2017, Vol. 19
亚胺唑 (imibenconazole，结构式见图式 1) 是一种新型三唑类杀菌剂，杀菌谱广，具有内吸性，兼有治疗和预防活性，主要用于防治苹果黑星病、锈病、白粉病、煤斑病及梨黑星病等，以及葡萄、柑橘等作物上的病害[1]。中国国家标准[2]规定，亚胺唑在柑橘和苹果中的临时最大残留限量 (MRL) 为1 mg/kg，在青梅和葡萄中的临时MRL值为3 mg/kg，但目前在高脂类食品中尚未见其相关限量标准，也未见有相应的检测方法标准。
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图式 1 亚胺唑的结构式 Scheme1 Structural formula of imibenconazole |
目前关于亚胺唑分析涉及的基质主要集中于水果与土壤。李薇等[3]报道了梨及土壤中亚胺唑及其代谢物的气相色谱分析方法，前处理采用弗罗里硅土层析柱净化，亚胺唑的回收率为88%~98%；蔡智华等[3]建立了葡萄及土壤中亚胺唑残留量的分析方法，其添加回收率分别在83%~92%和87%~93%之间，最低检出浓度分别为0.03 mg/kg和0.02 mg/kg；Sousa等[4]应用分散固相萃取技术联合气相色谱-单四极杆质谱 (GC-SQ/MS) 法检测了巴西甜瓜中的农药多残留，其定量限 (LOQ) 为0.15 mg/kg；Walorczyk等[5]采用混合分散固相萃取联合气相色谱-串联质谱法 (GC-MS/MS) 测定了葡萄酒中160种农药残留，其LOQ为0.01 mg/kg。迄今为止，有关含油食品中亚胺唑残留量的检测鲜见报道。
含油食品前处理方法大多采用凝胶渗透色谱法 (gel permeation chromatography, GPC) [6]和固相萃取法 (solid phase extraction, SPE) [7]。GPC法仪器昂贵，操作繁琐；SPE方法样品转移次数较多，操作繁琐耗时，系统误差较大。分散基质固相萃取技术是一种快速、简单、准确及环保的前处理技术，可有效去除基质干扰[8]，近年来在含油食品[9]、基质复杂食品[10-11]及中草药[12]等样品前处理中得到广泛应用，其中分散吸附剂的选择与用量是其应用的关键[13-14]。基于此，本研究将分散固相萃取技术应用于含油食品 (核桃、花生油和干辣椒粉) 中亚胺唑残留量的测定，同时考察了吸附剂种类与用量等影响因素，最终采用基质标准校正法实现了含油食品中亚胺唑的定量分析。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂Agilent 7890A气相色谱仪 (美国安捷伦公司)，配备ECD检测器 (分流/不分流进样口)；BSA224S-CW万分之一电子天平 (德国Sartorius公司)；LDZS-2高速离心机 (北京京立离心机公司)；MS3 D S25漩涡混合器 (德国IKA公司)；KQ-500 DB超声波清洗仪 (昆山市超声仪器公司)；T25 D均质机 (德国IKA公司)；RV10 D旋转蒸发仪 (德国IKA公司)；50 mL离心管 (美国康宁公司)；0.22 μm有机系微孔滤膜。
亚胺唑 (imibenconazole) 标准品 (99.0%，德国Dr. Ehrenstorfer公司)；正己烷和乙腈 (HPLC级，美国Fisher公司)；甲苯和无水硫酸镁 (分析纯，国药集团)；N-丙基乙二胺吸附剂 (PSA，40~60 μm)、十八烷基键合硅胶吸附剂 (C18，粒径50 μm，孔径6 μm) 和 Cleanert MAS-QuEChERS 净化剂 (400 mg PSA、400 mg C18、400 mg PC、1.2 g无水MgSO4，15 mL)(均为天津博纳艾杰尔公司)。
核桃、花生油和干辣椒粉样品均采购于山东济南华联超市。
1.2 标准溶液制备称取0.01 g (精确至0.000 1 g)亚胺唑标准品，用丙酮定容至10 mL，配制成1 000 mg/L的标准储备液；再用正己烷稀释成100 mg/L的标准储备液，于0~4 ℃冰箱中贮存。根据需要用正己烷逐级稀释成相应质量浓度的标准工作溶液。
1.3 样品前处理称取2 g (精确到0.01 g)待测样品于50 mL离心管，加入25 mL乙腈，涡旋混合1 min，超声提取20 min；加入3 g氯化钠，涡旋混合1 min；于4 800 r/min下离心5 min。取上层有机相10 mL于150 mL梨形瓶中，于0 ℃下真空旋转蒸发至近干，用乙腈定容至6 mL，待净化。
