2017, Vol. 19
2. 浙江高鼻子生物科技有限公司，浙江 乐清 325616;
3. 浙江铁枫堂生物科技股份有限公司，浙江 乐清 325616
2. Zhejiang Gaobizi Biological Technology Co., Ltd, Yueqing 325616, Zhejiang Province, China;
3. Zhejiang Tiefengtang Biological Technology Co., Ltd, Yueqing 325616, Zhejiang Province, China
铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo 为兰科石斛属多年附生草本植物，是滋阴补益珍品，被列为“中华九大仙草”之首[1]。中国浙江省是全国首先开发铁皮石斛农产品和保健品并实现产业化生产的省份，并已成为该省重要的特色产业[2]。铁皮石斛鲜条及其加工产品的需求量逐年递增[3]，围绕铁皮石斛品质提升、安全生产、绿色增效的全产业链发展目标，保证其种植环节的质量安全、推进铁皮石斛源头安全生产监管就显得尤为重要[4]。
以大棚栽培为主的铁皮石斛在高温高湿的环境下易受软腐病、炭疽病、白绢病及蜗牛等为害，为了保证药材产量，常使用苯醚甲环唑、多菌灵、烯酰吗啉等农药进行防治[5]。
当前，关于铁皮石斛的研究主要集中在品种选育、天然成分提取、分子标记鉴定及基础药理学领域[6-11]，有关其产业源头的安全性的研究尚少。尽管已有采用气相色谱-串联质谱 (GC-MS/MS 和高效液相色谱-串联质谱 (HPLC/MS/MS) 方法对铁皮石斛深加工产品进行农药残留检测的相关报道[12-13]，但农药在铁皮石斛栽培过程中的残留消解动态及清洗去除方法尚未见报道。综合产区前期调研结果及用药习惯[5]，笔者研究了苯醚甲环唑、多菌灵及烯酰吗啉在铁皮石斛鲜条及栽培基质 (主要成分为松鳞、碎木块、板边及小石子) 中的残留消解动态；并研究了不同浓度盐水、碱水浸泡以及清水冲洗不同时间后对 3 种农药残留的去除效果，通过响应面方法确定了其最佳清洗方式，以期为建立铁皮石斛质量安全评价体系提供参考。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂LCMS8050 高效液相色谱-串联质谱仪 (日本岛津公司)；KQ5200E 超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)；200 g 手提式 DFT-200 高速万能粉碎机 (温岭市林大机械有限公司)；IKA-T8 高速匀浆机 (天津市泰斯特仪器有限公司)；BSA2202S 电子天平 (德国赛多利斯公司)；ST16R 离心机 (赛默飞世尔公司)，基本型漩涡混合器 (美国 TALBOYS) 等。
苯醚甲环唑 (difenoconazole)(纯度 98.7%)、多菌灵 (carbendazim)(纯度 99.5%) 和烯酰吗啉 (dimethomorph)(纯度 98.0%) 标准品，均为 Dr. Ehrenstorfer 公司产品。
40% 苯醚甲环唑悬浮剂 (difenoconazole SC)，青岛海纳生物科技有限公司；25% 多菌灵可湿性粉剂 (carbendazim WP)，四川国光农化股份有限公司；80% 烯酰吗啉水分散粒剂 (dimethomorph WD)，海南博士威农用化学有限公司。
乙腈、甲醇 (HPLC 级，美国 Tedia 公司)；氯化钠、无水硫酸镁 (AR 级，上海凌峰化学试剂有限公司)；水 (一级水)；PSA、C18 (北京安捷飞科技有限公司)；微孔有机滤膜 (0.22 μm)。
1.2 田间试验试验于 2016 年 8–10 月在国家铁皮石斛生物产业基地 (乐清) 连栋大棚内进行。供试铁皮石斛种苗为浙江乐清雁荡红杆品系二年生驯化苗。以 40% 苯醚甲环唑悬浮剂、25% 多菌灵可湿性粉剂和 80% 烯酰吗啉水分散粒剂为供试药剂，施药剂量 (有效成分)：苯醚甲环唑 1.5 kg/hm2 (推荐剂量) 和 3.0 kg/hm2 (两倍推荐剂量)；多菌灵 1.0 kg/hm2 (推荐剂量) 和 2.0 kg/hm2 (两倍推荐剂量)；烯酰吗啉 0.3 kg/hm2 (推荐剂量) 和 0.6 kg/hm2 (两倍推荐剂量)。农药兑水后分别用背负式手动喷雾器分区均匀喷洒到茎叶连带基质，每小区 25 m2，每个处理 3 次重复。喷洒农药于晴天傍晚时分进行。分别于施药后当日 (施药后 6 h) 及 3、7、14、21、30 d 后取样，分析 3 种农药在铁皮石斛鲜条及栽培基质中的残留消解动态，铁皮石斛鲜条样品为植株整株带茎、根、叶挖取；栽培基质样品取 10 cm 基质层以内。
