2017, Vol. 19
黄酒也称米酒 (rice wine)，是以稻米为主要原料酿制而成的。中国浙江省作为黄酒的重要产地，2008 年该省内黄酒制造企业总资产超过 85 亿元，黄酒年产量超过 100 万 t，并呈迅速增长的势头[1]，与此同时，黄酒品质和质量面临严峻挑战。2012 年中国网食品安全调研组委托国家水产品及加工食品质量监督检验中心对浙江地区销售的 10 批次袋装黄酒进行检验，合格率仅为 10%[2]；此外，黄酒中的农药残留问题也引起关注[3-4]。残留农药不仅导致黄酒产品安全性存在风险，而且还可能对黄酒酿造过程产生影响。目前，已有大量文献报道了农药残留对葡萄酒发酵过程的影响，如 Braconi 等研究发现，除草剂可以抑制葡萄酒酵母发酵过程中的过氧化氢酶和过氧化物歧化酶，并最终导致酵母细胞壁氧化性损伤[5]。同时，残留农药还会影响乙醇发酵过程中的葡萄酒酵母和苹果酸-乳酸发酵过程中的乳酸菌，导致微生物生长受抑制，发酵过程减慢，甚至有可能导致发酵产物发生质和量的变化[6]。
在农业生产过程中使用的农药约有 25% 为手性农药，其不同对映异构体在生物活性、代谢过程及环境行为等方面均存在差异[7]。在笔者之前的研究中发现，低浓度下，(–)-己唑醇对葡萄酒酵母的抑制程度高于(+)-己唑醇，可见在葡萄酒酿造过程中，手性农药对映异构体对葡萄酒酵母确实存在一定程度的差异性，但目前尚未见手性农药对映异构体对黄酒酿造过程影响的报道[8]。为此，笔者以在水稻上常用的杀菌剂且结构相近的手性农药腈菌唑和己唑醇 (结构式见图 式 1) 为研究对象，研究其对映异构体对黄酒酵母以及米曲霉的多种酶活性和蛋白总量的影响，旨在为全面评价黄酒安全性提供一定的理论依据和数据支持。
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图式 1 己唑醇 (左) 和腈菌唑 (右) 的结构式 (*为手性中心) Scheme1 The structure of hexaconazole and myclobutanil (*chiral center) |
1 材料与方法 1.1 供试药剂及菌种
外消旋体 (±)-腈菌唑 (myclobutanil) 和 (±)-己唑醇 (hexaconazole) 标准品，含量均 > 98.5%，购于天津市环境监测中心；对映异构体 (+)-腈菌唑、(–)-腈菌唑、(+)-己唑醇及 (–)-己唑醇 (标准品，含量 > 98%)，购于大赛璐药物手性技术 (上海) 有限公司。各供试药剂用丙酮配制成 1 000 mg/L 的母液，并用丙酮稀释至所需浓度，置于 4 ℃ 冰箱保存待用；试验菌种：酿酒高活性干酵母 (黄酒专用)，购于安琪酵母股份有限公司；米曲霉 Aspergillus oryzae，由黄酒酒曲分离获得；其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备HWS24 恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；TGL16M 台式高速冷冻离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；721 G 可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司；KQ2200E 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UV-2450PC 紫外分光光度计，日本岛津公司；XH-C 漩涡混合器，金坛市白塔新宝仪器厂；LDZX-75KB 高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；LRH-250 恒温摇床，上海一恒科技有限公司。
1.3 培养基YPD 培养基：酵母膏 10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖 20 g，去离子水 1 000 mL，于 115 ℃ 灭菌 20 min。
PDA 培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，水 1 000 mL，于 115 ℃ 灭菌 20 min。
淀粉酶发酵培养基：玉米粉 60 g，豆粕粉 20 g，硝酸钠 4.5 g，磷酸氢二钾 2.5 g，硫酸镁 0.8 g，硫酸铁 0.01 g，去离子水 1 000 mL，pH 6.39，于 121 ℃ 灭菌 20 min[9]。
