2018, Vol. 20
2. 浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司，杭州 311500
, WANG Lei1, ZHAO Di1, ZHENG Zehua1, JING Dibo1, JIA Xiaoqin1, LU Yuele1, LI Zhong2, CHEN Xiaolong1
2. Zhejiang Tonglu Huifeng Biotechnology Co., LTD, Hangzhou 311500, China
植物化感物质 (allelochemical) 主要为植物的次生代谢物，可对周围环境中的其他植物或微生物产生促进、排斥或抑制作用[1]。研究发现，包括水稻、高粱等在内的30多个科中，有近百种植物可分泌化感物质[2]。由于具有安全、高效及无环境污染等特点，化感物质已成为解决除草问题的最佳选择，有着广阔的应用前景[3]。目前已有多种化感物质被成功开发为除草剂或其前体，如以红千层Callistemon spp. 中纤精酮 (leptospermone) 为前体开发的三酮类 (triketone) 除草剂[4]和以桉树中1,4-桉树脑的衍生物 (1,4-cineole derivatives) 为前体开发的除草剂环庚草醚 (cinmethylin) [5]等，均已成功实现商品化，在作物增产、森林抚育及病虫害防治等方面发挥了重要作用[6]。
高粱素 (sorgoleone) 是目前研究和应用最为广泛的化感物质之一[7-8]，已被用于小麦和玉米等重要大田作物的杂草控制[9]。它是由高粱Sorghum bicolor 疏水根分泌的一种苯醌类化感物质，可对包括阔叶、单子叶和双子叶等在内多种杂草的生长表现出显著的抑制作用[10-11]。Einhellig等[12]发现，高粱素可通过抑制植物线粒体活性和光合作用II中的电子转移，减弱目标杂草对氧的吸收能力，从而影响叶绿素含量和光合速率，达到抑制杂草生长的目的。
从高粱中提取分离天然的高粱素常受限于其低含量，且环境、季节和区域的差异较大[13]，而全化学合成这类具有复杂结构的物质在经济上又明显不可行。因而，将高粱素生物合成途径中的相关酶系通过微生物进行异源表达，重建微生物体内高粱素合成的代谢途径，实现高粱素的生物合成显得尤为迫切和重要[14]。
目前，有关高粱素的生物合成途径已基本阐明 (图式 1)。由烷基间苯二酚合酶 (alkylresorcinol synthase，Sb_ARS) 催化脂肪代谢产物脂酰-CoA与丙二酰-CoA反应，生成5-烷基间苯二酚[15]是其生物合成的第一步反应，且为关键的限速反应[16]。此外，由于细胞破碎是提取胞内产物最难且最复杂的步骤，也是构建Sb_ARS高通量筛选体系最为关键的步骤之一。因此，在实现高粱素大规模生产的目标下，笔者以大肠杆菌E. coli BL21 (DE3) 为宿主，采用化学合成法获得经碱基序列优化的Sb_ARS基因，构建了一种由温敏诱导启动子λ cI857/pRpL串联SRRz基因和由lac启动子串联Sb_ARS基因构成的双控表达质粒pBM123-ars，实现了Sb_ARS在可温控自裂解大肠杆菌中的异源表达，并在此基础上，对影响其表达效率的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG) 终浓度、温控策略及时长策略进行优化，提高了Sb_ARS酶活力和重组菌的裂解率，以期为Sb_ARS高通量筛选体系的构建及新型除草剂高粱素的生物合成工业化生产奠定基础。
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DES：脂肪酸去饱和酶；OMT：甲基转移酶；P450：细胞色素P450。 DES: fatty acid desaturase; OMT: O-methyltransferase; P450: cytochrome P450. 图式1 高粱素的生物合成途径[16] Scheme1 Proposed biosynthetic pathway of sorgoleone[16] |
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 菌株和质粒
宿主菌大肠杆菌E. coli BL21 (DE3) 及pUC18、pBV220等质粒均由本实验室保藏。Sb_ARS基因 (GenBank：Sb08g003170) 经密码子优化后，预设酶切位点KpnI和Sac I，交由青兰生物科技 (无锡) 有限公司进行合成。