1.3 样品制备将待测铁皮石斛鲜条和栽培基质分别剪成小条后切碎，用粉碎机粉碎。称取 5.0 g 粉碎后的样品于 50 mL 离心管中，加入 15.0 mL 乙腈，涡旋 1.0 min，再加入 1.5 g 氯化钠和 6.0 g 无水硫酸镁，涡旋 30.0 s，超声提取 20.0 min。抽滤，取上清液 1.0 mL，加入 0.05 g PSA、0.05 g C18 和 0.15 g 无水硫酸镁，涡旋 30.0 s，于 8 000 r/min 下离心 3.0 min，取上清液，过 0.22 μm 有机膜，待色谱分析。若所测数据超出样品的线性范围，则用乙腈稀释后再重新测定。
1.4 分析检测条件色谱条件：Kinetex XB-C18 色谱柱 (2.1 mm × 100 mm，2.6 μm)。流动相为 V (0.1% 甲酸乙腈) : V (1% 甲酸水溶液) = 80 : 20；流速 0.25 mL/min，柱温 30 ℃，进样量 2.0 μL。苯醚甲环唑、多菌灵和烯酰吗啉的保留时间分别为 1.511、0.826 和 1.130 min。
质谱条件：毛细管电压 4.0 kV，雾化气流量 3.0 L/min，加热气流量 10.0 L/min，加热块温度 400 ℃，脱溶剂管温度 250 ℃，离子源接口温度 300 ℃，检测器电压 1.82 kV。多反应监测模式 (MRM)，ESI+ 电离。其余相关参数见表 1。
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表 1 质谱参数 Table 1 Parameter information of mass spectrometry |
1.5 标准曲线绘制及添加回收试验
准确称取苯醚甲环唑、多菌灵和烯酰吗啉标准品于 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容并配制质量浓度为 100 mg/L 的标准储备液，再用甲醇逐级稀释成 0.005，0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 和 1.0 mg/L 的系列标准工作溶液，采用高效液相色谱法测定，外标法定量。以 3 种农药标准工作溶液进样质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。
用甲醇将供试 3 种农药标准品分别配制成 100 mg/L 的标准储备液。在 100 mL 容量瓶中，分别加入上述农药标准储备液 10 mL，用甲醇定容，配制成 10 mg/L 的混合标准溶液。在空白铁皮石斛鲜条样品及栽培基质中添加农药混合标准溶液，添加水平分别为 10、100、500 μg/kg，每个水平重复 6 次，测定平均回收率及相对标准偏差。
1.6 样品清洗方法1.6.1 单因素试验 试验设 3 个单因素：不同浓度盐水浸泡、不同浓度碱水浸泡及清水冲洗不同时间。采用 10 L 塑料桶，将铁皮石斛鲜条样品分别于不同浓度的盐水 (氯化钠质量分数分别为 2%、4%、6%、8%、10%) 或碱水 (碳酸氢钠质量分数分别为 0.6%、1.0%、1.6%、2.0%、2.4%) 中浸泡 5 min 后取出，测定残留农药的去除率；将铁皮石斛鲜条样品分别用清水冲洗 20、40、60、80、100 min 后测定农药的去除率。各单因素均为分别试验，3 次重复。
1.6.2 响应面试验 综合单因素试验结果，根据 Box-Behnken 试验设计，确定 3 因素 3 水平的响应面因素水平。根据响应面结果得到的农药残留最优清洗条件进行样品处理，农药残留清洗步骤为先用一定浓度的盐水和碱水混合液浸泡 5 min，然后用清水冲洗，测定农药的残留量 (3 次重复)，并与模型预测值进行比较，以验证响应面模型的有效性。数据图表处理采用 Excel 2007 及 OriginPro 9.1 软件，响应面试验数据分析采用 Design-Expert 8.0.6 软件[14]。
2 结果与分析 2.1 分析方法的灵敏度、准确度及精密度由标准工作曲线测定结果看出：在 5~1 000 μg/L 范围，供试农药的质量浓度与其对应的峰面积呈良好线性关系。苯醚甲环唑标准曲线方程为 y = 75 838x + 21 831，R2 = 0.999 9；多菌灵标准曲线方程为 y = 75 651x + 74 585，R2 = 0.999 9；烯酰吗啉标准曲线方程为 y = 48 507x + 23 045，R2 = 0.999 9。添加回收试验结果 (表 2) 表明，在 10~500 μg/kg 添加水平下，3 种农药在铁皮石斛中的平均回收率为 78.5%~106%，RSD 均低于 4.5%，结果符合相关标准要求[15]。
