农药学学报  2017, Vol. 19 Issue (3): 398-402   PDF    
引用本文
陈森, 魏少鹏, 姬志勤. 牛筋草内生菌砖红链霉菌 CSF09 杀虫成分鉴定及活性初步研究[J]. 农药学学报, 2017, 19(3): 398-402,doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2017.0052   
CHEN Sen, WEI Shaopeng, JI Zhiqin. Identification and investigation on the insecticidal activity of Streptomyces lateritius CSF09, an endophyte strain from Eleusine indica (L.) Gaertn [J]. Chinese Journal of Pesticide Science, 2017, 19(3): 398-402, doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2017.0052   
牛筋草内生菌砖红链霉菌 CSF09 杀虫成分鉴定及活性初步研究
陈森, 魏少鹏, 姬志勤     
西北农林科技大学 植物保护学院，陕西 杨凌 712100
收稿日期: 2016-12-27    录用日期: 2017-03-24.
基金项目: 国家自然科学基金 (31371973)；陕西省科技攻关项目 (2016NY-139)
作者简介: 陈森，男，硕士研究生， E-mail： cs2011chen@163.com;
**姬志勤，通信作者 (Author for correspondence)，男，研究员，研究方向为天然产物农药， E-mail： jizhiqin@nwsuaf.edu.cn
摘要: 为了从微生物中筛选天然杀虫活性化合物，从牛筋草中分离到 1 株具有杀虫活性的内生放线菌砖红链霉菌 Streptomyces lateritius CSF09。采用大孔吸附树脂提取和硅胶柱层析技术，从 CSF09 菌株发酵液中分离到 1 个杀虫活性成分，通过质谱和核磁共振波谱鉴定了其化学结构，并初步测定了该化合物对 3 龄粘虫幼虫和家蝇成虫的杀虫活性。结果表明：该菌株发酵液中的杀虫活性成分为 4-甲氧基水杨醛，发酵单位约为 13 mg/L；4-甲氧基水杨醛对家蝇和粘虫均表现出一定的触杀活性，其中对家蝇的 LD50 值为 1.51 μg/头，对粘虫毒力较弱，以 10 μg/头剂量处理时校正死亡率仅为 36.6%；4-甲氧基水杨醛杀虫活性的突出特性是作用迅速，其击倒中时 (KT50) 大多在 5 min 以内。研究表明，4-甲氧基水杨醛具有一定的卫生杀虫剂开发应用潜力。
关键词: 砖红链霉菌     CSF09     4-甲氧基水杨醛     杀虫活性    
Identification and investigation on the insecticidal activity of Streptomyces lateritius CSF09, an endophyte strain from Eleusine indica (L.) Gaertn
CHEN Sen, WEI Shaopeng, JI Zhiqin     
College of Plant Protection, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China
Abstract: To discover insecticidal ingredients from natural products, Streptomyces lateritius CSF09, an endophyte strain was isolated from Eleusine indica (L.) Gaertn. The bioactive compound was isolated from the fermentation broth by techniques of macroporous resin extraction and silica gel column chromatography, and its chemical structure was identified by MS and NMR. The obtained compound was subjected to evaluate its insecticidal activity against the 3rd larvae of Mythimna separate and adults of Musca domestica. The results indicated that the insecticidal ingredient produced by the strain was 4-methoxysalicylaldehyde with the yield of approximately 13 mg/L. 4-Methoxysalicylaldehyde showed contact toxicity against both M. separate and M. domestica. The LD50 value of M. domestica was 1.51 μg/fly. 4-Methoxysalicylaldehyde showed weak toxicity against M. separate, and the mortality rate was only 36.6% after the treatment of 10 μg/larvae. The outstanding characteristic of the insecticidal activity of 4-methoxysalicylaldehyde was quick-acting with the KT50 in most treatments less than 5 min. This investigation suggested that 4-methoxysalicylaldehyde has the potential to be developed as a health insecticide.
Key words: Streptomyces lateritius      CSF09      4-methoxysalicylaldehyde      insecticidal activity     

