2017, Vol. 19
桃小食心虫 Carposina sasakii Matsumura 属鳞翅目 (Lepidoptera) 蛀果蛾科 (Carposinidae)，又叫桃蛀果蛾，简称“桃小”，广泛分布在中国北方果区，食性杂，可为害苹果、枣、梨、桃、杏等 10 多种果树的果实，近年有逐年加重趋势[1-2]。由于桃小食心虫世代周期长、繁殖能力强、隐蔽性强，难以预测及防治，因此是昆虫生理学、病理学及毒理学等研究领域的重要研究对象[3]。目前，化学防治仍是主要防治方法之一。高效氯氰菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂是田间防治桃小食心虫使用年限最长，且较为广泛的杀虫剂，但其作用位点单一，极易诱发害虫产生抗药性。而杀虫剂亚致死效应与害虫抗药性发展及部分害虫再猖獗紧密相关[4]。近年来，人们在有关拟除虫菊酯类杀虫剂对害虫亚致死效应方面做了很多工作，包括对害虫及其天敌的生物学、生态行为和生殖力及解毒酶等方面的影响[4-6]。近期研究表明，用亚致死浓度的高效氯氰菊酯处理桃小食心虫后，雌蛾的求偶百分比降低，且对雌\雄蛾生殖力的影响存在一定差异[7]。目前，有关杀虫剂亚致死浓度处理对桃小食心虫解毒酶的影响尚缺乏更深入的研究。已有的结果表明，杀虫剂亚致死效应主要是通过影响害虫生理和行为两种途径影响害虫的种群动态[8-9]，且不同杀虫剂或化合物对昆虫解毒酶的诱导水平及影响剂量存在一定差异[10]。
本研究拟从昆虫解毒酶系的角度，揭示桃小食心虫成虫经高效氯氰菊酯处理后的生理生化响应，并测定药剂压力解除后试虫体内解毒酶系活性在不同时期的变化情况，以期更全面地评价拟除虫菊酯类杀虫剂亚致死浓度对桃小成虫解毒酶系的影响，进而预测种群动态，为桃小食心虫成虫“预防性”防治及其抗性治理提供必要的理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试虫源2014 年 7 月，从辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所苹果试验园 (40.61°N，120.73°E) 中收集带有桃小食心虫为害症状的苹果，并获得脱果幼虫。随后采用未成熟的“金冠”苹果在 25 ℃ ± 1 ℃、相对湿度 70% ± 5%、光周期为 16L:8D 的养虫室内连续累代饲养，并于每年 6 月底定期从田间采集试虫与室内种群杂交进行种群复壮[11]。至本研究之际，已在室内连续饲养 20 余代。以室内种群当天所羽化的成虫作为供试虫源。
1.2 供试药剂及主要仪器94.1% 高效氯氰菊酯 (beta-cypermethrin) 原药，由中国农业科学院植物保护研究所提供；N,N-二甲基甲酰胺 (DMF，纯度 > 99.5%)，北京世纪红星化工有限责任公司；曲拉通 (Triton X-100，纯度 > 95%)，上海化学试剂采购供应站美国进口分装。用 DMF 将高效氯氰菊酯原药配制成 104 mg/L 的药液，于 4 ℃ 冰箱保存。
还原型辅酶 II (NADPH Na4，≥ 98%)、毒扁豆碱 (eserine，98%)、苯甲基磺酰氟 (PMSF，≥ 98.0%)、 二硫苏糖醇 (DTT，> 99%)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris，> 99.5%) 和甘氨酸 (glycerine，> 99.5%) 为宝如亿生物产品；1-氯-2,4-二硝基苯 (CDNB，≥ 99.0%) 和 7-乙氧基香豆素 (7-ethoxycoumarm，99.0%) 为 AIfa Aesar® 产品；牛血清白蛋白 (BAS，≥ 98.0%) 和考马斯亮蓝 G-250 (优级纯) 为沃凯®产品；7-羟基香豆素 (umbelliferone，≥ 99.0%) 和固蓝 B 盐 (fast blue B salt，> 90.0%) 为 BOMEI 公司产品； EDTA Na2·2H2O (99.0%) 为 GEWNVIEW 公司产品；L-谷胱甘肽 (还原型，> 99.5%) 为 Rocha 公司产品；乙酸-α-萘酯 (1-naphthylacetate，≥ 99.0%)、2-甲氧基酚 (≥ 99.5%)、三氯乙酸 (TCA，≥ 99.0%) 和十二烷基硫酸钠 (SDS，电泳级) ，购自国药集团上海化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
