农药学学报  2017, Vol. 19 Issue (5): 569-575   PDF    
引用本文
汪汉成, 张敏, 张之矾, 陈兴江, 张长青. 多菌灵等5种杀菌剂对烟草立枯病菌的生物活性[J]. 农药学学报, 2017, 19(5): 569-575,doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2017.0076   
WANG Hancheng, ZHANG Min, ZHANG Zhifan, CHEN Xingjiang, ZHANG Changqing. Bioactivities of carbendazim, etc. five fungicides against Rhizoctonia solani in tobacco [J]. Chinese Journal of Pesticide Science, 2017, 19(5): 569-575, doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2017.0076   
多菌灵等5种杀菌剂对烟草立枯病菌的生物活性
汪汉成1, 张敏2, 张之矾3, 陈兴江1, 张长青2     
1. 贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081;
2. 长江大学 农学院，湖北 荆州 434025;
3. 遵义市烟草公司 正安分公司，贵州 遵义 563400
收稿日期: 2017-06-30    录用日期: 2017-08-31.
基金项目: 国家自然科学基金 (31360448，31501679)；贵州省科技厅优秀青年人才培养计划 (黔科合平台人才[2017]5619)；中国烟草总公司贵州省烟草公司科技项目 (201714)；中国博士后科学基金资助项目 (2017M610585)
作者简介: *汪汉成，通信作者 (Author for corespondence)，男，博士，研究员，主要从事植物保护及烟草微生物学研究，E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com
张长青，共同通信作者 (Co-author for correspondence)，男，博士，教授，主要从事植物病害综合防治研究，E-mail：1136296091@qq.com
摘要: 采用生物测定方法分析了烟草立枯病菌Rhizoctonia solani在菌丝生长、菌核形成与萌发阶段对5种杀菌剂 (多菌灵、代森锰锌、菌核净、异菌脲及苯醚甲环唑) 的敏感性，同时通过离体叶片法考察了5种杀菌剂对烟草立枯病的保护和治疗作用。结果表明：供试5种药剂对立枯病菌菌丝生长、菌核形成与萌发均表现出了不同程度的抑制活性，同时对烟草立枯病具有一定的保护和治疗作用。其中，对菌丝生长以及菌核形成与萌发抑制活性最强的均是多菌灵，其抑制菌丝生长的EC50平均值为 (0.06 ± 0.01) mg/L，0.25 和20 mg/L下对菌核形成和萌发的抑制率均为100%；其次为异菌脲 [EC50值为 (0.35 ± 0.15) mg/L，2和100 mg/L下对菌核形成和萌发的抑制率分别为 (54.79 ± 12.58)%和100%]、苯醚甲环唑 [EC50值为 (0.55 ± 0.53) mg/L，5和 200 mg/L下对菌核形成和萌发的抑制率分别为 (97.97 ± 2.64)%和100%] 及菌核净 [EC50值为 (1.31 ± 0.14) mg/L，10和100 mg/L下对菌核形成和萌发的抑制率均为100%]；最弱的均是代森锰锌，其抑制菌丝生长的EC50平均值为 (6 ± 0.20) mg/L，10和200 mg/L下对菌核形成和萌发的抑制率分别为 (43.58 ± 31.87)%和0。离体试验表明：对烟草立枯病保护作用最强的是多菌灵、异菌脲和菌核净，50 mg/L时防效均 > 99%，其次为代森锰锌 (50 mg/L防效为75.83%)，最弱的是苯醚甲环唑 (50 mg/L防效为39.29%)；治疗作用最强的也是多菌灵，50 mg/L防效为93.46%，其次为菌核净、异菌脲和苯醚甲环唑 (200 mg/L时防效均 > 84%)，最弱的为代森锰锌 (800 mg/L时防效为76.40%)。研究结果可为烟草立枯病化学防治药剂筛选提供参考和依据。
关键词: 烟草立枯病     立枯丝核菌     杀菌剂     多菌灵     菌丝生长     菌核     生物活性    
Bioactivities of carbendazim, etc. five fungicides against Rhizoctonia solani in tobacco
WANG Hancheng1, ZHANG Min2, ZHANG Zhifan3, CHEN Xingjiang1, ZHANG Changqing2     
1. Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China;
2. College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei Province, China;
3. Zheng’an County Tobacco Company, Zunyi Tobacco Company, Zunyi 563400, Guizhou Province, China
Abstract: Bioactivities of five different fungicides (carbendazim, mancozeb, dimethachlon, iprodione and difenoconazole) to Rhizoctonia solani were determined using bioassay methods at the stages of mycelial growth, sclerotium production and germination. And in vivo protective and curative effects of these fungicides against tobacco sore shin on detached leaves were also analyzed. The results showed that the five selected fungicides exhibited different inhibitory activities at all assays. The most effective fungicide against the mycelial growth, sclerotium production and germination of R. solani was carbendazim, with the average mycelial growth EC50 value of (0.06 ± 0.01) mg/L, 0.25 and 20 mg/L of carbendazim exhibited 100% inhibition against sclerotium production and germination, respectively. For iprodione, its average EC50 value for mycelial growth was (0.35 ± 0.15) mg/L, 2 and 100 mg/L of iprodione exhibited (54.79 ± 12.58)% and 100% inhibition against sclerotium production and germination, respectively. For difenoconazole, its average EC50 value was (0.55 ± 0.53) mg/L, 5 and 200 mg/L of difenoconazole exhibited (97.97 ± 2.64)% and 100% inhibition, respectively. For dimethachlon, its average EC50 value was (1.31 ± 0.14) mg/L, 10 and 100 mg/L of difenoconazole all exhibited 100% inhibition. The lowest was detected in the case of mancozeb, with average EC50 value of (6 ± 0.20) mg/L, 10 and 100 mg/L of mancozeb exhibited approximately (43.58 ± 31.87)% and 0 inhibition, respectively. The most effective fungicides for protective activity were carbendazim, iprodione and dimethachlon (all showed > 99% efficacy at 50 mg/L), followed by mancozeb (75.83%), and the lowest activity was detected in the case of difenoconazole (39.29%). The most effective fungicide for curative activity was carbendazim (50 mg/L exhibited 93.46% efficacy), followed by dimethachlon, iprodione and difenoconazole (all showed > 84% efficacy at 200 mg/L), and lowest activity was observed in the case of mancozeb (exhibited 76.40% efficacy at 800 mg/L). The results have provided scientific evidence and reference for screening fungicides to control tobacco sore shin.
Key words: tobacco sore shin      Rhizoctonia solani      fungicide      carbendazim      mycelial growth      sclerotium      bioactivity     