在新农药研究开发领域，天然产物一直扮演着重要的角色[1-2]。微生物是筛选新农药活性成分的重要资源，而且已有较多成功的产业化实例，如阿维菌素、多杀菌素及浏阳霉素等[3-5]。从植物内生菌中发现杀虫活性成分在近些年也引起了较大的关注。范永玲等[6]从辣椒根部分离得到 1 株植物内生放线菌娄彻氏链霉菌 Streptomyces rochei Lj20，发现其发酵液对小菜蛾幼虫有较强的拒食作用，对朱砂叶螨有较强的触杀及产卵忌避作用。史赟等[7]从番茄植株根茎的接合部位分离得到了 1 株植物内生放线菌酒红链霉菌 Streptomyces vinaceus St24，其发酵液对小菜蛾幼虫也具有较强的拒食作用，选择性拒食率和非选择性拒食率分别为 100% 和 97.86%，并对朱砂叶螨具有一定的触杀和产卵忌避作用。

在从微生物资源中寻找天然杀虫活性成分的过程中，本课题组从农田杂草牛筋草 Eleusine indica (L.) Gaertn 根部分离得到了 1 株内生放线菌 (编号为 CSF09)，其发酵液经乙酸乙酯萃取后，有机相对粘虫表现出了明显的触杀活性。为进一步明确该杀虫活性成分，本研究采用大孔吸附树脂提取和硅胶柱层析技术，从 CSF09 菌株发酵液中分离获得了 1 个杀虫活性成分 f04，通过质谱和核磁共振波谱技术确定了其化学结构，并对其杀虫活性进行了初步评价。

1 材料与方法 1.1 供试材料

1.1.1 菌株 内生放线菌 CSF09 于 2016 年 5 月从西北农林科技大学校园中 1 株牛筋草根部分离获得，初步鉴定[8]为砖红链霉菌 Streptomyces lateritius (编号 CSF09)。菌种现保存于西北农林科技大学农药研究所。

1.1.2 培养基 高氏一号培养基 [可溶性淀粉 20 g，NaCl 0.5 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，琼脂粉 13~15 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.4~7.6]，用于 CSF09 菌株培养；小米液体培养基 [小米 10.0 g，葡萄糖 10.0 g，蛋白胨 3.0 g，NaCl 2.5 g，CaCO3 1.0 g，(NH4)2SO4 1.0 g，蒸馏水 1 000 mL]，用于 CSF09 菌株摇瓶发酵。所有培养基均于 121 ℃ 下高温灭菌 30 min 后备用。

1.1.3 试虫 粘虫 Mythimna separate 和家蝇 Musca domestica 分别由西北农林科技大学农药研究所和无公害农药研究服务中心提供，按照文献方法[9-10]饲养。挑选个体大小一致、生长健康的 3 龄粘虫幼虫和羽化 3~6 d、整齐健康的家蝇成虫供试。

1.1.4 主要仪器及试剂 Shimadzu LC-6AD 高效液相色谱仪，具二极管阵列检测器，日本岛津公司；Thermo LCQ Advantage MAX 质谱仪，美国 Thermo 公司；Bruker RPX 500 MHz 核磁共振仪，德国 Bruker 公司。HPD-100 大孔吸附树脂，河北宝恩树脂科技有限公司；柱层析硅胶 (粒径 54~74 μm)，青岛海洋化工厂；4-甲氧基水杨醛 (分析纯)，东京化成公司；对照药剂 95% 鱼藤酮 (rotenone) 原药，麦克林试剂公司；甲醇为色谱纯，美国 Tedia 公司；石油醚和乙酸乙酯均为市售分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液制备 将 CSF09 菌株接种于高氏一号培养基上，于 25 ℃ 下培养 7 d，再接种于 100 mL 小米液体培养基中，于 180 r/min、28 ℃ 下振荡培养 16 h。