准确称取300 mg PSA、300 mg C18和900 mg无水硫酸镁粉末于15 mL离心管中，将待净化液全部转入，于4 800 r/min下离心5 min；取上层有机相3 mL于150 mL梨形瓶中，于40 ℃下真空旋转蒸发至近干，用正己烷定容至2 mL，过0.22 μm滤膜，待测。
1.4 色谱条件Agilent 122-5032 DB-5色谱柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度280 ℃；检测器温度310 ℃；载气为氮气，流速2 mL/min；尾吹气流速55 mL/min；柱温采用程序升温模式，见 表1；进样量2 μL；分流进样，分流比为2 : 1。
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表 1 程序升温表 Table 1 Temperature programming |
2 结果与讨论 2.1 色谱条件优化
笔者先按文献[3]报道的色谱条件进行了测定。结果显示，亚胺唑峰型较好，无拖尾，保留时间5.62 min。考虑到亚胺唑响应情况，在240~280 ℃范围内优化了进样口温度，发现当进样口温度为280 ℃时，亚胺唑的响应值最高；考虑到亚胺唑与基质的分离情况，在1.0~3.5 mL/min范围内优化了载气流速，最终确定载气流速为2 mL/min。采用程序升温方法可使亚胺唑与杂质分离效果最优，且缩短了保留时间；同时采用分流进样方式，分流比为2 : 1。优化后0.05 mg/L的亚胺唑标准溶液的色谱图见图1，可见亚胺唑峰型良好，保留时间为15.68 min。
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图 1 亚胺唑标准溶液色谱图 (0.05 mg/L) Fig. 1 Chromatogram of imibenconazole standard solution (0.05 mg/L) |
在上述色谱条件下，研究了亚胺唑在核桃、花生油及干辣椒粉中的出峰情况。结果(图2)表明，在亚胺唑保留时间处没有杂质峰出现，即3种基质中无杂质干扰目标物。
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A：核桃；B：花生油；C：干辣椒粉 A: Walnut; B: Peanut oil; C:Red chilli powder 图 2 三种基质空白色谱图 Fig. 2 Chromatogram of three matrixes |
2.2 上样体积对基质净化效果的影响
本研究所用提取液的体积为25 mL，离心后最大可移取体积为20 mL。以商品化Cleanert MAS-QuEChERS净化剂净化提取液，所用提取液体积为10 mL，测试后发现亚胺唑的回收率基本为零。由此，在保证各种净化剂比例不变的前提下减少了净化剂总用量。分别研究了净化剂质量为1.8、1.2和0.6 g，上样体积为5 mL时的净化效果。发现当净化剂为0.6 g时，净化液旋蒸后平底烧瓶内仍有大量油珠；当净化剂为1.8 g和1.2 g时，净化后烧瓶内基本无油珠，但亚胺唑的添加回收率仍基本为零。为此，又考察了300 mg PSA、300 mg C18和900 mg硫酸镁混合净化效果，同时考察了5、10、15和20 mL上样体积对净化效果的影响。结果发现：上样体积越大，净化后的浓缩液颜色越深，净化液旋蒸后平底烧瓶内油珠越多。当上样体积为5 mL时，瓶壁及瓶底基本无油珠，残留物颜色最浅。但若上样体积为5 mL，待测样品液中目标物的实际浓度也较低，仅为0.006 mg/L。综合考虑，最终选择将10 mL提取液浓缩为6 mL后上样，发现比直接将10 mL提取液上样所得残留物的颜色浅，且残留物液滴尺寸更小。
2.3 分散固相萃取吸附剂选择及用量优化GCB表面具有正六元环结构，对平面分子有极强的亲和力，能够分离或提取出蔬菜中叶绿素和类胡萝卜素等色素及固醇类杂质[15]。鉴于亚胺唑分子结构中含有2个苯环，有一定的平面结构，故首先选择GCB，并对其用量进行了优化。选择50、100、200和300 mg GCB分别与PSA (300 mg)、C18 (300 mg) 及MgSO4 (900 mg) 等吸附剂混合进行试验，亚胺唑的添加水平为0.1 mg/kg。结果发现，添加GCB会显著减小亚胺唑的回收率，即使添加量为50 mg，亚胺唑在核桃、花生油和干辣椒粉中的回收率也仅为8.4%~8.9%。因此继续减少GCB用量，分别选择5、10、25 mg进行试验，发现随着GCB用量的减少，亚胺唑的回收率有所提高，但即使GCB的用量为5 mg，亚胺唑在3种基质中回收率也仅在62.3%~67.4%之间，无法满足农药残留分析要求。因此，在后续前处理优化过程中决定不添加GCB。