UV-1900PC 型紫外-可见分光光度计 (上海美析仪器有限公司)；Infinite 200 Pro TECAN 酶标仪 (奥地利 TECAN 有限公司)；Thermo Scientific SORVALL® Stratos® 冷冻高速离心机 (Thermo Fisher Scientific Co., 德国) 等。
1.3 生物活性测定采用药膜法测定药剂对桃小食心虫成虫的毒力[12]。将 106 mg/L 的高效氯氰菊酯母液，用含体积分数为 0.05% 曲拉通的水溶液稀释成质量浓度分别为 0、1.25、2.5、5、10、20、40 mg/L 的供试药液。用微型喷雾器将供试药液均匀喷洒在干燥玻璃缸 (直径 13 cm，高 15 cm) 内壁及盖子上，每浓度重复喷雾 1 mL，共重复 4 次。待溶剂挥发后制成药膜，引入当天羽化的桃小食心虫雌/雄处女蛾，每缸各 8 头，以含 5% 蜂蜜水的棉花球饲喂。每浓度共处理成虫 64 头。置于温度为 25 ℃ ± 1 ℃、相对湿度 (70 ± 5)%、光周期 16L:8D 的条件下饲养，以清水 (含体积分数为 0.05% 的 TritonX-100 和 1% 的 DMF) 作空白对照。处理 48 h 后检查成虫死亡率。以毛笔轻触虫体无反应视为死亡。
1.4 亚致死浓度的药剂处理方法根据毒力测定结果，获得高效氯氰菊酯对桃小食心虫成虫的毒力回归方程，进一步计算得到 24 h 的亚致死浓度值：LC10、LC20 和 LC40 值，再分别将各亚致死浓度的高效氯氰菊酯药液均匀喷洒于玻璃缸内壁 (13 × 15 cm) 及盖子上 (每浓度重复喷雾 1 mL)。其余操作同 1.3 节。药剂处理 24 h 后，将各处理成虫移至洁净的养虫缸进行常规饲养，分别于药剂压力解除后 0、6、12、24 h 挑取存活的桃小成虫 (雌、雄蛾分开)，于液氮中速冻 30 s，测定其解毒酶的活性。以 0.05% 曲拉通水溶液处理为对照组，每个处理重复 3 次 (每个处理共取雌、雄蛾各 20 头)。
1.5 酶原提取及活性测定方法1.5.1 细胞色素 P450 7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶 (ethoxycoumarin O-de-ethylase, ECOD) 活性的测定 取 6 头大小一致的成虫 (雌、雄蛾分开取样) 胸腹于 2.0 mL 离心管中，加入 0.6 mL 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液 (pH 7.8，含 10% 甘油、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT 和 1 mmol/L PMSF)，冰浴匀浆。匀浆液于高速冷冻离心机上以 12 000 r/min、4 ℃ 离心 10 min；取出上清液再次离心 30 min，以所得上清液作为酶原[13]。ECOD 活性参照邢静等[14]改进的方法测定。以 7-乙氧基香豆素为底物，将 1 mL 反应混合液 (含 0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl、20 mg/mL BSA、12 mmol/L NADPH 和 250 μL 酶液) 在 34 ℃ 摇床上振荡反应 15 min，最后加入 300 μL 15% 的三氯乙酸 (TCA) 终止反应。取混合物上清液，并加入 450 μL pH 10.5、1.6 mol/L 的 Gly-NaOH 调节 pH 至 10 左右，最终于酶标仪中测定产物 7-羟基香豆素的含量 (激发波长 358 nm，发射波长 456 nm，狭缝宽度皆为 5 nm)。试验设 3 个重复，每重复平行测定 3 次。以 7-羟基香豆素标准品测定结果绘制标准曲线，计算 ECOD 的比活力，单位为 pmol·min–1·mg–1 pro.。
