2018, Vol. 20
2. 沈阳农业大学 植物保护学院，沈阳 110866
2. College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
吡唑萘菌胺 (isopyrazam) 是由先正达公司研发的一种琥珀酸脱氢酶抑制剂 (succinate dehydro-genase inhibitors，SDHI) 类杀菌剂，于2010年在英国上市[1]。其通过抑制线粒体内膜上电子传递链中的琥珀酸脱氢酶，使得病原真菌无法经由呼吸作用产生能量，进而阻止病菌生长[2-3]。该杀菌剂对球针壳属菌和锈菌高效，近年来广泛用于防治西瓜白粉病、黄瓜炭疽病、白粉病和根腐病等[4-6]。吡唑萘菌胺标准品由其顺式异构体 (SYN534968) 和反式异构体 (SYN534969) 组成，在环境中会首先降解为CSCD459488和CSCD459489 2个有毒代谢产物 (图式 1)。
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图式1 吡唑萘菌胺顺反异构体及其代谢物化学结构式 Scheme1 Structural formula of isopyrazam cis-, trans- isomer and its motablites |
国际粮农组织和世界卫生组织农药残留联席会议 (JMPR，2011) 提供的吡唑萘菌胺的每日允许摄入量 (ADI) 为0.06 mg/kg bw，急性参考剂量 (ARfD) 为0.3 mg/kg bw。制定植物中吡唑萘菌胺最大残留限量 (MRL) 时需要同时计算其顺式与反式异构体的含量，而对吡唑萘菌胺进行风险评估时需同时计算吡唑萘菌胺及其代谢物CSCD459488与CSCD459489的含量[7]。目前，已规定吡唑萘菌胺在黄瓜上的MRL值为：欧盟0.4 mg/kg[8]，日本1 mg/kg[9]，韩国2 mg/kg[10]；在西瓜上的MRL值为：欧盟0.3 mg/kg[8]，韩国0.1 mg/kg[10]。中国暂未制定吡唑萘菌胺及其代谢物在西瓜和黄瓜上的MRL值。
关于吡唑萘菌胺残留的检测方法较多[11-16]，而关于其代谢物残留的检测方法则报道较少。郑振山等[17]采用气相色谱法测定了黄瓜中吡唑萘菌胺及其代谢物的残留，但其前处理采用固相萃取法，不仅需要大量有机溶剂，且费时、费力。分散固相萃取 (dispersive solid-phase extraction, dSPE) 是Lehotay等[18]开发的一种样品前处理方法，广泛用于果蔬中的农药残留检测。本研究以乙腈为提取溶剂，采用分散固相萃取法进行净化处理，建立了以气相色谱-串联质谱检测器检测西瓜和黄瓜中吡唑萘菌胺顺反异构体及其2个代谢物残留量的方法，以期为中国制定吡唑萘菌胺及其代谢物MRL值及风险评估提供一定理论基础。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂Agilent 7000C三重四极杆-串联质谱仪 (美国安捷伦公司)；TDZ5-WS台式低速离心机 (湖南湘仪公司)；H1650-W台式小型离心机 (湖南湘仪公司)；Sartorius电子天平 (1/1 000，北京赛多利斯天平有限公司)；UMV-2多管涡旋混合仪 (北京优晟联合科技有限公司)；50 mL聚四氟乙烯离心管。
SYN534968 (纯度 ≥ 96.3%)、SYN534969 (纯度 ≥ 97.3%)、CSCD459488 (纯度 ≥ 96%) 和CSCD459489 (纯度 ≥ 98%) 标准品均购自先正达公司；氯化钠 (分析纯，北京化工厂)；乙腈 (色谱纯，迪马公司)；N-丙基-乙二胺吸附剂 (PSA)；十八烷基硅烷 (C18)；石墨化碳 (PestiCarb，GCB)；Filter Unit滤膜 (0.22 μm，Waters公司)；试验用水为去离子水。磷酸三苯酯 (TPP，纯度 ≥ 99%) 购自天津博纳艾杰尔科技有限公司。
西瓜样品来自田间试验，试验药剂为29%吡唑萘菌胺·嘧菌酯悬浮剂；黄瓜样品购自北京当地某超市。
1.2 标准溶液配制与标准曲线绘制分别称取SYN534968、SYN534969、CSCD459488和CSCD459489标准品0.05 g (精确到0.001 g)，用乙腈溶解并定容至50 mL，分别配制成1 000 μg/mL标准品母液。取各标准品母液1 mL，再用乙腈稀释至10 mL，配制成100 μg/mL混合标准溶液，于 –20 ℃保存备用。使用时用乙腈逐级稀释至所需系列浓度。
将100 μg/mL混合标准溶液分别用西瓜和黄瓜空白提取液稀释成1、2、5、10、20、50、100、200和500 μg/L的基质匹配标准溶液。以分析物质量浓度为x轴，峰面积为y轴绘制标准工作曲线。