C18是一种非极性、广谱的净化吸附剂，能有效去除提取物中的非极性杂质[14]；PSA是高纯硅胶基质极性吸附剂，能有效去除样品中有机酸、脂肪酸和糖等干扰物质，对极性色素有一定吸附效果[13]。因此，本研究继续考察了PSA和C18混合粉末的净化效果。其用量分别设为50、100、200、300和400 mg，当优化一种吸附剂条件时，另一种吸附剂用量保持在300 mg。结果发现：PSA和C18的用量对亚胺唑的回收率没有显著影响，回收率均在80%~110%之间 (图3和图4)；但其对色素及脂肪酸等杂质的吸附效果有显著影响，即随着加入量的增加，净化液的颜色逐渐变淡，旋蒸后瓶底的油珠量逐渐减少。当PSA、C18的用量分别为200 mg时，净化液旋蒸后瓶底基本无油珠量，但净化液仍有一定颜色。综合复杂基质去除效果及成本，最终选择PSA和C18分散固相萃取净化剂的用量分别为300 mg。
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图 3 PSA吸附剂用量对亚胺唑回收率的影响 Fig. 3 The effect of PSA content on the recovery of imibenconazole |
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图 4 C18吸附剂用量对亚胺唑回收率的影响 Fig. 4 The effect of C18 content on the recovery of imibenconazole |
2.4 方法有效性评价 2.4.1 基质效应
鉴于本研究在采用纯溶剂配制标准曲线进行定量时，3种基质对亚胺唑的响应值均有不同程度的增强效应，故按照Matuszewskib建议[16]，采用ME=Set2/Set1评价基质效应。其中：Set1为目标物标准溶液的响应峰面积；Set2为不同来源的生物样品基质提取后添加同浓度目标物所得的响应峰的面积。结果 (表2) 表明：3种基质对不同添加水平下亚胺唑的响应值均有不同程度的影响，其中干辣椒粉的基质效应最大。为了消除基质效应的影响，本研究按照欧盟DG SANCO/12495/2011[17]中规定，利用空白基质匹配标准溶液，以使之达到与样品中农药同等的响应值。
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表 2 不同基质对不同添加水平下亚胺唑响应值的影响 Table 2 The effect of different matrix on response of imibenconazole at different spiked level |
2.4.2 方法线性范围、检出限及定量限
在确定最佳测试条件后，配制0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1和10 mg/L的基质标准工作溶液进行测定，以峰面积对其质量浓度进行线性回归分析，并绘制标准曲线。结果 (表3) 表明，在0.005~10 mg/L范围内，亚胺唑的峰面积与其对应的质量浓度间呈良好的线性关系，相关系数 (r) > 0.99。以3倍信噪比计算，其检出限在3.51 × 10 –4~5.22 × 10 –4 mg/L之间；以最低添加浓度0.05 mg/kg为定量限。
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表 3 方法线性范围、回归方程、检出限及定量限 Table 3 Linear range, regression equation, LODs and LOQs of this method |
2.4.3 添加回收率与相对标准偏差
添加回收试验结果 (表4) 表明，在0.05、0.1和1 mg/kg添加水平下，亚胺唑在核桃、花生油及干辣椒粉中的添加回收率在82%~107%之间，相对标准偏差在3.0%~6.3%之间 (n = 5)。
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表 4 核桃、花生油及干辣椒粉中亚胺唑的添加回收率与相对标准偏差 (n = 5) Table 4 The recoveries and relative standard deviation of imibenconazole in walnut, peanut oil and red chilli powder (n = 5) |
2.4.4 方法重复性及相对标准偏差