烟草立枯病 (tobacco sore shin) 是烟草苗期易发生的一种由立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kühn引起的真菌性病害[1-2]，是烟草集约化育苗中的重要病害之一[3]，具有爆发性和危害性强的特点，严重时发病率高达100%，可导致烟苗成片死亡[4]。近年来，烟草立枯病在中国贵州省遵义、毕节等烟叶主产区发生逐年加重，严重威胁烟苗的繁育，因此亟待探寻适宜的解决办法。化学防治是目前烟草立枯病防治中最为经济有效的方法[5]，但其防治药剂品种较为单一，缺乏高效的可替代药剂。现阶段，21% 鰁霉·稻瘟灵乳油 (hymexazol isoprothiolane EC) 是中国烟草公司推荐用于烟草立枯病防治的主要药剂。虽然多菌灵 (carbendazim)、代森锰锌 (mancozeb)、菌核净 (dimethachlon)、异菌脲 (iprodione) 及苯醚甲环唑 (difenoconazole) 等杀菌剂已被广泛用于多种作物病害的防治[6-7]，但其对烟草立枯病菌作用的相关研究却鲜有报道。为评价这些药剂在烟草立枯病防治方面的可行性，笔者就多菌灵等5种杀菌剂对烟草立枯病菌的室内生物活性及活体抑制作用进行了初步研究，结果报道如下。