脂肪酶发酵培养基：玉米粉 5 g，蛋白胨 50 g，橄榄油 15 g，硝酸钠 10 g，磷酸氢二钠 2.5 g，氯化钾 0.5 g，硫酸镁 0.5 g，硫酸铁 0.01 g，去离子水 1 000 mL，于 121 ℃ 灭菌 20 min [10]。
1.4 手性农药对黄酒酵母酶活性的影响1.4.1 黄酒酵母粗酶液制备 称取 12 g 干酵母，加入适量石英砂和蒸馏水，充分溶解后，在 4 ℃、8 000 r/min 下离心 10 min，弃去上清液。取沉淀于研钵中，在液氮下充分研磨 1 h，期间加液氮 5 次。加入 40 mL pH = 8.2 的 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，充分振荡，于 4 ℃ 冰箱中静置 30 min。最后于 4 ℃、8 000 r/min 下离心 20 min，保留上清液，即为酵母粗酶液。
1.4.2 蛋白酶活性的测定 参照 Azocasein 法[11]。取质量浓度分别为 50、5、和 0.5 mg/L 的腈菌唑和己唑醇外消旋体和对映异构体各 10 μL，分别与 90 μL 酵母粗酶液于 25 ℃ 下反应 5 min。用 10 μL 丙酮代替上述农药的反应作为对照。加入 100 μL 2% 的 Azocasein 溶液，于 37 ℃ 水浴下反应 1 h。加入 600 μL 10% 的三氯乙酸 (TCA) 终止反应。静置 5 min，在 12 000 r/min 下离心 1 min。取 600 μL 上清液，加入 700 μL 1 mol/L 的氢氧化钠，用可见分光光度计在 440 nm 下测定吸光度。空白样品用 100 μL 去离子水代替，先加入 TCA 终止反应，于 37 ℃ 水浴下反应 1 h 后，再加入 2% 的 Azocasein 溶液。将在一定 pH 值 (pH 3.6 或 7.0) 及 40 ℃ 下，水解酪蛋白每分钟产生 1 μg 酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
1.4.3 超氧化物歧化酶 (SOD) 酶活性的测定 采用邻苯三酚法[12]。取两只试管，分别标记为空白管和样品管，并均加入预热 10 min、pH = 8.2、浓度为 50 mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液。空白管中加入 0.038 mL 10 mmo/L 的 HCl；样品管先加入 0.005 mL SOD 样液，再加入供试农药，使反应体系中农药的质量浓度分别为 5、0.5、和 0.05 mg/L，用丙酮代替农药的反应作为对照。将体系置于 25 ℃ 水浴中反应 20 min，测定 SOD 酶活性。将在 25 ℃ 下，每毫升反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化率达 50% 的酶量定义为 1 个酶活力单位。
1.4.4 淀粉酶活性的测定 采用 DNS 比色法[13]。在 25 mL 磨口塞试管中，加入 9.8 mL 2% 的可溶性淀粉，于 40 ℃ 水浴锅中预热 3~5 min，先加入未稀释的粗酶液 0.2 mL，再加入腈菌唑和己唑醇外消旋体与对映异构体的丙酮溶液，使其在体系中的质量浓度分别为 5、0.5 和 0.05 mg/L，于 40 ℃ 下反应 20 min，测定淀粉酶酶活性。以用去离子水代替酶液的反应为空白，用丙酮代替农药的反应作为对照。以在 40 ℃、pH 4.6 条件下，每小时水解淀粉产生 1 mg 葡萄糖定义为 1 个酶活力单位。
1.4.5 脂肪酶活性的测定 采用对硝基苯酚法[14]，并适当改动[15]。取 100 μL 溶液 A (3 000 mg/L 对硝基苯酚棕榈酸酯异丙醇溶液) 和 2.6 mL 溶液 B (0.5% Triton-X-100 水溶液，pH = 8.0)，混合均匀，加入 1 mL pH = 8.0、浓度为 0.05 mol/L 的 Tris-HCl 缓冲溶液，混合均匀，于 37 ℃ 下静置 2 min。在平行样中分别加入腈菌唑和己唑醇外消旋体及对映异构体，使其在体系中的最终浓度分别为 5、0.5 和 0.05 mg/L。对照用丙酮代替农药。向体系中加入 300 μL 酶液，空白管中加入 300 μL 去离子水替代酶液，其余溶液添加量同上述处理组，于 37 ℃ 水浴下反应 20 min，将所有反应管放入–20 ℃ 的冰箱中 5 min 以终止反应。于 410 nm 下测定吸光度，测定脂肪酶酶活性。以在 37 ℃ 下脂肪酶水解底物每分钟产生 1 μmol 的对硝基苯酚定义为 1 个酶活力单位。