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表 2 供试 3 种农药在铁皮石斛鲜条及栽培基质中的添加回收率 Table 2 Recoveries of 3 commonly used pesticides residue in Dendrobium officinale and growth media |
2.2 消解动态
2.2.1 农药在铁皮石斛鲜条中的消解动态 采用推荐剂量和两倍推荐剂量施用后苯醚甲环唑、多菌灵及烯酰吗啉在铁皮石斛鲜条中的消解动态均呈一级动力学特征，消解动态方程的相关系数 (r) 在 0.915 3~0.977 3 (图 1，表 3)。其中苯醚甲环唑在鲜条中的半衰期分别为 3.9 d (推荐剂量) 和 3.8 d (两倍推荐剂量)，多菌灵的半衰期均为 2.6 d (推荐剂量和两倍推荐剂量)，烯酰吗啉的半衰期分别为 2.8 d (推荐剂量) 和 2.9 d (两倍推荐剂量)。结果显示，施药剂量对 3 种农药在铁皮石斛鲜条中的消解速率影响不大 (图 1)。与苯醚甲环唑、多菌灵及烯酰吗啉在芹菜中的半衰期 (分别为 7.3~19.7d[16]、12.8~13.9 d[17]及 4.0~5.9 d[18]) 相比，3 种农药在铁皮石斛鲜条中的消解速率更快。这可能与施药量和施药次数相关，也可能与铁皮石斛栽培管理方法有关。铁皮石斛栽培于夏季干旱少雨时，每天清晨和傍晚均需不少于 40 min 的浇灌，灌溉水的冲刷加快了农药残留的消解速率。
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表 3 供试 3 种农药在铁皮石斛鲜条及其栽培基质中的消解动态 Table 3 Decline dynamics of 3 pesticides in D. officinale fresh plant and growth media |
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A. 苯醚甲环唑；B. 多菌灵；C. 烯酰吗啉。 A. difenoconazole; B. carbendazim; C. dimethomorph. 图 1 铁皮石斛鲜条中 3 种农药的消解动态曲线 Fig. 1 Decline curve of 3 commonly used pesticides in Dendrobium officinale fresh plant |
2.2.2 农药在铁皮石斛基质中的消解动态 由表 3 和图 2 可知：在铁皮石斛基质中，苯醚甲环唑的半衰期分别为 4.1 d (推荐剂量) 和 5.6 d (两倍推荐剂量)，多菌灵的半衰期分别为 3.1 d (推荐剂量) 和 2.8 d (两倍推荐剂量)，烯酰吗啉的半衰期分别为 3.6 d (推荐剂量) 和 5.1 d (两倍推荐剂量)。本研究结果表明，3 种农药在铁皮石斛鲜条中的消解速率均快于基质中，这可能是由于农药经铁皮石斛吸收运输传导至根系，又被基质吸收有关。高浓度下多菌灵在铁皮石斛基质中的消解速率快于低浓度处理，这可能与栽培基质中含有的微生物自身的农药降解特性有关。该结果与邵清松等[19]报道的多菌灵在金线莲基质中的消解动态，以及林建等[20]报道的多菌灵在白术土壤中的消解动态研究结果类似。
2.2.3 农药安全使用标准建议 当前中国并未规定农药在铁皮石斛中的最大残留限量 (MRL) 标准，本研究结合食品安全国家标准《食品中农药最大残留限量》GB 2763—2016 中规定的 3 种农药在相关食品 (作物) 的最大残留限量值，其中苯醚甲环唑参照芦笋的 0.03 mg/kg，多菌灵参照食荚豌豆的 0.02 mg/kg，烯酰吗啉参照菠萝的 0.01 mg/kg，建议铁皮石斛鲜条中两倍推荐剂量施用苯醚甲环唑、多菌灵及烯酰吗啉时，最后一次施药和收获时间的安全间隔期可分别设为 40、34 和 38 d，此时鲜条中 3 种农药的残留量分别为 0.026~0.030 mg/kg、0.018~0.019 mg/kg、0.009~0.010 mg/kg (表 4)。
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表 4 供试 3 种农药在铁皮石斛上安全使用建议 Table 4 Safety utilization recommendations for 3 pesticides in D. officinale |