1.5.2 羧酸酯酶 (carboxylesterase, CarE) 活性测定 取 6 头大小一致的成虫 (雌、雄蛾分开取样) 胸腹于 2.0 mL 离心管中，加入 0.6 mL 0.04 mol/L 的磷酸缓冲液 (pH 7.0)，冰浴匀浆。上清液即酶原的制备同 1.5.1 节。CarE 酶活性参照李腾武等[15]方法测定，略加改进。反应体系 1.15 mL，其中酶原液 50 μL、0.04 mol/L (pH 7.0) 磷酸缓冲液 200 μL、300 μmol/L 底物工作液 (含 300 μmol/L 的 α-乙酸萘酯和 300 μmol/L 的毒扁豆碱)。摇匀后于 37 ℃ 下反应 30 min 后，加入显色液 (1% 固蓝 B 盐和 5% SDS 体积比为 2:5 的混合液) 250 μL 终止反应。室温放置 20 min，于 600 nm 处测定光密度，重复 3 次。以每毫克蛋白在 30 ℃ 反应 1 min 使反应体系中 α-萘酚产物浓度升高 1 nmol/L 为一个酶活力单位 (nmol·min–1·mg–1 pro.)。
1.5.3 谷胱甘肽 S-转移酶 (glutathione S-transferases, GSTs) 活性测定 取 8 头大小一致的成虫 (雌、雄蛾分开取样) 胸腹于 2.0 mL 离心管中，加入 0.6 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液 (pH 6.5)，冰浴匀浆。上清液即酶原的制备同 1.5.1 节。GSTs 活性参照梁沛等[6]改进的方法测定。在室温下，加入 0.1 mol/L pH 6.5 的磷酸缓冲液 2.7 mL，30 mmol/L 的 CDNB 和 20 mmol/L 的 GSH 各 0.1 mL，于 340 nm 波长处，用时间驱动程序自动监测其光吸收值在 3 min 内的变化。以每毫克蛋白在 3 min 内使反应体系中产物浓度升高 1 nmol/L 为一个酶活力单位 (nmol·min–1·mg–1 pro.)。
1.5.4 蛋白质含量测定 参照文献 [16] 并经文献 [17] 修改的方法，取 1.5 mL 酶液加入 1.5 mL 考马斯亮蓝溶液 (蛋白体积与 G-250 体积为 1:1)，用紫外分光光度计于 595 nm 处测定吸光度。重复 3 次取平均值。2~15 min 之内完成测定。以牛血清白蛋白 BSA 为标准品测定蛋白质浓度。
1.6 数据处理方法利用 DPS 7.05 分析软件及 Excel 进行数据处理，按 Abbott 公式和 Finney 机率值分析法[18]获得高效氯氰菊酯对桃小食心虫成虫的毒力回归方程、LC50 值及 95% 置信限。采用 SPSS 21.0 统计分析软件对数据进行差异显著性分析，采用 Duncan 氏新复极差法分析平均值之间的差异著性。
2 结果与分析 2.1 高效氯氰菊酯对桃小食心虫成虫的毒力高效氯氰菊酯对桃小食心虫成虫 24 h 的毒力测定结果见表 1，其毒力 LC50 值为 17.01 mg/L，95% 置信限为 14.33~20.18 mg/L，卡方检验显著水平为 0.986 (P > 0.05)。进一步计算得到高效氯氰菊酯分别对桃小食心虫成虫的 LC10、LC20 和 LC40 值，用于后续试验处理。