1.1.2 主要试剂Taq DNA聚合酶、质粒制备试剂盒及DNA纯化试剂盒等购自杰瑞生物工程 (上海) 有限公司；T4 DNA连接酶及限制性内切酶购于宝生物工程 (大连) 有限公司和New England Biolabs (北京) 公司；引物合成及测序工作由生工生物工程 (上海) 公司 (上海生工) 完成；丙二酰-CoA、长链饱和脂酰-CoA[棕榈酰-CoA (C16:0)]，及5-pentadecyl resorcinol标准品 (alkylresorcinol standard C15:0) 购于Sigma Aldrich公司。氨苄青霉素 (ampicillin，Amp)、IPTG及λ噬箘体DNA裂解液购于上海生工。其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基配方LB (Amp) 培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、Amp 0.05 g/L，pH 7.5，Amp与IPTG由0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，其他培养基成分均在121 ℃灭菌20 min。
1.2 试验方法 1.2.1 双控质粒的构建及转化采用在线软件GenScript[17] 对Sb_ARS基因序列进行针对大肠杆菌密码子的偏好性分析及低使用率密码子同义转化。调节Sb_ARS基因中的GC百分比，使得优化后基因的GC含量接近大肠杆菌基因的GC含量。在此基础上，通过RNA structure软件计算Sb_ARS基因的mRNA二级结构自由能，验证优化结果。
本研究构建了一种集培养、产酶、裂解于一体的双控表达质粒pBM1230-ars，其主要包含3部分：①氨苄抗性基因 (AmpR)、复制起始位点序列 (ori) 及强终止子 (rrnBt1t2)；②由温控启动子λ cI857/pRpL串联SRRz基因构成的温控自裂解元件；③由lac启动子串联β-半乳糖苷酶基因lacZα (内含多克隆位点，可插入Sb_ARS基因) 构成的IPTG诱导表达及蓝白斑筛选元件。
双控表达质粒pBM1230-ars按图1所示方法构建。首先，以λ噬箘体DNA为模板，SRRz-F及SRRz-R为引物 (表1)，经PCR扩增得SRRz片段 (图1-A)。扩增产物经电泳检验、回收，双酶切后与质粒pBV220 (图1-B) 连接并转化E. coli BL21 (DE3) 感受态细胞[18]。通过抗性及菌落PCR筛选阳性克隆，提取重组质粒pBV220-SRRz (图1-C) 并以其为模板，以cI857/pRpL-F和cI857/pRpL-R为引物，扩增得到包括温控启动子、裂解基因及终止子的cI857/pRpL-SRRz-rrnBt1t2片段 (图1-D)。扩增产物经电泳检验、回收，双酶切后连接至质粒pUC18 (图1-E) 并转化E. coli BL21 (DE3) 感受态细胞[19]。经抗性及菌落PCR筛选阳性克隆并提取质粒pBM1230 (图1-E)，双酶切后与目的基因ars (图1-G) 连接，构建重组表达质粒pBM1230-ars (图1-H)。经抗性和蓝白斑筛选阳性克隆，设计引物CXARS-F/CXARS-R及CXSRRz-F/CXSRRz-R (表1)，扩增温控裂解元件和IPTG调控元件，送上海生工进行测序验证。
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图 1 Sb_ARS双控表达质粒构建路线图 Fig. 1 Schematic representation of the construction of Sb_ARS dual expression plasmid |
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表 1 引物序列 Table 1 Sequence of primers |
1.2.2 大肠杆菌的培养与诱导表达
将E. coli BL21 (DE3)/pBM1230-ars接入LB (Amp) 培养基，于27 ℃、200 r/min下摇瓶培养12 h。按6%的接种量接于装有50 mL LB (Amp) 培养基的250 mL三角瓶中，在27 ℃、200 r/min条件下振荡培养4 h至OD600值约为0.4。加入IPTG (终浓度1 mmol/L) 诱导Sb_ARS表达4 h后，升温至38 ℃进行热诱导SRRz表达2 h。诱导表达结束后，将温度降至27 ℃继续培养3 h[20]。在IPTG诱导表达阶段，以去离子水代替IPTG (终浓度1 mmol/L) 诱导目标蛋白Sb_ARS表达，作为重组菌经热诱导但无IPTG诱导的对照；在热诱导表达阶段，以27 ℃代替38 ℃进行热诱导SRRz表达，作为重组菌经IPTG诱导但无热诱导的对照。收集培养液和菌体，测定重组菌的裂解率及Sb_ARS酶活力。
