2017, Vol. 19
番茄叶霉病是由无性态真菌黄枝孢菌 Passalora fulva (Cooke) U. Braun & Crous (syn. Cladosporium fulvum)[1]侵染引起的一种叶部病害，在保护地和露地条件下均可发生[2]。发病后若不加以控制，可导致大部分植株叶片被侵染，最终严重影响番茄产量[3]。近年来，受保护地栽培面积的增加和连年种植的影响，该病已成为番茄生产中的重要病害之一。目前，对番茄叶霉病的防治主要有种植抗病品种、加强栽培管理和喷施化学药剂等。由于番茄叶霉病菌生理小种多、易分化变异且具有强致病性，田间条件下新分化的生理小种容易替代成为优势小种，使许多具有单一抗性基因的抗病品种丧失抗性[4-6]。目前，防治番茄叶霉病仍以喷施化学药剂为主，在中国登记使用的药剂主要有甲基硫菌灵、克菌丹、多抗霉素、氟硅唑和嘧菌酯等[7-10]。研究发现，番茄叶霉病菌已对多菌灵[11-12]、乙霉威[12]、代森锰锌[12-13]、嘧菌酯[14]和氟硅唑[15]等药剂产生了不同程度的抗性。此外，化学药剂的过量使用还可造成农产品中农药残留超标、环境污染等问题。因此，高效、低毒、环境友好的生物农药越来越受到人们的关注。
四霉素又称梧宁霉素，是不吸水链霉菌梧州亚种 (Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis subspl1371) 的发酵代谢物，对子囊菌、担子菌、半知菌均具有较高的抑制活性[13-15]。该药剂在中国已登记用于防治小麦赤霉病、白粉病和杨树溃疡病、细菌性角斑病。有报道四霉素可用于防治水稻稻瘟病[19]、灰霉病[20]和苹果树腐烂病，并有促进腐烂病病疤愈合的作用[21]。此外，四霉素不仅具有较强的抑菌作用，还可以通过诱导防御酶系活性升高而增强植株抗病能力[22]。据嵇国春[23]报道，梧宁霉素对番茄叶霉病有一定防效，但其对番茄叶霉病菌的作用特性和作用方式未见系统研究。本研究采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了四霉素对番茄叶霉病菌的室内毒力，以期明确其对叶霉病菌的作用方式和作用特点，并通过田间药效试验评价其对番茄叶霉病的防治效果。
1 材料与方法 1.1 供试材料1.1.1 供试病原菌 分别在山东 (滨州、淄博、泰安、聊城、济南)、北京和哈尔滨的日光温室采集番茄叶霉病病叶，经室内单孢分离得到 9 株番茄叶霉病菌菌株 (BZ、ZB-1、ZB-2、TA-1、TA-2、LC、JN、BJ、HEB)，将其接种于 PDA 斜面上，于 4 ℃ 保存，备用。
1.1.2 供试药剂 15% 四霉素母药和 0.3% 四霉素 (tetramycin) 水剂 (辽宁微科生物工程有限公司)；95% 甲基硫菌灵 (thiophanate-methyl) 原药 (山东潍坊润丰化工股份有限公司)；70% 甲基硫菌灵可湿性粉剂 (浙江新安化工集团股份有限公司)。
1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (potato dextrose agar，PDA) 用于菌株的分离、纯化、培养以及保存；水琼脂培养基 (water agar，WA) 用于孢子萌发及芽管伸长的测定。
1.2 试验方法1.2.1 四霉素对番茄叶霉病菌菌丝生长的抑制活性 采用菌丝生长速率法[24]。将 15% 四霉素母药用丙酮溶解，配成 10 000 μg/mL 的四霉素母液[17]，再用 0.1% 的吐温-80 水溶液稀释成系列浓度的四霉素标准溶液，与加热冷却至 50 ℃ 左右的 PDA 培养基以 1 : 9 比例混合，最终配成四霉素质量浓度分别为 0.603、0.723、0.868、1.042 和 1.25 μg/mL 的系列含药平板。95% 甲基硫菌灵原药按同样的方法配成质量浓度分别为 5、10、50、100、500 和 1 000 μg/mL 的含药平板。以不含药剂处理为空白对照。将分离纯化所得的菌株培养 7 d 后，用打孔器在菌落边缘打取直径为 8 mm 的菌饼，接种在PDA平板上。于 25 ℃ 下培养 14 d 后采用十字交叉法测量菌落直径。每处理重复 4 次，根据公式 (1) 和 (2) 计算各药剂处理对菌丝生长的抑制率。