1 材料与方法 1.1 培养基及植物试材

真菌培养基AEA[8] ：酵母粉5 g/L，KH2PO4 6 g/L，NaNO3 6 g/L，KCl 0.50 g/L，MgSO4 0.25 g/L，甘油20 mL/L，琼脂粉20 g/L，加去离子水定容至1 L，灭菌待用。

供试烟草品种为云烟87，烤烟主栽品种，易感病。将其种植于装有草碳和蛭石 (质量比为4 : 1) 的烤烟育苗专用苗盘 (160孔/盘) 中，每穴1株，待烟苗长至40 d苗龄时供试。

1.2 供试菌株

在贵州省遵义市烟草育苗大棚内采集病害样本，参照张争等[9]的方法进行病原菌的分离及纯化，根据菌落特征、菌核形态及分子鉴定结果鉴定所得菌株为立枯丝核菌R. solani。各菌株均于4 ℃下、AEA培养基斜面上保存，随机挑选4株 (1-1，2-2，3-2，4-2) 用于室内生物活性测定。

1.3 杀菌剂

85%代森锰锌 (mancozeb) 原药，杜邦 (中国) 集团有限公司；80%多菌灵 (carbendazim) 原药，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；97.30%异菌脲 (iprodione) 原药，泰安圣聚华有限公司；90%菌核净 (dimethachlon) 原药，浙江禾益农化有限公司；96.80%苯醚甲环唑 (difenoconazole) 原药，山东寿光双星农药有限公司。将代森锰锌溶于无菌水、多菌灵溶于0.20 mol/L稀盐酸、异菌脲和菌核净溶于丙酮、苯醚甲环唑溶于乙醇中，均配成1.0 × 104 mg/L的母液，于4 ℃黑暗条件下保存，备用。试验时再将上述药液加至50 ℃左右的AEA培养基中，制成含药平板，其中丙酮或盐酸的体积分数均小于0.25% [预试验表明，此浓度的丙酮与盐酸均不会影响烟草立枯病菌菌丝生长及菌核的形成和萌发 (数据略)]。以在无菌水中加入相同体积分数丙酮或稀盐酸的处理作为空白对照。

1.4 生物活性测定

1.4.1 对菌丝生长的抑制作用　采用菌丝生长速率法[10]测定。菌株预培养5 d后，在菌落边缘打取直径5 mm的菌碟，接种于直径为9 cm、含系列浓度药剂的AEA平板上，每处理重复3次。其中，代森锰锌、菌核净和苯醚甲环唑在培养基中的最终测试质量浓度为0、0.33、0.65、1.25、2.5、5和10 mg/L，异菌脲质量浓度为0、0.13、0.25、0.5、1、2和4 mg/L，多菌灵为0、0.02、0.03、0.06、0.13和0.25 mg/L。接菌后将平板置于28 ℃、黑暗条件下培养，当对照菌落直径接近2/3培养皿直径时，采用“十字交叉法”测量各处理菌落直径，计算各杀菌剂对病原菌菌丝生长的抑制率[11]。

1.4.2 对菌核形成与萌发的抑制作用　采用称重法[8]测定。配制系列浓度的含药AEA平板，其中，代森锰锌的最终测试质量浓度为0、1.25、2.5、5和10 mg/L，多菌灵为0、0.02、0.03、0.06、0.13和0.25 mg/L，异菌脲为0、0.13、0.25、0.5、1和2 mg/L，菌核净为0、0.63、1.25、2.5、5和10 mg/L，苯醚甲环唑为0、0.31、0.63、1.25、2.5和5 mg/L。于含药平板中央接种直径5 mm的菌碟，28 ℃、黑暗条件下培养，25 d后挑取菌核，烘干，称重，每处理重复3次。计算各药剂不同浓度处理对烟草立枯病菌菌核形成的抑制率[8]。