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表 1 桃小食心虫成虫对高效氯氰菊酯的毒性 Table 1 Toxicity of beta-cypermethrin to adults of Carposina sasakii |
2.2 高效氯氰菊酯亚致死浓度对桃小成虫解毒酶活性的影响
LC10、LC20 和 LC40 浓度的高效氯氰菊酯处理对桃小雌/雄蛾体内主要解毒酶的诱导作用见图 1。在药剂处理 24 h 时，各处理组雌/雄蛾体内 ECOD 比活力变化基本一致，其中 LC10 处理组雄/雌蛾 ECOD 比活力相比对照均明显降低。随着药剂处理浓度的增加，ECOD 酶活力回升，LC20 和 LC40 浓度的高效氯氰菊酯对 ECOD 活性的诱导作用开始体现，但只有雌蛾 LC40 处理组与对照组表现出显著差异 (P < 0.05)。与 ECOD 酶不同，高效氯氰菊酯不同亚致死浓度处理对桃小成虫体内 CarE 和 GSTs 的作用相似，但各处理组雄、雌的生理响应却大相径庭。在药剂处理 24 h 时，与对照相比，LC20 和 LC40 浓度处理组对雄蛾 CarE 和 GSTs 活力的诱导作用显著增加；而对雌蛾 CarE 和 GSTs 活力则体现出不同程度的抑制作用，LC20 和 LC40 处理组雌蛾体内 CarE 和 GSTs 活力均显著低于对照组 (P < 0.05)，但 LC10 处理组 GSTs 活力仍保持较高水平。
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A：ECOD；B：CarE；C：GSTs。图中数值为平均值 ± 标准误。图柱上不同字母表示同一时间段不同处理组之间差异显著 (Duncan 检测，P < 0.05)。 Each bar represents the mean±SE of the three independent experiments. Histograms followed by different letters indicate significantly different at 0.05 level (Duncan’s multiple range test) at the same time by different treatment. 图 1 不同亚致死浓度高效氯氰菊酯处理 24 h 时对桃小食心虫成虫解毒酶活性的影响 Fig. 1 Effects of different sublethal concentrations of beta-cypermethrin on the detoxifying enzyme activities in C. sasakii adults at 24 h after treatments |
随着药剂胁迫消除时间的延长，桃小食心虫成虫在 0~24 h 内比活力变化表现出一定的时间-剂量效应，且雌、雄蛾体内酶活力变化曲线有所不同 (图 2)。如图 2A 显示：各处理雌蛾 ECOD 比活力在 0~24 h 内呈峰形波动，6 h 是比活力峰值，其中 LC20 和 LC10 处理组在开始阶段，比活力比对照组有所增加，随后处理组与对照组基本趋于一致。而雄蛾体内 ECOD 酶比活力表现出先上升后下降的过程，与对照相比，各处理组 ECOD 比活力均受到明显抑制，且比活力峰值相对滞后，其中 LC10 处理组 ECOD 比活力在 24 h 内基本低于对照组，而 LC20 和 LC40 处理组 ECOD 比活力于 12 h 后表现出下降趋势，但仍显著高于对照 (P < 0.05)。
图 2B 结果显示：药剂胁迫 24 h 后 (图中 0 h)，各处理组桃小雌蛾体内 CarE 比活力均显著降低。随着药剂压力消除后时间的延长，所有处理雌蛾体内 CarE 比活力变化基本一致，与 ECOD 比活力不同，CarE 比活力表现为先降低后升高。6 h 内，各处理对 CarE 的抑制程度均表现出一定的剂量效应，随后，LC20 和 LC40 处理组雌蛾 CarE 比活力比对照有所增加，12 h 时显著高于对照组；但总体上，LC10 处理组雌蛾体内 CarE 比活力在药剂压力消除后每个时期均低于对照组。与雌蛾不同，各处理雄蛾 CarE 比活力在 6 h 时基本趋于一致，随后快速上升，于 12 h 达到高峰；随后各处理 CarE 比活力逐渐下降，24 h 时，LC20 和 LC40 处理组比活力相比对照受到显著抑制 (P < 0.05)。