| ${\text{菌落增长直径}}/{\rm{mm}}{\rm{ = }}{\text{菌落直径}}{\rm{ - }}{\text{菌饼直径}}$ | (1) |
| $\begin{array}{l}{\text{菌丝生长抑制率}}/{\rm{\text{\%}}}{\rm{ = }}100 \times \text{(对照菌落增长直径} -\text{处理菌落增长直径)} /{\text{对照菌落增长直径}}\end{array}$ | (2) |
1.2.2 四霉素对番茄叶霉病菌孢子萌发及芽管伸长的抑制活性 采用孢子萌发法[25]。将番茄叶霉病菌在 PDA 平板上培养 7 d，用灭菌去离子水洗下分生孢子，经灭菌纱布过滤制得孢子悬浮液，用血球板计数并将孢子悬浮液浓度调至约 1 × 105 个/mL。按 1.2.1 节的方法将供试药液稀释成系列浓度，与加热后冷却至 50 ℃ 的 WA 培养基以 1 : 9 比例混合，制成药剂质量浓度为 0.002 5、0.005、0.01、0.02、0.04 μg/mL 的系列含药平板。以不含药剂处理为空白对照。量取 100 μL 孢子悬浮液均匀涂布于WA含药平板上，于 25 ℃ 培养箱中黑暗培养 20 h，在低倍光学显微镜下观察孢子萌发情况。每重复随机调查 3 个视野，调查孢子总数不少于 200 个，分别对孢子总数及孢子萌发数进行计数，并记录分生孢子芽管的长度，每处理重复 4 次。根据公式 (3)~(6) 计算各药剂处理对孢子萌发的相对抑制率及芽管伸长抑制率。
| ${\text{孢子萌发率}}/{\rm{\text{\%} }}{\rm{ = }}100 \times {\text{孢子萌发数}}/{\text{孢子总数}}$ | (3) |
| $\begin{array}{l}{\text{处理组校正孢子萌发率}}/{\rm{\text{\%} }}{\rm{ = }}100 \times{\text{处理组孢子萌发率}}/{\text{对照孢子萌发率}}\end{array}$ | (4) |
| $\begin{array}{l}{\text{孢子萌发相对抑制率}}/{\rm{\text{\%} }}{\rm{ = }}100 \times {\text{(对照孢子萌发率}}{\rm{ - }} {\text{处理组校正孢子萌发率)}} /{\text{对照孢子萌发率}}\end{array}$ | (5) |
| $\begin{array}{l}{\text{芽管伸长抑制率}}/{\rm{\text{\%} }}{\rm{ = }} {\text{(对照芽管长度}}{\rm{ - }} {\text{处理芽管长度)}} /{\text{对照芽管长度}}\end{array}$ | (6) |
1.2.3 四霉素对番茄叶霉病菌菌丝及孢子萌发形态的影响 参照 1.2.1 和 1.2.2 节方法，采用四霉素抑制番茄叶霉病菌菌丝生长和孢子萌发的 EC90 浓度用于测定其对病菌菌丝、孢子及芽管形态的影响[26]。以不含药剂处理为空白对照。待菌丝生长 7 d 后，挑取菌落边缘菌丝于载玻片上，通过显微镜观察四霉素在 EC90 浓度下对菌丝形态的影响；于涂布孢子 24 h 后，通过显微镜观察四霉素 EC90 浓度下对孢子以及芽管形态的影响。
1.2.4 四霉素对番茄叶霉病的田间防效试验 参考《农药田间药效试验准则》[27]进行。分别于 2016 年 4—6 月和 9—11 月在山东省泰安市岱岳区大汶口镇东大吴村日光温室进行，供试番茄品种均为金鹏 11-8。四霉素的施用剂量分别为有效成分 3.375、6.75 和 20.25 g/hm2，以甲基硫菌灵有效成分 540 g/hm2 作为对照药剂，以清水处理为空白对照。每小区面积 20 m2，采用完全随机区组设计，每处理 4 次重复。治疗作用试验于番茄叶霉病发病后施药，并调查施药前病情指数；保护作用试验于番茄叶霉病发病前施药。两次试验均每隔 7 d 施药 1 次，共施药 3 次，首次施药后 7 d 及末次施药后 10 d 调查植株的病情指数，并观察记录番茄植株的形态、叶色、叶形等。每处理随机 3 点取样，每点 5 株，每株取上、中、下各 1 张复叶，以复叶上每张小叶片病斑面积占整个小叶片面积的百分率分级。分级标准为：0 级：无病斑；1 级：病斑面积占整个小叶面积的 5% 以下；3 级：病斑面积占整个小叶面积的 6%~10%；5 级：病斑面积占整个小叶面积的 11%~20%；7 级：病斑面积占整个小叶面积的 21%~50%；9 级：病斑面积占整个小叶面积的 51% 以上；并根据公式 (7)~(9) 计算病情指数及防效。