1.4.6 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法[16]。将微生物接种于含不同浓度供试农药外消旋体及对异构体的 YPD 培养基中 (5、0.5、0.05 和 0 mg/L)，在 37 ℃、200 r/min 下摇床培养 36 h，提取其粗酶液。在 900 μL 酶液中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，静置 5 min，在 595 nm 波长处测定吸光度。对照标准曲线测得蛋白质含量。
1.5 手性农药对黄酒米曲霉酶活性的影响1.5.1 米曲霉粗酶液的制备 将米曲霉菌株在 PDA 培养基中扩大培养 (28 ℃，摇床 180 r/min) 后，分别转接于淀粉酶和脂肪酶发酵培养基中继续培养 (28 ℃，180 r/min)。取发酵液于 4 000 r/min 下冷冻离心 10 min，上清液即为粗酶液。
1.5.2 淀粉酶活性测定 采用 DNS 比色法[17]。在 25 mL 磨口塞试管中，加入 1 mL 2% 的可溶性淀粉，在 40 ℃ 水浴锅中预热 3~5 min，加入稀释 5 倍的米曲霉粗酶液 1 mL，再加入腈菌唑和己唑醇外消旋体与对映异构体的丙酮溶液，使其在体系中的质量浓度分别为 5、0.5 和 0.05 mg/L。反应 20 min 后加入 1 mL DNS 试剂，沸水浴中反应 5 min，冷却后加入 7 mL 蒸馏水，摇匀后在 550 nm 下测定吸光度。以用去离子水代替酶液的反应为空白，用丙酮代替农药的反应作为对照。酶活力单位定义同 1.4.4 节。
1.5.3 脂肪酶活性以及蛋白质含量的测定 测定方法分别与 1.4.5 和 1.4.6 节相同，只是将其中的酵母粗酶液替换为米曲霉粗酶液。
2 结果与分析 2.1 手性农药对黄酒酵母酶活性的影响2.1.1 对黄酒酵母蛋白酶活性的影响 由图 1 可以看出：两种农药对映异构体对黄酒酵母蛋白酶活性的抑制作用均大于其外消旋体，但在不同的农药浓度下抑制作用不同。在 0.05 mg/L 下，己唑醇和腈菌唑对映异构体对蛋白酶活性的影响无显著性差异；在 5 mg/L 下，(–)-己唑醇的抑制作用大于 (+)-己唑醇，而腈菌唑对映异构体间无显著性差异；在 0.5 mg/L下，两种农药均对蛋白酶活性表现出强烈的抑制作用，且 (+)-己唑醇和 (+) 腈菌唑的抑制作用分别大于 (–)-己唑醇和 (–)-腈菌唑。
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图 1 己唑醇和腈菌唑对酵母蛋白酶活性的影响 Fig. 1 Effects of hexaconazole and myclobutanil on the yeast protease activity |
2.1.2 对黄酒酵母 SOD 酶活性影响 由图 2 可看出：己唑醇和腈菌唑不同对映异构体对酵母离体 SOD 酶的影响有较大的差异性。在 3 种供试浓度下，腈菌唑外消旋体对 SOD 酶活性均表现出一定的抑制作用，而 (–)-己唑醇和 (+)-腈菌唑均对该酶有激活作用；在 5 mg/L 下，(–)-腈菌唑对该酶活性具有明显的抑制作用。
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图 2 己唑醇和腈菌唑对酵母 SOD 酶活性的影响 Fig. 2 Effects of hexaconazole and myclobutanil on the SOD activity of yeast |
2.1.3 对黄酒酵母脂肪酶活性的影响 由图 3 可以看出：5 mg/L 的 (+)-己唑醇对酵母离体脂肪酶的抑制作用大于 (–)-己唑醇，0.05 mg/L下，己唑醇的 2 个对映异构体间无显著性差异；低浓度的 (+)-腈菌唑对酶活性的抑制作用小于 (–)-腈菌唑，而高浓度条件下则 (+)-腈菌唑大于 (–)-腈菌唑。
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图 3 己唑醇和腈菌唑对酵母脂肪酶活性的影响 Fig. 3 Effects of hexaconazole and myclobutanil on enzyme activity of yeast lipase |