在诱导表达条件的优化中，考察了IPTG终浓度 (0.4~1.4 mmol/L)、温度和时间控制策略对重组菌裂解率及Sb_ARS酶活力的影响。
1.2.3 Sb_ARS的分离及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析将双控诱导表达后的培养液于4 ℃、13 000 r/min下离心15 min。收集上清液经透析后用蛋白超滤管浓缩，得胞外粗酶液。收集菌体，重悬于裂解缓冲液 (50 mmol/L Tris-Cl，pH 7.2，5%甘油，50 mmol/L NaCl) 中，在液氮和25 ℃水浴中重复冻融3次，再于冰浴中进行超声波破碎 (振幅：300 W；超声循环：超声3 s，间隔3 s，时间 4 min)。将超声破碎后的菌体于4 ℃、13 000 r/min离心15 min，收集上清液经透析和蛋白超滤管浓缩后，得胞内粗酶液[21]。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS-PAGE) 验证重组蛋白的表达[22]。
1.2.4 Sb_ARS酶活力测定以0.3 mmol/L棕榈酰-CoA为起始底物，以0.7 mmol/L丙二酰-CoA为延伸底物，加入20 μL粗酶液，以50 mmol/L、pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液补足200 μL，于30 ℃反应60 min。通过添加50 μL甲醇终止反应及萃取产物[23]。于13 000 r/min离心1 min，分离上层有机相，真空干燥后收集产物5-烷基间苯二酚，采用高效液相色谱 (HPLC) 法测其含量[24]。HPLC检测条件：安捷伦Zorbax SB-C18反相色谱柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)。流动相：线性梯度洗脱，50%~100%甲醇-水 (含体积分数为0.1% 的三氟乙酸)，10 min；等强度洗脱，100%甲醇，5 min。流速1 mL/min，检测波长286 nm。
一个酶活力单位 (μmol/min) 定义为：每1 min催化产生1 μmol 5-烷基间苯二酚所需的酶量。重组酶活力以胞外粗酶液的相对酶活力表示[16]，即定义IPTG终浓度优化后的最大Sb_ARS酶活力为100%酶活力。
1.2.5 裂解率测定以同一诱导条件下的胞外Sb_ARS酶活力与总Sb_ARS酶活力 (胞外和胞内酶活力之和) 的比值作为重组菌的裂解率[25]。
1.2.6 数据分析处理每个试验重复3次，数据分析采用Excel和SPSS 18软件进行，其中多重比较基于Duncan法进行。以P < 0.05、P < 0.01及 P < 0.001分别表示在统计学上存在差异、差异显著和差异极显著。
2 结果与分析 2.1 Sb_ARS密码子优化及双控质粒的构建经密码子偏好性分析，发现Sb_ARS基因序列的密码子适应指数 (CAI) 仅为0.59，即大肠杆菌与高粱的密码子偏好性差异较大。因此，为使该基因在大肠杆菌中实现高效表达，需对其序列进行密码子优化。经GenScript进行密码子优化后，Sb_ARS基因序列的CAI值提高至0.89，同时其GC含量由66.50%调整至54.04%。与原序列相比，优化后的基因序列在提高编码丰度高的氨基酸密码子使用率的同时，GC含量仍处于最优范围。经RNA structure计算后发现，优化后Sb_ARS的mRNA二级结构能从 –543.27 kal/mol调整至 –437.60 kal/mol。理论上，优化后的基因能更好地在大肠杆菌中进行表达。
按图1所示方法构建双控表达质粒pBM1230-ars，分别设计引物并对温控裂解元件和IPTG调控元件进行测序，结果表明温控裂解元件 (2 850 bp) 和IPTG调控元件 (1 691 bp) 片段序列正确。
2.2 双控质粒中Sb_ARS的表达按1.2.2节方法进行双控诱导表达后，收集上清液进行SDS-PAGE检测，考察SRRz和Sb_ARS的表达情况，结果如图2所示。其中，泳道1为进行热诱导但不进行IPTG诱导的重组菌蛋白电泳情况，该条带呈现明显的胞内蛋白电泳特征，说明通过升温能成功诱导裂解蛋白SRRz进行功能性表达，进而实现大肠杆菌的自裂解；而在依次进行IPTG和热诱导后，泳道2在43 kDa附近有明显的特异条带，说明重组菌在IPTG诱导表达后有新蛋白产生，且分子质量与Sb_ARS蛋白的理论预测分子质量44 kDa基本一致。