| $\begin{array}{l}{\text{病情指数}}/ \text{\%} ={\displaystyle\sum} \left[ \text{(病级数} \times \text{病级叶数)}/{\text{(调查总叶数}} \times 9 \text{)} \right] \times 100\end{array}$ | (7) |
| $\begin{array}{l}{\text{防治效果}} {\text{(药前有基数)}} / \text{\%} =\left[ {1 - \text{(空白对照药前病情指数}} \right. \times \text{处理组药后病情指数)}/ \\[9pt] \left. {\text{(空白对照药后病情指数}\times } {\text{处理组药前病情指数)} } \right] \times 100\end{array}$ | (8) |
| $\begin{array}{l}{\text{防治效果}} {{\text{(药前无基数)}}} /{\rm{\text{\%} }}{\rm{ = }} {{\text{(对照组病情指数}} - {\text{处理组病情指数)}}} /{\text{对照组病情指数}} \times 100\end{array}$ | (9) |
采用 DPS 7.05 软件计算药剂对番茄叶霉病菌菌丝生长、孢子萌发及芽管伸长的毒力回归方程、EC50 值 (EC90 值) 及 95% 置信限。田间药效试验数据采用 Duncan 新复极差法进行差异显著性分析。
2 结果与分析 2.1 四霉素对番茄叶霉病菌的毒力由表 1 至表 3 可知：四霉素对番茄叶霉病菌的孢子萌发、芽管伸长以及菌丝生长均具有较高的抑制活性，其 EC50 平均值分别为 0.006 3、0.003 9 和 1.003 4 μg/mL。而对照药剂甲基硫菌灵对供试的 9 株番茄叶霉病菌的抑制活性较低，其 EC50 值均大于 1 000 μg/mL，表明四霉素对番茄叶霉病菌的抑制活性明显高于甲基硫菌灵。从表中还可看出，番茄叶霉病菌的各发育阶段对四霉素均较为敏感，但四霉素对不同地区来源的 9 株番茄叶霉病菌菌株孢子萌发、芽管伸长和菌丝生长的敏感性差异不大，相对毒力指数最大仅为 26.0。
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表 1 四霉素对番茄叶霉病菌孢子萌发的抑制活性 Table 1 Inhibitory activity of tetramycin against conidial germination of Passalora fulva |
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表 2 四霉素对番茄叶霉病菌芽管伸长的抑制活性 Table 2 Inhibitory activity of tetramycin against germ-tube elongation of Passalora fulva |
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表 3 四霉素对番茄叶霉病菌菌丝生长的抑制活性 Table 3 Inhibitory activity of tetramycin against mycelium growth of Passalora fulva |
2.2 四霉素对番茄叶霉病菌菌丝及孢子形态的影响
由图 1 可以看出：对照处理的新生菌丝表面光滑，纤细直长，粗细均匀一致，隔膜间距较大 (图 1A)；而四霉素 EC90 浓度处理后菌丝生长受阻，末端菌丝变粗，隔膜变厚，部分菌丝分支增多 (图 1B)。四霉素 EC90 浓度处理分生孢子后，与对照 (图 1C) 相比，大部分分生孢子不再萌发；即便有少量分生孢子可以萌发，但萌发后的芽管膨大变粗且生长受抑制，芽管长度显著短于对照处理 (图 1D)。