将烟草立枯病菌接种至AEA平板上，28 ℃、黑暗条件下培养25 d，于无菌条件下收集成熟的褐色菌核，待用。配制系列浓度的含药AEA平板，将菌核接种至含药平板上，每处理接种30个菌核，3次重复。其中，代森锰锌和苯醚甲环唑的最终测试质量浓度为0、100、200 mg/L，异菌脲和菌核净为0、50、100 mg/L，多菌灵为0、10和20 mg/L。接种后将平板置于28 ℃、黑暗条件下培养，2 d后观察菌核萌发情况。计算各药剂不同浓度处理对菌核萌发的抑制率[8]。

1.4.3 对烟草立枯病的保护和治疗作用　采用离体叶片法[8]。选择长势一致的团棵期云烟87植株相同部位离体叶片，将叶片从基部剪下，洗净、晾干待用。随机选取敏感性菌株2-2进行接种。

1.4.3.1 保护作用测定　将各原药用0.01%吐温-80水溶液稀释，配制成系列浓度药液，向叶片均匀喷雾至药液开始流失，对照喷施同体积的吐温-80水溶液。24 h后用接种针在叶片同一部位制造相同尺寸伤口，接种直径5 mm的菌碟，每处理6片烟叶，3次重复。代森锰锌的最终处理质量浓度为0、8.13、32.5、125、500和2 000 mg/L，多菌灵、异菌脲、菌核净和苯醚甲环唑均为0、3.13、12.5、50、200和800 mg/L。接菌后用脱脂棉包裹叶片茎基部保湿，置于28 ℃、相对湿度大于90%的培养箱中培养，2 d后测量叶片病斑面积，计算防治效果[8]。

1.4.3.2 治疗作用测定　方法同1.4.3.1节，仅改为接菌24 h后再施药。计算各药剂的防治效果[8]。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件处理，以药剂质量浓度对数值为横坐标、抑制率几率值为纵坐标绘制毒力回归曲线，计算毒力回归方程及有效抑制中浓度 (EC50) 值。采用DPS (7.05) 软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析 2.1 对烟草立枯病菌菌丝生长的抑制作用

结果如表1所示。在测试浓度范围内，供试5种杀菌剂对烟草立枯病菌菌丝生长均表现出了不同程度的抑制作用，其中，抑制活性最强的是多菌灵，其EC50值范围为0.05~0.07 mg/L，平均值为 (0.06 ± 0.01) mg/L；其次为异菌脲、苯醚甲环唑和菌核净，活性最差的为代森锰锌。

烟草立枯病菌不同菌株间对同种药剂的敏感性存在不同程度差异。其中，对苯醚甲环唑的敏感性差异最大，菌株4-2的EC50值是2-2的4.82倍；其次是异菌脲，菌株4-2的EC50值是1-1的2.43倍；相比而言，不同菌株对多菌灵、菌核净和代森锰锌的敏感性差异较小。

表 1 供试5种杀菌剂对烟草立枯病菌菌丝生长的抑制作用 Table 1 Inhibitory effects of five fungicides against mycelium growth of R. solani from tobacco

2.2 对烟草立枯病菌菌核形成与萌发的抑制作用

在测试浓度范围内，5种杀菌剂对烟草立枯病菌菌核的形成均表现出了不同程度的抑制活性 (表2)。在25 d菌核形成期内，抑制活性最强的药剂为多菌灵，其次是苯醚甲环唑和菌核净，代森锰锌和异菌脲的抑制作用相对较弱。

表 2 供试5种杀菌剂对烟草立枯病菌菌核形成的抑制作用 Table 2 Inhibitory effects of five fungicides against sclerotium production of R. solani from tobacco