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M：蛋白分子质量标准；1：不进行IPTG诱导但进行热诱导的重组菌蛋白电泳图；2：依次进行IPTG诱导和热诱导的重组菌蛋白电泳图。 M: Protein marker；1: SDS-PAGE analysis of the solution expression of recombinant E. coli with heat-induction and no IPTG induction；2: SDS-PAGE analysis of the solution expression of recombinant E. coli with heat-induction and IPTG induction. 图 2 E. coli BL21 (DE3)/pBM1230-ars的诱导表达电泳图 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of induction expression of E. coli BL21 (DE3)/pBM1230-ars |
2.3 Sb_ARS表达条件优化 2.3.1 IPTG浓度对裂解率及Sb_ARS酶活力的影响
启动子是控制外源基因转录的重要调控元件。在对双控质粒表达条件的优化中，首先考察了IPTG终浓度对裂解率及Sb_ARS酶活力的影响，结果见图3。考察范围内的IPTG终浓度对由lac启动子调控的目的基因的表达存在影响 (P < 0.05)，过低或过高的IPTG终浓度均不利于 Sb_ARS的表达，其中，当IPTG终浓度为0.8 mmol/L时，重组菌所表达的Sb_ARS酶活力最大 (为0.16 μmol/(min·μL粗酶液)，定义为100%酶活力)；此外，IPTG浓度变化对温敏诱导启动子无影响 (P > 0.05), 其重组菌裂解率基本维持在46.03% ± 5.58%范围内。
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0C：对照，经热诱导无IPTG诱导；1.0C：对照，经IPTG诱导无热诱导。*表示在0.05水平无显著性差异；不同大小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著。 0C: control, by heat-induction without IPTG-induction; 1.0C: control, by IPTG-induction without heat-induction. * Indicate no difference at 0.05 levels；different capital and small letters indicate significant difference at 0.01 and 0.05 levels. 图 3 IPTG添加量对Sb_ARS酶活力及重组菌裂解率的影响 Fig. 3 Effect of IPTG amount on the Sb_ARS activity and cell lysis efficiency of recombinant E. coli |
2.3.2 各反应阶段温度对裂解率及Sb_ARS酶活力的影响
温敏诱导启动子λ cI857/pRpL来源于λ噬箘体，当菌体培养温度由27 ℃升至38 ℃时，阻遏蛋白cI857失活，后续基因得以表达[17]。在IPTG诱导Sb_ARS表达完成后，通过升温诱导λ cI857/pRpL启动子调控SRRz表达，使裂解重组菌达到释放胞内酶的效果。与重组菌E. coli BL21 (DE3)/pBM1230-ars诱导表达相关的温度设置可分为5个阶段：种子过夜培养 (过夜培养)、菌体增殖培养 (菌体培养)、IPTG诱导目的基因表达 (IPTG诱导)、升温诱导SRRz表达 (热诱导) 及SRRz裂解重组菌 (SRRz裂解)。针对各阶段分别设置两个温度水平，考察温度对裂解率及Sb_ARS酶活力的影响。