2.1.4 对黄酒酵母淀粉酶活性的影响 由图 4 可以看出：0.05 mg/L 下，腈菌唑和己唑醇对酵母淀粉酶的活性均表现为抑制作用，在 5、0.5 和 0.05 mg/L 时，己唑醇外消旋体对酵母淀粉酶的抑制作用均小于 (+)-己唑醇，在 0.5 和 0.05 mg/L 下腈菌唑外消旋体及对映异构体对淀粉酶无显著性差异；在 5 mg/L 下，(+)-己唑醇的抑制作用大于 (–)-己唑醇，但当农药质量浓度为 0.5 mg/L 时，(–)-己唑醇的抑制作用大于 (+)-己唑醇。
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图 4 己唑醇和腈菌唑对酵母淀粉酶活性的影响 Fig. 4 Effects of hexaconazole and myclobutanil on the activity of yeast amylase |
2.1.5 对黄酒酵母蛋白质含量的影响 由图 5 可看出：己唑醇对酵母总蛋白含量的影响呈现波动性，无明显规律或特征；5 mg/L 时，(–)-腈菌唑对蛋白含量的抑制作用高于 (+)-腈菌唑，在 0.05 mg/L 时，(+)-腈菌唑可以刺激酵母产生更多的蛋白质。
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图 5 己唑醇和腈菌唑对酵母蛋白质含量的影响 Fig. 5 Effect of hexaconazole and myclobutanil on total amount of yeast protein |
2.2 手性农药对黄酒米曲霉酶活性的影响
2.2.1 对黄酒米曲霉淀粉酶活性的影响 由图 6 可以看出：5 mg/L 的农药对米曲霉离体淀粉酶活性有明显的抑制作用，且 (+)-己唑醇的抑制作用最大；在 0.5 mg/L 下，(+)-己唑醇和 (+)-腈菌唑对淀粉酶活性的影响表现为激活作用，而 (–)-腈菌唑对淀粉酶活性具有强烈抑制作用。
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图 6 已唑醇和腈菌唑对米曲霉淀粉酶活性的影响 Fig. 6 Effect of hexaconazole and myclobutanil on the activity of A. oryzae amylase |
2.2.1 对黄酒米曲霉脂肪酶活性影响 由图 7 可以看出：高浓度下，腈菌唑和己唑醇外消旋体对米曲霉脂肪酶的活性表现为激活作用，5 mg/L 的 (+)-己唑醇对脂肪酶活性的激活效果最明显，远高于 (–)-己唑醇，而 (–)-己唑醇则对米曲霉脂肪酶活性表现出一定的抑制作用。
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图 7 己唑醇和腈菌唑对米曲霉脂肪酶活性的影响 Fig. 7 Effects of hexaconazole and myclobutanil on the activity of lipase from A. oryzae |
2.2.3 对米曲霉蛋白质含量影响 由图 8 可看出：腈菌唑和己唑醇可促进米曲霉的产蛋白量，在 5 mg/L 时，腈菌唑外消旋体具有显著的促进作用，明显高于其对映异构体，但在较低浓度下 (0.05 mg/L)，腈菌唑外消旋体表现出的促进作用略低于其对映异构体。己唑醇在不同浓度下，外消旋体及对映异构体之间无显著性差异。
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图 8 己唑醇和腈菌唑对米曲霉蛋白质含量的影响 Fig. 8 Effects of hexaconazole and myclobutanil on A. oryzae protein content |
3 结论与讨论
与等量的啤酒或者葡萄酒相比，黄酒因含有更丰富的氨基酸和其他营养物质而颇受喜爱。酶活性直接影响黄酒中各个组分的含量，如：蛋白酶可影响黄酒中氨基酸的种类和含量，并间接影响黄酒的稳定性和风味；SOD 酶作为自由基清除剂，其在黄酒中的含量将直接影响其保健功能；脂肪酶主要将黄酒中的脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸并进一步生产芳香酯，其和高级醇一起形成黄酒特有的芳香味；淀粉酶将原料中的淀粉分解成糊精和葡萄糖，进一步发酵产生酒精，可影响最终产品中酒精的浓度。本研究考察了在黄酒酿造过程中两种手性农药己唑醇和腈菌唑对酵母中蛋白酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶、淀粉酶的活性和蛋白质含量的影响，以及对米曲霉中淀粉酶、脂肪酶和蛋白质含量的影响，研究结果发现，农药残留会影响酿造微生物中大部分酶的活性，从而影响微生物的生理活性，并可能进一步影响黄酒中相关组分的含量，对黄酒的安全性存在一定影响。同时研究发现，特殊情况下，同一对映异构体可能对酶活性具有不同的作用效果，如 (+)-己唑醇在 0.5 mg/L 下对淀粉酶起激活作用，而在 5 mg/L 下对淀粉酶则起抑制作用；此外，不同对映异构体间对同种酶活性的影响也存在明显差异。因此，在对映异构体水平，研究手性农药对发酵过程的影响具有重要意义，可为黄酒安全性评价及手性农药的残留控制提供新的研究思路和研究方向。