1.3 仪器检测条件色谱条件：DA-5MSplus色谱柱 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；柱温80 ℃；载气氦气 (纯度 ≥ 99.999%)；柱头压65 kPa；载气恒线速度36.966 cm/s；进样体积1 μL；进样口温度290 ℃；不分流进样；色谱柱升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min；以25 ℃/min的速率升温至300 ℃，保持5 min，溶剂延迟4 min，运行时间为14.8 min。
质谱条件：电子轰击离子源 (EI源)；离子源温度290 ℃；电离能量70 eV；四极杆温度290 ℃；溶剂延迟时间4 min；多重反应监测 (MRM) 模式见表1。
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表 1 吡唑萘菌胺及其代谢物的保留时间、特征离子和碰撞能量 Table 1 Retention time, characteristic ion-pair and collision energy of isopyrazam and its metabolites |
1.4 样品前处理
准确称取匀浆粉碎后西瓜全瓜和黄瓜样品10.0 g于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，于2 500 r/min下涡旋3 min；加入3 g 氯化钠，涡旋1 min，于4 000 r/min下离心5 min；加入20 μg磷酸三苯酯 (TPP)，静置5 min；取1.5 mL上清液加到装有50 mg PSA、50 mg C18和150 mg 硫酸镁的2 mL离心管中，振荡30 s，于12 000 r/min下离心2 min，待测。
2 结果与讨论 2.1 质谱条件的选择在m/z 50~400范围内对吡唑萘菌胺顺反异构体及其2个代谢物的标准溶液进行全离子扫描，获得其总离子流图 (TIC)。根据所得TIC，确定各化合物的母离子m/z值，分别以母离子进行产物离子扫描，确定定性和定量离子对。通过MRM模式扫描优化碰撞能量，结果见表1。
2.2 提取溶剂的选择分别考察了乙腈、丙酮和乙酸乙酯3种有机溶剂对西瓜和黄瓜样品中吡唑萘菌胺及其代谢物提取效率的影响。结果 (表2) 表明：3种提取溶剂的回收率均符合农药残留分析的要求，但用乙酸乙酯时回收率相对较低，而用乙腈提取时对色素等杂质吸附最少，基质干扰较小，能有效降低仪器耗损，因此最终选择乙腈作为提取溶剂。
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表 2 三种提取溶剂下吡唑萘菌胺及其代谢物的平均回收率及相对标准偏差 Table 2 The average recovery and RSD of isopyrazam and its metabolites using three extraction solvents |
2.3 吸附剂的选择
PSA、GCB及C18 是目前常用的农药残留分析吸附剂。本研究考察了50 mg PSA + 50 mg C18、25 mg PSA + 25 mg C18 + 25 mg GCB、50 mg PSA + 50 mg GCB和50 mg PSA 4种不同组合的吸附剂对样品的净化效果以及对目标物回收率的影响。结果 (图1) 显示：4种吸附剂对样品均有较好的净化效果，但以50 mg PSA + 50 mg GCB和25 mg PSA + 25 mg C18 + 25 mg GCB作吸附剂时，SYN534969的回收率偏低，分别为45.13%和58.67%；以50 mg PSA作吸附剂时，CSCD459488和CSCD459489回收率偏高，分别为136.81%和137.01%，可能是由于基质效应的原因；而以50 mg PSA + 50 mg C18作吸附剂时，4种化合物回收率均在70%~120%之间，满足残留分析要求[19]。因此本研究选择50 mg PSA + 50 mg C18为吸附剂。
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图 1 四种吸附剂对吡唑萘菌胺及其代谢物回收率的影响 Fig. 1 Effects of four adsorbents on the recoveries of isopyrazam and its metabolites |
2.4 线性关系与定量限
结果 (表3) 表明：在质量浓度1~500 μg/L范围内，西瓜与黄瓜基质中吡唑萘菌胺SYN534968、SYN534969及其代谢物CSCD459488、CSCD459489的质量浓度与对应的峰面积间均呈现良好的线性关系，r为0.994 3~0.999 9，定量限 (LOQ，S/N = 10) 为0.3~0.6 μg/kg，检出限 (LOD，S/N = 3) 为0.1~0.2 ng，说明本研究所建立方法有较高的灵敏度，适用于痕量吡唑萘菌胺及其代谢物残留的检测。