在依次经历图4-I所示温控策略进行温度和IPTG双控诱导表达后，重组菌裂解率和Sb_ARS酶活力分别如图4-II和图4-III所示。经方差分析 (表2，F值) 显示，4个阶段温度控制对裂解率的影响显著性顺序为：IPTG诱导 > SRRz裂解 > 菌体培养 > 过夜培养，对 Sb_ARS酶活力影响的显著性顺序为：菌体培养 > IPTG诱导 > SRRz裂解 > 过夜培养。同时，P值显示：IPTG诱导温度对裂解率及Sb_ARS酶活力均有影响，且对裂解率的影响达到了极显著程度 (P < 0.001)；菌体培养温度对 Sb_ARS酶活力的影响极显著 (P < 0.001)，但对裂解率却没有影响；SRRz裂解温度仅对裂解率有影响；而过夜培养温度对裂解率及Sb_ARS酶活力均没有影响 (P > 0.05)。
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I-与诱导表达相关的16种不同阶段的温控设置 (1~16)；II-不同温控设置下的重组菌裂解率；III-不同温控设置下的Sb_ARS酶活力。不同大、小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著。 I-Sixteen temperature combinations (1-16) at different stages during recombinant E. coli induction expression; II-Lysis efficiencies using different temperature combinations; III-Sb_ARS activity using different temperature combinations. Different capital and small letters indicate significant difference at 0.01 and 0.05 levels. 图 4 各反应阶段温度对重组菌裂解率及Sb_ARS酶活力的影响 Fig. 4 The effects of temperature at different stages on cell lysis efficiencies and Sb_ARS activity of recombinant E. coli |
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表 2 各反应阶段温度对裂解率及Sb_ARS酶活力的影响方差分析结果 Table 2 The ANOVA results of temperature on cell lysis efficiency and Sb_ARS activity of recombinant E. coli |
在影响极其显著的阶段，IPTG诱导温度对裂解率呈正效应 (图4-II)。当IPTG诱导温度较高 (30 ℃) 时，温控策略中的1、2、6、10和14的裂解率可达60%以上，其中，策略2的裂解率可提升至64.42% ± 3.09% (Sb_ARS酶活力为126.28% ± 9.81%)。此外，菌体培养温度对Sb_ARS酶活力也呈正效应 (图4-III)。当菌体培养温度较高 (30 ℃) 时，温控策略中的1、2和9的Sb_ARS酶活力均达125%以上，其中，温控策略1中，Sb_ARS酶活力为129.56% ± 8.23% (裂解率为60.68% ± 2.08%)。综合考虑后，最终选择温控策略2 (过夜培养：30 ℃，菌体培养：30 ℃，IPTG诱导：30 ℃，SRRz裂解：27 ℃) 作为重组菌诱导表达的温度设置。
2.3.3 各反应阶段时长对裂解率及Sb_ARS酶活力的影响在依次经历如图5-I所示时间控制策略进行温度和IPTG双控诱导表达后，重组菌的裂解率和Sb_ARS酶活力分别如图5-II和图5-III所示。经方差分析 (表3，F值) 得出，3个阶段反应时长控制对Sb_ARS酶活力和裂解率影响的显著性顺序均为IPTG诱导 > 菌体培养 > SRRz裂解。同时，P值显示：菌体培养和IPTG诱导时长对裂解率及Sb_ARS酶活力的影响均极显著 (P < 0.001)，而 SRRz裂解时长对重组菌的裂解率及Sb_ARS酶活力均没有影响 (P > 0.05)。