图 2C 结果显示：药剂胁迫压力消除后，LC10 处理组雌蛾 GSTs 比活力的变化与对照组基本一致，表现为先下降后回升，且在每个时期均高于对照组；但 LC20 和 LC40 处理组 GSTs 比活力则表现为先升后降，6 h 时达最大值，且显著高于对照组 (P < 0.05)，随后两处理组比活力在 12 h 时恢复到对照组水平；12 h 后，LC40 处理组 GSTs 比活力仍持续下降，24 h 时显著低于对照组 (P < 0.05)。与雌蛾相比，各处理组对雄蛾 GSTs 的激活作用相对提前，在药剂压力解除后 12 h 内基本上高于对照组。其中 LC10 处理组与对照组 GSTs 比活力变化均为先降低后升高，但 LC10 处理组在每个时期均显著高于对照组；而 LC20 和 LC40 处理组 GSTs 比活力在 24 h 内始终维持在较高水平，总体表现为逐渐下降的趋势。
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A：ECOD；B：CarE；C：GSTs。图中数值为平均值 ± 标准误。不同字母表示同一时间段不同处理组之间差异显著 (Duncan 检测，P < 0.05)。 Each represents the mean ± SE of the three independent experiments. Histograms followed by different letters indicate significantly different at 0.05 level (Duncan’s multiple range test) at the same time by different treatment. 图 2 不同亚致死浓度的高效氯氰菊酯胁迫解除后桃小食心虫成虫 ECOD、CarE 和 GSTs 的活力变化 Fig. 2 Dynamics of ECOD, CarE and GSTs activities in C. sasakii adults freed from different sublethal concentrations of beta-cypermethrin stress |
3 讨论
昆虫解毒酶系的活性能被各种外源化合物所诱导，这使昆虫在受到严重的化学环境压力下能迅速作出反应，从而存活下来[19]。因此，Rumpf 等[20]明确提出酶比活力可以作为一种生物标记来测定杀虫剂的亚致死效应。昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢抗性与昆虫体内多种解毒酶包括细胞色素 P450 单加氧酶的高表达、CarE 和 GSTs 的活性变化密切相关[20]。
细胞色素 P450 单加氧酶是一类氧化代谢酶系，在解毒代谢中起到重要作用。P450 单加氧酶活力升高是多种害虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的普遍机制[21-24]。Scott 等[25]报道，抗性家蝇 Musca domestica 微粒体 MFOs 的 6 种单加氧酶活性的增强在家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性中起重要作用；棉铃虫抗氰戊菊酯种群中肠、脂肪体和体壁的甲氧试卤灵-O-脱甲基酶 (MROD)、乙氧试卤灵-O-脱乙基酶 (EROD)、ECOD、芳烷基羟基化酶 (AHH)、艾氏剂环氧化酶 (AE) 等 5 种单加氧酶的活性绝大多数都有不同程度的提高[26]。本研究用不同亚致死浓度的高效氯氰菊酯处理桃小食心虫成虫 24 h 后，其中 LC40 处理组的高效氯氰菊酯诱导桃小成虫体内 ECOD 比活力显著增高，而低浓度的 LC10 处理组则抑制 ECOD 活性 (图 2A)。笔者认为，ECOD 酶对化合物的反应强弱可能与药剂浓度有关，药剂浓度越大，桃小食心虫成虫对其的刺激反应越剧烈，表现为酶活性快速提高，为降解潜在的有毒化合物做准备，而低浓度药剂处理则使得桃小食心虫成虫 ECOD 对药剂的适应或敏感性下降。