在测试浓度范围内，5种杀菌剂对烟草立枯病菌菌核萌发的抑制结果见表3。培养2 d后，空白对照菌核萌发所形成菌落的直径在2.05~2.65 cm之间；20 mg/L的多菌灵、100 mg/L的异菌脲和菌核净以及200 mg/L苯醚甲环唑对菌核萌发的抑制率均达100%；200 mg/L代森锰锌的抑制率为0。此外，所有药剂在测试浓度范围内均可抑制烟草立枯病菌菌核萌发后菌丝的生长。

表 3 供试5种杀菌剂对烟草立枯病菌菌核萌发的抑制作用 Table 3 Inhibitory effects of five fungicides against sclerotium germination of R. solani from tobacco

2.3 对烟草立枯病的保护和治疗作用

结果见表4。5种杀菌剂对烟草立枯病均表现出了不同的防治效果，且所有药剂的保护作用均优于治疗作用。其中，保护作用最强的为多菌灵、异菌脲和菌核净 (50 mg/L时的防效均 > 99%)，其次为代森锰锌和苯醚甲环唑；治疗作用最强的是多菌灵 (50 mg/L时防效达93.46%)，其次为菌核净、异菌脲和苯醚甲环唑，最弱的是代森锰锌。

表 4 供试5种杀菌剂防治烟草立枯病的保护和治疗作用 Table 4 Protective and curative effects of five fungicides against sheath blight on tobacco detached leaves

3 结论与讨论

烟草立枯病是近年来设施化育苗过程中严重为害烟苗的重要病害。本研究室内试验表明：无论是对菌丝生长、菌核形成还是菌核萌发阶段而言，抑制作用最强的都是多菌灵，活性最弱的都是代森锰锌 (菌核形成阶段还包括异菌脲)；对菌丝生长抑制作用稍次的为异菌脲、苯醚甲环唑和菌核净，对菌核形成抑制作用稍次的为苯醚甲环唑和菌核净，对菌核萌发抑制作用稍次的为异菌脲、菌核净和苯醚甲环唑。离体叶片试验表明：保护作用最强的为多菌灵、异菌脲和菌核净，其次为代森锰锌和苯醚甲环唑；治疗作用最强的为多菌灵，其次为菌核净、异菌脲和苯醚甲环唑，最弱的为代森锰锌。

在育苗期，集约化育苗大棚通常低温、寡照、湿度大，烟草立枯病易发生及流行，造成危害。陈志敏等[12]采用菌丝生长速率法测定了烟草立枯病菌对苯醚甲环唑、腈菌唑 (myclobutanil)、咪鲜胺锰盐 (prochloraz-manganesechloride complex) 和三唑酮 (triadimefon) 的敏感性，发现苯醚甲环唑对菌丝生长具有很强的抑制作用；此外，也有研究者发现多菌灵、代森锰锌、异菌脲等药剂对其他寄主植物上的立枯丝核菌菌丝生长具有抑制作用[13-15]。本研究进一步证实了多菌灵、苯醚甲环唑及异菌脲等杀菌剂对烟草立枯病菌菌丝生长、菌核形成与萌发等方面的抑制作用，同时丰富了烟草立枯病防治药剂种类，结果可供烟草病害防治参考。

立枯丝核菌主要以菌核和休眠菌丝在土壤、育苗基质及病残组织上存活，越冬后菌丝及菌核萌发形成的菌丝是烟草立枯病的初侵染来源，因此，病土、残体的移动和漂浮育苗池水的流动均会引起该病害的传播。本研究发现，多菌灵对烟草立枯病菌菌核的萌发与形成、菌丝生长都具有很强的抑制作用，同时在离体叶片上也表现出了优异的保护和治疗活性，据此笔者认为该药剂可用于苗期立枯病的防治，但在使用中需注意抗药性的问题；菌核净、异菌脲和苯醚甲环唑也均具有一定的保护和治疗活性，也可在发病前、后期用于立枯病的防治；而代森锰锌对立枯病仅具有一定的预防作用，只适合于发病初期使用，同时其对菌核的形成和萌发活性较差，因此该药剂的使用不利于减少来年初侵染源的数量。

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