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I-与诱导表达相关的不同阶段的时长设置 (1~18)；II-不同时长设置下的重组菌裂解率；III-不同时长设置下的Sb_ARS酶活力。不同大、小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著。 I. Eighteen time-consumed combinations (1-18) at different stages during recombinant E. coli induction expression；II. Lysis efficiencies using different time-consumed combinations；III. Sb_ARS activity using different time-consumed combinations. Different capital and small letters indicate significant difference at 0.01 and 0.05 levels. 图 5 各反应阶段时长对裂解率及Sb_ARS酶活性的影响 Fig. 5 The effects of duration setting at different stages on cell lysis efficiencies and Sb_ARS activity of recombinant E. coli |
影响显著因子 (菌体培养和IPTG诱导时长) 对重组菌裂解率及Sb_ARS酶活力的效应也存在一定差异 (图5)。菌体培养时长对裂解率和Sb_ARS酶活力均呈正效应，而IPTG诱导时长仅对Sb_ARS酶活力呈正效应，对裂解率却呈负效应。比如：当菌体培养时长为4 h，控制IPTG诱导时长为2 h时 (策略13、14)，裂解率可达82.30% ± 2.65%，而Sb_ARS酶活力仅为117.16% ± 4.81%；控制IPTG诱导时长为6 h时 (策略17、18)，Sb_ARS酶活力可达159.48% ± 7.33%，而裂解率仅为61.66% ± 3.11%。其中，策略14 (菌体培养 4 h，IPTG诱导 2 h，SRRz裂解 6 h) 可获得最高的裂解率82.81% ± 3.14% (Sb_ARS酶活力为117.72% ± 7.26%)；而策略18 (菌体培养 4 h，IPTG诱导 6 h，SRRz裂解 6 h) 可获得最高的Sb_ARS酶活力160.04% ± 8.12% (裂解率为62.16% ± 3.59%)。
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表 3 各反应阶段时长对裂解率及Sb_ARS酶活力的影响方差分析结果 Table 3 The ANOVA results of duration setting on cell lysis efficiency and Sb_ARS activity of recombinant E. coli |
3 结论与讨论
简化异源宿主胞内蛋白表达的提取过程，是实现高粱素等新化合物生物合成的前提和基础[26]。本研究通过在质粒构建中引入温控启动子 λ cI857/pRpL 串联 SRRz 基因构成的温控自裂解元件，构建双控质粒pBM1230-ars 并转化 E. coli BL21 (DE3)，实现了Sb_ARS异源表达后的宿主菌自裂解。
本研究通过对温度和IPTG双控诱导表达涉及的IPTG浓度、温度控制和时间控制策略等因素进行优化，发现IPTG诱导和菌体培养阶段的控制对双控诱导表达体系至关重要。其中，IPTG终浓度对Sb_ARS的表达存在显著影响，但对裂解率却没有影响。本研究结果与Xu等[18]的结果一致，证明IPTG诱导温度和时长对宿主菌的裂解率及Sb_ARS酶活力均具有显著影响：提高IPTG诱导温度至30 ℃可提高裂解率和Sb_ARS酶活力；延长IPTG诱导时长可提高Sb_ARS酶活力，但会降低裂解率。此外，提高培养温度能极其显著地提高Sb_ARS酶活力，这可能与30 ℃下宿主菌的生理活性较27 ℃时有所增强有关[19]。延长菌体培养时间至4 h能极显著地提高Sb_ARS酶活力与裂解率，这可能与培养温度降低后宿主菌的延滞期延长有关。
总之，当对重组菌E. coli BL21 (DE3)/pBM1230-ars进行双控诱导表达时，最适反应条件为：30 ℃培养4 h，加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG，于30 ℃诱导Sb_ARS进行表达后，再于38 ℃进行热诱导SRRz表达2 h。如果经IPTG诱导2 h后再进行热诱导裂解，则可获最高裂解率 (82.81% ± 3.14%)；如果经IPTG诱导6 h后再进行热诱导裂解，则可获得最高Sb_ARS酶活力 (160.04% ± 8.12%)。所得成果可为新型除草剂高粱素的生物合成奠定理论基础。
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