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A. 苯醚甲环唑；B. 多菌灵；C. 烯酰吗啉。 A. difenoconazole; B. carbendazim; C. dimethomorph. 图 2 铁皮石斛栽培基质中 3 种农药的消解动态曲线 Fig. 2 Decline curve of 3 commonly used pesticides in D. officinale growth media |
2.3 农药残留清除方法比较
2.3.1 单因素试验下铁皮石斛鲜条中农药残留量变化及试验水平选择 由图 3 可知：单因素试验条件下，3 种供试农药在 2%~8% 盐水中浸泡 5 min，用清水冲洗 20~60 min 时去除效果均较好；在 0.6%~1.6% 的碱水中浸泡 5 min 对苯醚甲环唑和多菌灵去除效果较好；而在 0.6%~1.0% 的碱水中浸泡 5 min 对烯酰吗啉的去除效果较好。本研究结果还表明，清水冲洗时间过长或浸泡溶液浓度过高，农药去除率会有所下降，这可能是由于太长时间的浸泡会破坏铁皮石斛表皮细胞，使浸泡液中的农药再次进入铁皮石斛鲜条内部而难以去除。综合以上结果，以在质量分数为 2%~8% 的盐水和质量分数为 0.6%~1.6% 的碱水中浸泡 5 min，以及用清水冲洗 20~60 min 作为后续苯醚甲环唑和多菌灵去除的试验水平，以在 0.6%~1.0% 的碱水中浸泡 5 min 作为后续烯酰吗啉去除的试验水平 (表 5)。
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A：清水冲洗时间；B：氯化钠质量分数；C：碳酸氢钠质量分数。 A: Washing time; B: NaCl concentration; C: NaHCO3 concentration. 图 3 单因素试验下铁皮石斛中农药残留的去除率 Fig. 3 Removal rate of pesticide residues in D. officinale under single factor |
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表 5 响应面试验因素水平 Table 5 Factors and their levels of response surface design |
2.3.2 响应面试验结果 通过 Design Expert 软件对响应面试验结果 (表 6) 进行拟合，得到农药去除率 (Y) 对水洗时间 (A, min)、氯化钠质量分数 (B, %) 和碳酸氢钠质量分数 (C, %) 的二次多项回归方程。
苯醚甲环唑去除率模型：Y1 = –41.21 + 2.41A + 9.99B + 61.58C + 0.01AB + 0.19AC + 1.18BC – 0.03A2 – 1.08B2 – 30.08C2 (R2 = 0.989 9; RAdj2 = 0.976 9)。
多菌灵去除率模型：Y2 = –20.80 + 2.33A + 6.80B + 58.73C + 0.01AB + 0.07AC + 0.67BC – 0.03A2 – 0.74B2 – 26.78C2 (R2 = 0.989 7; RAdj2 = 0.976 4)。
烯酰吗啉去除率模型：Y3 = 184.06 – 1.91A – 8.75B – 162.69C + 0.01AB + 0.54AC – 0.63BC + 0.02A2 + 0.67B2 + 85.94C2 (R2 = 0.943 9; RAdj2 = 0.871 9)。
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表 6 响应面试验设计及结果 Table 6 Response surface designs and the corresponding experimental data |
2.3.3 响应面回归模型分析 将按响应面设计水平所得试验结果 (表 6) 导入 Design Expert 中，可得表 7。由表 7 数据可知，苯醚甲环唑和多菌灵的残留去除率模型的回归极显著 (P < 0.000 1)，说明该模型可用于用一定质量分数的氯化钠及碳酸氢钠溶液浸泡后，再用清水冲洗不同时间对苯醚甲环唑和多菌灵去除率的预测。F 值分析结果表明，3 个因素对苯醚甲环唑和多菌灵的去除率均有显著影响，在所选择的试验范围内，依据一次项回归系数绝对值的大小，可知因素的主效应关系均为 C > B > A。各因素对苯醚甲环唑和多菌灵去除率响应面图及等高线图如图 4 和图 5 所示。通过求解回归方程，得到去除铁皮石斛鲜条中苯醚甲环唑残留的最佳条件为：经质量分数 5.49% 的氯化钠和 1.27% 的碳酸氢钠混合溶液浸泡 5 min 后再用清水冲洗 45 min，在此条件下，苯醚甲环唑去除率的预测值为 79.55%，实测值为 78.81%，相对误差 0.94%；去除铁皮石斛鲜条中多菌灵残留的最佳条件为：用质量分数 5.34% 的氯化钠和 1.22% 碳酸氢钠混合溶液浸泡 5 min 后再用清水冲洗 45 min，在此条件下，多菌灵去除率预测值为 85.35%，实测值为 84.22%，相对误差 1.34%。表明利用苯醚甲环唑和多菌灵响应面模型在实践中预测是可行的。