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表 3 吡唑萘菌胺及其代谢物在西瓜和黄瓜基质中的线性方程、相关系数、检出限和定量限（1~500 μg/L） Table 3 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection and limits of quantification in watermelon and cucumber samples of isopyrazam and its metabolites (1-500 μg/L) |
2.5 方法的准确度和精密度
在西瓜和黄瓜空白样品中分别添加0.01、0.1和1 mg/kg 3个水平的吡唑萘菌胺及其代谢物混合标准溶液，每个水平重复5次，按上述试验方法进行测定。结果 (表4) 显示：在3个添加水平下，吡唑萘菌胺及其代谢物在西瓜中的回收率在70%~105%之间，相对标准偏差 (RSD，n = 5) 在3.4%~13%之间；在黄瓜中的回收率在82%~104%之间，RSD(n = 5) 在1.3%~9.3%之间，均符合农药残留分析要求[19]。典型色谱图见图2。
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表 4 吡唑萘菌胺及其代谢物在西瓜和黄瓜样品中的添加回收率及相对标准偏差 (n = 5) Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of isopyrazam and its metabolites in watermelon and cucumber samples (n = 5) |
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a. TPP；b. SYN534968；c. SYN534969；d. CSCD459488；e. CSCD459489 图 2 添加吡唑萘菌胺及其代谢物 (A)(1 mg/kg) 和西瓜空白样品 (B) 色谱图 Fig. 2 Chromatograms of spiked sample with isopyrazam and its metabolites at 1 mg/kg (A) and watermelon blank sample (B) |
2.6 与已有方法比较
与其他吡唑萘菌胺及其代谢物残留分析方法相比 (表5)，本方法采用20 mL乙腈作为提取溶剂，溶剂用量少，经济、环保；前处理时间约为15 min，简单、快速；方法回收率为70%~105%，定量限 (LOQ) 为0.3~0.6 μg/kg，准确度与精密度高，可作为西瓜与黄瓜中吡唑萘菌胺及其代谢物残留检测的分析方法。
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表 5 本方法与其他吡唑萘菌胺及其代谢物残留检测分析方法的比较 Table 5 Comparison of this method with other methods for the determination of isopyrazam and its metabolites |
2.7 实际样品检测
从北京地区施用29%吡唑萘菌胺悬浮剂的西瓜样品中随机抽取5个，用本研究建立的方法对样品中吡唑萘菌胺及其代谢物的残留量进行分析。结果显示，所有被测西瓜样品中均未检出代谢物CSCD459488和CSCD459489残留，但吡唑萘菌胺顺式SYN534968和反式SYN534969均有检出，残留量结果见表6。图3为1号样品色谱图。
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表 6 西瓜实际样品检测中吡唑萘菌胺残留量 Table 6 Residue of isopyrazam in the detection of watermelon samples |
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a. TPP；b. SYN534968；c. SYN534969. 图 3 1号西瓜样品色谱图 Fig. 3 Chromatograms of watermelon sample No.1 |
从北京某超市中随机抽取黄瓜样品5个，用本研究所建立的方法对样品中吡唑萘菌胺及其代谢物残留进行检测分析。结果均未有吡唑萘菌胺及其代谢物被检出。
3 结论本研究建立了一种以分散固相萃取作为前处理技术，气相色谱-串联质谱快速检测西瓜和黄瓜中吡唑萘菌胺SYN534968、SYN534969及其代谢物CSCD459488、CSCD459489残留的分析方法。该方法前处理简单、快速，线性关系良好，有较高的准确度和灵敏度，适用于西瓜和黄瓜中吡唑萘菌胺及其代谢物残留的检测，可为吡唑萘菌胺及其代谢物的安全性评价提供一定的理论基础。
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