照相比无显著差异，表明此时YB1颗粒剂对烟嘧磺隆具有较好的降解作用，对土壤具有较好的修复效果。
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表 5 添加不同剂量的YB1颗粒剂处理不同处理时间时小麦的生长情况 Table 5 The growth of wheat with different doses of YB1 granules and different treatment period |
土壤中添加20 g/kg土YB1颗粒剂对不同含量烟嘧磺隆的降解效果见表6。其中当烟嘧磺隆质量分数 ≤ 1 mg/kg并处理28 d时，小麦根长和株高均与空白对照无显著差异；而当烟嘧磺隆的质量分数 > 1 mg/kg时，即使延长处理时间，YB1颗粒剂也不能将该土壤完全修复。
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表 6 添加20 g/kg土YB1颗粒剂对不同含量的烟嘧磺隆处理不同时间的小麦生长情况 Table 6 The effect of 20 g/kg soil YB1 granules to the growth of wheat under different content of nicosulfuron and different treatment period |
3 结论与讨论
目前，有关烟嘧磺隆的高效降解菌株的报道很多，但应用于被烟嘧磺隆污染的土壤修复的研究相对较少[15]，为缓解实际生产中烟嘧磺隆对土壤的污染程度，笔者将枯草芽孢杆菌YB1菌株加工成颗粒剂，以期获得一种对含有烟嘧磺隆残留的土壤具有修复作用的微生物菌剂。
YB1菌株经固体发酵后得到固体发酵产物，有效活菌数为1.9 × 109 CFU/g，低于Liu等[16]对枯草芽孢杆菌B. subtilis L7进行固体发酵所得发酵产物的活菌数 (3.26 × 1010 CFU/g)，因此，YB1发酵产物中有效活菌数量有待进一步优化提高。通过对YB1菌株载体和保护剂的筛选，确定了YB1菌株的最佳载体为活性白土，最佳保护剂为酪氨酸。在颗粒剂中，固体发酵产物与活性白土的质量比为1 : 1，酪氨酸质量分数3%，淀粉质量分数5%。
盆栽试验结果表明，YB1颗粒剂对低浓度 (质量分数 ≤ 1 mg/kg) 烟嘧磺隆的降解效果明显，对高浓度烟嘧磺隆 (质量分数 > 1 mg/kg) 的降解效果略差。赵卫松 [17]采用室内模拟添加降解菌的方法研究了苍白杆菌属 (Ochrobactrum sp.) ZWS16和寡养单胞菌属 (Stenotrophomonas sp.) ZWS18 2个菌株对噻吩磺隆以及烟嘧磺隆的降解情况，发现2个菌株可将土壤中10 mg/L的烟嘧磺隆在8 d内降解70%以上。张国民等[18]从常年使用烟嘧磺隆农田采集的土壤中筛选得到的红假单胞菌 (Rhodopseudomonas sp.) J5-2对烟嘧磺隆降解效果较好，可将400 mg/L的烟嘧磺隆在7 d内降解32.2%。土壤中烟嘧磺隆的质量分数一般低于1 mg/kg[19-20]，本研究中所研制的YB1颗粒剂对低浓度的烟嘧磺隆降解效果较好，因此，其可用于被烟嘧磺隆污染的土壤修复，且颗粒剂加工过程简单，操作方便，具有应用推广的潜力。后期将继续研究YB1颗粒剂在大田试验中的应用情况，以便为解决部分地区土壤烟嘧磺隆残留问题提供借鉴。
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