| [1] |
邵建伟, 黄重君, 俞灵燕, 等. 浙江黄酒制造业现状调查与发展研究[J]. 浙江统计, 2009(8): 12–14.
SHAO J W, HUANG C J, YU L Y, et al. Present situation investigation and development of rice-wine industry in Zhejiang province[J]. Zhejiang Statistics, 2009(8): 12–14. |
| [2] |
陈平丽. 浙江黄酒检测合格率仅为10% 市场不容乐观[EB/OL]. (2012-06-19). http://jingji.cntv.cn/2012/06/19/ARTI13400906 85647766.shtml.
CHEN P L. Only 10% qualified rice-wine in Zhejiang with worrying future[EB/OL]. (2012-06-19)[2017-01-20] http://jingji.cntv.cn/ 2012/06/19/ARTI1340090685647766.shtml. |
| [3] |
任清, 徐嘉良, 刘俊含. 黄酒质量安全风险及其控制[J]. 食品科学技术学报, 2016(3): 12–19.
REN Q, XU J L, Liu J H. Safety risk and its control of yellow rice wine[J]. J Food Sci Technol, 2016(3): 12–19. doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2016.03.003 |
| [4] | CHEN N N, GAO H B, YE N S, et al. Fast determination of 22 pesticides in rice wine by dispersive solid-phase extraction in combination with GC-MS[J]. Am J Anal Chem, 2012, 3(1): 33–39. doi:10.4236/ajac.2012.31006 |
| [5] | BRACONI D, POSSENTI S, LASCHI M, et al. Oxidative damage mediated by herbicides on yeast cells[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56(10): 3836–3845. doi:10.1021/jf800074p |
| [6] | CABRAS P, ANGIONI A, GARAU V L, et al. Pesticides in fermentative processes of wine[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47(9): 3854–3857. doi:10.1021/jf990005j |
| [7] | YE J, ZHAO M R, LIU J, et al. Enantioselectivity in environmental risk assessment of modern chiral pesticides[J]. Environ Poll, 2010, 158(7): 2371–2383. doi:10.1016/j.envpol.2010.03.014 |
| [8] |
陆跃乐. 手性农药在食品发酵过程中的立体选择性降解研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2013.