1.2.2 发酵液制备 将 20 mL 种子液接种于 80 mL 小米液体培养基中，于 180 r/min、28 ℃ 下振荡培养 7 d。

1.2.3 活性成分的分离及鉴定 取 20 L 菌株发酵液，用多层纱布过滤，滤液通过装有 HPD-100 大孔吸附树脂 (1.0 kg) 的玻璃层析柱吸附提取，再用去离子水洗脱柱床至流出液无色，最后用 2 × 柱床量的甲醇解析。将甲醇解析液减压浓缩至近干，用少量硅胶拌匀，晾干后进行硅胶柱层析，依次用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂 (体积比分别为 8 : 1、6 : 1、4 : 1、2 : 1、1 : 1) 进行洗脱。每 100 mL 收集 1 份，经薄层层析 (TLC) 检测后合并相同组分，共得到 6 个组分。采用质谱与核磁共振波谱技术对所得活性化合物进行结构鉴定。

1.2.4 菌株鉴定 参照文献方法提取 CSF09 菌株基因组 DNA，并以此为模板进行 PCR 扩增、纯化、测序，利用 16S rDNA 序列比对分析对其进行分类鉴定[8]。

1.2.5 触杀活性测定 采用点滴法[11]分别测定柱层析馏分及纯化合物对试虫的触杀活性。硅胶柱层析馏分经减压蒸去溶剂，再配制成 1% 丙酮溶液，取 1 μL 该溶液点样于 3 龄粘虫幼虫的前胸背板，每处理 15 头试虫，24 h 后调查死亡率。精密毒力测定时，将分离得到的纯化合物分别配制成 15.0、10.0、7.5、5.0、2.5、1.25 和 0.63 mg/mL 的丙酮溶液，取 1 μL 药液点样于 3 龄粘虫幼虫和家蝇成虫的前胸背板。以鱼藤酮为阳性对照药剂，另设丙酮空白对照。每处理 30 头试虫，重复 3 次。将处理后的粘虫转移至培养皿中，加入新鲜的小麦叶片，放入养虫室 (25 ℃，相对湿度 80%~90%) 中饲养；将处理后的家蝇试虫转移至养虫室 (25 ℃，相对湿度 70%~80%，L/D：12 h/12 h) 内，期间持续观察试虫的中毒症状，记录击倒中时 (KT50)，24 h 后检查结果，调查死亡率，计算校正死亡率和致死中量 (LD50)。

2 结果与分析 2.1 CSF09 菌株的分类鉴定

序列分析结果 (图 1) 表明，菌株 CSF09 的 16S rDNA 序列长度为 1 482 bp。将该序列上传至 NCBI GenBank，获得登记号 KY046221，选取 GenBank 中与之相似度较高的 13 株菌株序列，利用 ClustalX2.0 软件进行序列完全比对，并采用 MEGA 6.0 构建系统发育树。结果显示，菌株 CSF09 与链霉属中砖红链霉菌 Streptomyces lateritius A25 的相似度较高，亲缘关系最近。形态学观察发现：在高氏一号培养基上，CSF09 菌落初始呈白色粉状，比较平坦；光学显微镜下观察到其气丝为白色，基丝无色，菌丝无隔，孢子丝紧密或松敞呈螺旋形。其形态与砖红链霉菌 S. lateritius 相似，而且遗传距离较近，因此初步鉴定其为砖红链霉菌 S. lateritius。

图 1 基于 16S rRNA 序列构建的 CSF09 菌株系统发育树 Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain CSF09

2.2 活性成分分离

以生物活性追踪为指引，对 S. lateritius CSF09 菌株发酵液中的活性成分进行硅胶柱层析分离，共得到 6 个馏分，其中 Fr.04 馏分为无色晶体 (260 mg)。采用点滴法测定了各馏分对粘虫的杀虫活性：Fr.04 馏分的杀虫活性最好，试虫死亡率达 100%；Fr.03 和 Fr.05 也表现出了较弱的杀虫活性，试虫死亡率分别为 25.2% 和 15.4%。Fr.04 馏分在薄层板上显示为单一斑点，可能为纯化合物 (编号为 f04)，而 Fr.03 和 Fr.05 并非单一组分，其中也含有化合物 f04，因此推测 f04 是菌株发酵液中惟一的杀虫活性成分。