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A. 对照菌丝；B. 四霉素 EC90 浓度处理后的菌丝；C. 对照芽管；D. 四霉素 EC90 浓度处理后的芽管。 A. Mycelium of control; B. Mycelium after tetramycin EC90 treatment; C. Germ tubes of the control; D. Germ tubes after tetramycin EC90 treatment. 图 1 四霉素对番茄叶霉病菌菌丝生长和孢子萌发的影响 Fig. 1 Effect of tetramycin on the mycelium growth and conidial morphology of Passalora fulva |
2.3 四霉素对番茄叶霉病的田间防治效果
治疗性试验结果见表 4。于番茄叶霉病发病后施药，末次施药 10 d 后四霉素各浓度处理防效均显著高于对照药剂甲基硫菌灵，且随处理剂量增大，其防效相应提高，各处理间存在显著差异。保护性试验得到了与治疗性试验相似的结果 (表 5)。
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表 4 四霉素对番茄叶霉病的治疗效果 (2016 年 4—6 月) Table 4 The field control curative efficacy of tetramycin on tomato leaf mold (Apr.-Jun., 2016) |
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表 5 四霉素对番茄叶霉病的保护效果 (2016 年 9—11 月) Table 5 The field control protective efficacy of tetramycin on tomato leaf mold (Sep.-Nov., 2016) |
两次田间试验数据表明，施药后各药剂处理的病情指数均明显低于清水对照处理，表明药剂处理均能够明显抑制叶霉病的发展，并表现出明显的浓度效应。相同有效成分的四霉素在番茄叶霉病发病前施药的防效高于发病后施药的防效，因此，四霉素防治番茄叶霉病时应该采用保护性施药。
3 讨论相对于化学合成农药，生物源农药残留风险低，环境相容性好[28]。目前，四霉素在中国已登记用于防治多种植物病害，成为生物源农药的代表性品种之一。该药剂作用谱广、作用方式多样。除已登记的病害外，四霉素对黄曲霉、黑曲霉[29]、稻瘟病菌[19]、甘薯蔓割病菌[30]、甘薯根腐病菌[31]等均具有较强的抑制作用。本研究中，四霉素对番茄叶霉病菌的菌丝生长、孢子萌发以及芽管伸长均具有较高的毒力，其 EC50 值均小于 1.5 μg/mL，尤其是对孢子萌发和芽管伸长表现出较高的毒力 (平均 EC50 值分别为 0.006 3 和 0.003 9 μg/mL)。四霉素对不同地区来源的番茄叶霉病菌菌株孢子萌发、芽管伸长和菌丝生长的相对毒力指数均较低，表明各地区间番茄叶霉病菌对四霉素均具有较高敏感性。
本研究中四霉素处理番茄叶霉病菌后，菌丝生长受阻、部分菌丝末端分支增多，分生孢子萌发受抑制，部分萌发的孢子芽管膨大变粗，伸长受抑制，该结果与赵新海等[19]报道的四霉素处理对稻瘟病菌菌丝和分生孢子的影响类似。表明四霉素可能是通过影响菌丝及分生孢子的形态发育来抑制病菌。
综合两季的试验结果，四霉素有效成分 20.25 g/hm2 处理对番茄叶霉病具有较高的保护及治疗作用，防效均达 70% 以上，显著高于对照药剂甲基硫菌灵有效成分 540 g/hm2 处理的防效。这与嵇国春[23]的研究结果基本一致。由于四霉素兼具有保护作用和治疗作用，因此在叶霉病发病前和发病初期施药均可有效控制病害的发生。
4 结论四霉素对番茄叶霉病菌具有较高的毒力，兼具有抑制菌丝生长、孢子萌发、芽管伸长的活性。0.3% 四霉素水剂以有效成分 6.75 和 20.25 g/hm2 喷雾处理对番茄植株安全，且对番茄叶霉病具有良好的保护和治疗效果，在番茄叶霉病防治中具有较大的应用潜力。
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