LU Y L. Study on Enantioselective degradation of chiral pesticides in the food fermentation process[D]. Beijing: China Agricultural University, 2013. |
| [9] |
黄新仁, 黎小军, 陶思俊, 等. 基于响应面的米曲霉产 α-淀粉酶的发酵培养基优化
[J]. 广东农业科学, 2012, 39(3): 81–83.
HUANG X R, LI X J, TAO S J, et al. Optimization the α-amylase production by Aspergillus oryzae in fermentation medium using response surface methodology [J]. Guangdong Agric Sci, 2012, 39(3): 81–83. |
| [10] |
邓琳芬, 郑毅, 王娅, 等. 米曲霉产脂肪酶的发酵条件优化[C]//福建省科协第十届学术年会暨第八届青年学术年会论文集. 福州: 福建省科学技术协会, 2011.
DENG L F, ZHENG Y, WANG Y, et al. Optimization of Fermentation conditions for production of lipase from Aspergillus[C]//Fujian provincial association of social sciences annual meeting. Fuzhou: Fujian Association for Science and Technology, 2011. |
| [11] |
周景祥, 王桂芹, 余涛. 蛋白酶和淀粉酶活性检测方法探讨[J]. 中国饲料, 2001(11): 23–24.
ZHOU J X, WANG G Q, XU T. Exploration of the measuring methods of proteinase and amylase[J]. China Feed, 2001(11): 23–24. doi:10.3969/j.issn.1004-3314.2001.11.012 |
| [12] |
邓碧玉, 袁勤生, 李文杰. 改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法[J]. 生物化学与生物物理进展, 1991, 18(2): 163.
DENG B Y, YUAN Q S, LI W J. Modified method for determination of superoxide dismutase activity by pyrogallol autoxidation[J]. Prog Biochem Biophys, 1991, 18(2): 163. |
| [13] |
孙淑琴, 邵冬梅. 比色法快速测定糖化酶活力新方法[J]. 河北省科学院学报, 2009, 26(2): 35–39.
SUN S Q, SHAO D M. Colorimetry-a new method for rapid determination the activity of gluconmylase[J]. J Hebei Acad Sci, 2009, 26(2): 35–39. |
| [14] |
江慧芳, 王雅琴, 刘春国. 三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进[J]. 化学与生物工程, 2007, 24(8): 72–75.
JIANG H F, WANG Y Q, LIU C G. Comparison and improvement of three determination methods for lipase activity[J]. Chem Bioeng, 2007, 24(8): 72–75. |
| [15] |
高贵, 韩四平, 王智, 等. 脂肪酶活力检测方法的比较[J]. 药物生物技术, 2002, 9(5): 281–284.
GAO G, HAN S P, WANG Z, et al. Comparative studies on the assay methods of lipase activity[J]. Pharm Biotechnol, 2002, 9(5): 281–284. |
| [16] |
王孝平, 邢树礼. 考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J]. 天津化工, 2009, 23(3): 40–42.
WANG X P, XING S L. Determination of protein quantitation using the method of coomassie brilliant blue[J]. Tianjin Chem Ind, 2009, 23(3): 40–42. |
| [17] |
李园园. 米曲霉产淀粉酶和纤维素酶的初步研究[D]. 天津: 天津科技大学, 2012.
LI Y Y. Preliminary study on amylase and cellulase fermented in Aspergillus oryzze[D]. Tianjin: Tianjin University of Science & Technology, 2012. |