2.3 活性成分结构鉴定

采用质谱和核磁共振波谱技术对化合物 f04 的结构进行了分析，发现 f04 与文献中 4-甲氧基水杨醛的波谱数据[11]基本吻合，因此推测其可能为 4-甲氧基水杨醛。其理化性质及核磁数据为：无色晶体，熔点 41~42 ℃ (文献值 41~42 ℃)[12]。MS (ESI 正离子模式)，m/z 153.2 [M+H]+。分子式为 C8H8O3；相对分子质量 152.15。1H NMR (CDCl3，500 MHz)，δ：11.48(s, 1H)，9.71 (s, 1H)，7.43 (d, J = 8.5 Hz, 1H)，6.55 (dd, J = 2.5, 8.5 Hz, 1H)，6.43 (d, J = 2.5 Hz, 1H)，3.85(s, 3H)；13C NMR (CDCl3，125 MHz), δ：194.38，166.86，164.57，135.25，115.21，108.41，100.68，55.71。

为进一步验证该结果，在相同色谱条件下，比较了化合物 f04 与 4-甲氧基水杨醛对照品在硅胶薄层板上的比移值及二者在液相色谱柱上的保留时间，发现二者的色谱保留行为完全一致，由此可以确定 f04 为 4-甲氧基水杨醛(图式 1)。

图式 1 4-甲氧基水杨醛 Scheme1 4-methoxysalicylaldehyde

2.4 4-甲氧基水杨醛的杀虫活性

4-甲氧基水杨醛对粘虫的触杀活性毒力并不高 (表 1)，以 10 μg/头剂量处理时，试虫死亡率仅 36.6%。不过值得注意的是，以 ≥ 5 μg/头剂量的 4-甲氧基水杨醛处理粘虫，其击倒中时 (KT50) 均不超过 5 min，作用速度明显快于鱼藤酮。但低浓度处理下试虫仅表现为短时麻醉，随后均能恢复正常，只有剂量达到 15 μg/头时才能使粘虫致死。

表 1 4-甲氧基水杨醛对粘虫的触杀毒力 Table 1 Insecticidal activity of 4-methoxysalicylaldehyde against M. separate

4-甲氧基水杨醛对家蝇成虫的触杀活性致死中量 (LD50) 为 1.51 μg/头，其毒力是鱼藤酮的 2 倍以上 (表 2)。此外，4-甲氧基水杨醛对家蝇的作用也非常迅速，其 KT50 ≤ 5 min，且在供试剂量下未观察到明显的复苏现象。

表 2 4-甲氧基水杨醛对家蝇的触杀毒力 Table 2 Contact toxicity of 4-methoxysalicylaldehyde against M. domestica

3 小结与讨论

4-甲氧基水杨醛是萝藦科植物杠柳的特征性组分，也是 2015 年版《中国药典》中香加皮的控制指标[13]，文献报道其在杠柳精油中的含量可达 80%[14]。迄今为止，文献中有关 4-甲氧基水杨醛的天然分布均存在于植物中，尚未见从微生物及其代谢物中分离到该化合物的报道，本研究首次报道了 1 株可产生 4-甲氧基水杨醛的砖红链霉菌 S. lateritius CSF09。后续如果通过菌株改良和条件优化能够大幅度提高其发酵单位，则有望为 4-甲氧基水杨醛的生产提供一种新的天然来源。

在农用领域，据报道 4-甲氧基水杨醛对尖孢镰刀菌及链格孢等多种植物病原菌具有抑菌活性[15]，对麦二叉蚜和果蝇具有杀虫活性[14, 16]。本研究测定了 4-甲氧基水杨醛对粘虫幼虫和家蝇成虫的触杀活性，发现其对粘虫的毒力并不强，用于大田防治农业害虫的价值不大，但对家蝇的毒力优于鱼藤酮，且具有作用迅速、击倒力强的优点，因此将其加工成不需要二次稀释的卫生杀虫剂使用具有一定的潜力。

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