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左：响应面图；右：等高线图。 Left: response surface plots; Right: contour plots. 图 4 各因素交互作用对苯醚甲环唑去除率的影响 Fig. 4 The effect of three process parameters on the removal rate of the difenoconazole residue in D. officinale |
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左：响应面图；右：等高线图。 Left: response surface plots; Right: contour plots. 图 5 各因素交互作用对多菌灵去除率的影响 Fig. 5 The effect of three process parameters on the removal rate of the carbendazim residue in D. officinale |
烯酰吗啉残留去除率模型的回归极显著 (P < 0.001)，F 值分析结果表明，氯化钠的质量分数 B 对烯酰吗啉的去除率有极显著影响，A、C 以及交互项对其无影响 (P > 0.05)。在所选择的试验范围内，依据一次项回归系数绝对值的大小，可知因素的主效应关系均为 C > B > A。各因素对烯酰吗啉去除率响应面图及等高线图如图 6 所示。通过求解回归方程，得到去除铁皮石斛鲜条中烯酰吗啉残留的最佳条件为：经质量分数为 2.07% 的氯化钠和 0.80% 的碳酸氢钠混合溶液浸泡 5 min 后再用清水冲洗 59 min，在此条件下，烯酰吗啉去除率的预测值为 73.21%，实测值为 70.64%，相对误差 3.64%。表明利用烯酰吗啉响应面模型在实践中预测是可行的。
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左：响应面图；右：等高线图。 Left: response surface plots; Right: contour plots. 图 6 各因素交互作用对烯酰吗啉去除率的影响 Fig. 6 The effect of three process parameters on the removal rate of the dimethomorph residue in D. officinale |
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表 7 响应面回归模型方差分析结果 Table 7 Analysis of variance for the proposed response surface regression models |
3 结论
本研究结果表明，在铁皮石斛鲜条中，苯醚甲环唑、多菌灵及烯酰吗啉在各自推荐剂量和两倍推荐剂量用药下的消解速率接近。比较不同农药的消解速率，发现多菌灵消解最快，苯醚甲环唑最慢，且 3 种农药在鲜条中的消解速率均快于在栽培基质中。
研究同时表明，用适当浓度的盐水和碱水浸泡后再用清水冲洗一定时间，有助于铁皮石斛中农药残留的去除。基于响应面试验结果，通过回归分析进行条件优化，分别得到铁皮石斛鲜条中 3 种农药残留的最佳去除条件，且响应面最佳模型的预测值与试验值基本相符，表明模型具有一定的准确性和实用性。本结论可用于指导农户在采收时和消费者在购买后对 3 种农药的清洗，提高食用安全性。
当前，中国尚未制定铁皮石斛产品中的相关 MRL 标准，本文研究了苯醚甲环唑、多菌灵及烯酰吗啉在铁皮石斛鲜条和基质中的残留及消解动态，且建立了以氯化钠、碳酸氢钠质量分数和清水冲洗时间为因素的最佳去除方法模型，为建立常用农药在铁皮石斛上的使用安全性评价体系提供了基础的科学依据。
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