为考察方法的重复性，由本实验室两名检测人员分别采用同样的检测方法，在短时间内对3种基质进行了添加回收试验，每次5个平行。结果 (表5) 表明：在0.05 mg/kg添加水平下，A人员所得测定值在0.041~0.051 mg/kg，相对标准偏差 (RSD) 在4.4%~8.6%；B人员所得测定值在0.041~0.053 mg/kg，RSD在7.4%~9.2%之间。在0.1 mg/kg添加水平下，A人员所得测定值在0.082~0.105 mg/kg，RSD在9.0%~14%之间；B人员所得测定值在0.085~0.106 mg/kg，RSD在8.4%~9.9%之间。在1 mg/kg添加水平下，A人员所得测定值在0.84~1.05 mg/kg，RSD在8.8%~9.7%之间；B人员所得测定值在0.81~1.06 mg/kg，RSD在7.8%~12%之间。表明该方法的回收率及相对标准偏差可满足农药残留检测方法的要求，并具有较好的重复性。
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表 5 方法重复性及相对标准偏差 (n = 5) Table 5 Repeatability and relative standard deviation of this method (n = 5) |
2.4.5 方法再现性
根据《GB/T5009.1—2003食品卫生检验方法理化部分总则》的规定、《GB/T 6379—2004 测试方法与结果的准确度》、《GB/T 2001.4—2001 标准编写导则第4部 分化学分析方法》及《农药残留检测方法编写指南》，邀请河南省粮油饲料产品质量监督检验中心、大连市食品检验所、山西省农业科学院农产品质量安全与检测研究所和浙江大学农药与环境毒理研究所进行了验证。经分析发现：在0.05 mg/kg添加水平下，上述4家单位与本项目实验室测得亚胺唑在3种基质中的回收率分别为82%~115%，RSD为2.4%~12%；在0.1 mg/kg添加水平下回收率为81%~110%，RSD为1.8%~12%；在1 mg/kg添加水平下为80%~112%，RSD为3.4%~12%。综合所有试验结果，计算实验室间相对标准偏差。由表6可知，在0.05、0.1和1 mg/kg添加水平下，核桃样品在不同实验室间的相对标准偏差在4.5%~5.4%之间，花生油样品在3.0%~3.5%之间，干辣椒粉在4.0%~6.2%之间，均可满足《农药残留检测方法编写指南》中农药残留分析要求。
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表 6 不同实验室间的方法再现性及相对标准偏差 (n = 5) Table 6 Reproducibility and relative standard deviation of interlaboratory (n = 5) |
综合5家实验室的验证数据进行统计分析，数据经科克伦 ((Cochran) 检验法检验方差齐性及格拉布斯 (Grubbs) 检验后，先计算重复性标准差 (Sr) 和再现性标准差 (SR)，再计算重复性相对标准差和再现性相对标准差。3种基质中亚胺唑重复性限r、再现性限R、重复性相对标准差及再现性相对标准差见表7。由表7可知：3种基质在0.05、0.1和1 mg/kg添加水平下，重复性限分别为0.008 23~0.010 2、0.225~0.283、0.194~0.264，再现性限为0.009 02~0.011 3、0.022 1~0.028 8、0.197~0.288；所有添加水平下重复性相对标准差为1.0%~13%，再现性相对标准差为0.9%~7.9%。方法重复性及再现性均可满足《农药残留检测方法编写指南》中农药残留分析要求。
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表 7 方法重复性相对标准差和再现性相对标准差 Table 7 Repeatability relative standard deviation and reproducibility relative standard deviation of this method |
3 结论
本研究采用分散固相萃取技术对核桃、花生油及干辣椒粉样品前处理进行优化，结合气相色谱分析建立了含油食品中亚胺唑残留的分析方法，各项性能指标均能满足残留分析要求。分散固相萃取技术，可有效去除含油食品中脂肪酸、色素等杂质，显著减小基质干扰，同时其过程简便快速，有机溶剂用量少，符合快速、绿色分析理念。本研究所建立分析方法将为含油食品中农药残留分析提供一定技术支持。
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