CarE 和 GSTs 是昆虫体内的重要解毒酶系。Dhiraj 等[27]认为 GSTs 和酯酶 (general esterases，GE) 活性的增强与田间茶细蛾 Helopeltis theivora 的抗药性密切相关。CarE 能水解酯类毒性化合物中的酯键，或与亲脂类有毒化合物结合降低其有效浓度，从而降低有毒化合物的毒性[28]。尽管 GSTs 不能直接代谢拟除虫菊酯，但 GSTs 作为昆虫对外源有毒物质 (含杀虫剂) 代谢中重要的共轭酶系之一，能使外源的亲电基团与体内还原型谷胱甘肽发生共轭代谢，而保护体内其他亲核中心，如蛋白质和核酸[28-30]。另外 Rumpf 等[20]研究认为，不同杀虫药剂亚致死浓度对不同昆虫 GSTs 活性的影响可能存在差异。本研究发现，亚致死浓度的高效氯氰菊酯处理对桃小食心虫雄蛾的 CarE 和 GSTs 活性有一定的诱导作用，但对雌蛾的 CarE 和 GSTs 则表现出一定的抑制作用 (图2B 和 C)，这与梁沛等[6]用亚致死浓度的阿维菌素和高效氯氰菊酯处理小菜蛾后其 CarE 活性的变化相似，但本研究结果存在一定的性别差异 (图2B 和 2C)，对雄蛾体内解毒酶活性的诱导总体上高于雌蛾。这可能是由桃小食心虫雌/雄蛾个体生理机制或对药剂敏感性差异造成的。从短期响应来看，ECOD、CarE 和 GSTs 3 种解毒酶在桃小食心虫成虫对高效氯氰菊酯的生理响应中均起到了重要的作用，尤其是雄蛾，其对外界化合物降解的敏感性更高。
但当药剂压力消除后，随着处理时间的延长，当所摄取的药剂浓度降低对自身无影响或无毒害作用时，桃小食心虫成虫体内解毒酶的活性可能就会逐渐降低。当摄取的药剂浓度仍对自身有毒害作用时，桃小食心虫成虫体内的解毒酶不但会继续发挥其活性，还会增强，以期加快对有毒化合物的降解，维持自身生命活动的正常进行。虽然高效氯氰菊酯的作用靶标是昆虫神经轴突上的钠离子通道，但本研究发现，桃小食心虫雌、雄蛾体内的 3 种解毒酶对高效氯氰菊酯的生理响应表现出一定的时间-剂量效应，且雌、雄蛾体内酶活力变化趋势有所不同 (图 2)。LC10 浓度的高效氯氰菊酯处理桃小食心虫成虫后，GSTs 的酶比活力基本高于对照组，但 ECOD 和 CarE 比活力则低于对照组。说明高效氯氰菊酯作为一种外源物，进入昆虫体内后抑制了 ECOD 和 CarE 的活性，削减了其代谢解毒能力，使其在该亚致死浓度下不易产生抗药性。另外，LC10 处理组由于药剂浓度不足以产生直接毒害作用，3 种解毒酶活力变化总体趋势较为平缓，并与对照组一致。与之相比，LC20 和 LC40 处理组成虫对体内解毒酶的诱导作用更为显著，变化波动也较大。对于 ECOD 和 CarE，各处理组酶活力变化总体趋势虽没有明显差异，但存在一定的性别差异 (图 2)，说明桃小食心虫雌、雄蛾在药剂胁迫后体内代谢解毒机制及采取的生存对策可能存在差异。对于 GSTs、LC20 和 LC40 处理组酶活力变化趋势相比对照存在较大差异 (图 2)，可能是由于药剂胁迫时间较短，GSTs 被激活参与药剂代谢，随后处于动态调整之中。
高效氯氰菊酯处理后对桃小食心虫成虫的正常求偶行为、交配及繁殖具有一定的抑制作用[7]。本研究采用酶活测定法，发现桃小食心虫雌、雄蛾摄入高效氯氰菊酯后，短期内对其主要代谢酶活性具有不同程度的影响。本研究结果证明桃小食心虫雌、雄蛾个体对高效氯氰菊酯的生理响应机制存在一定的剂量和性别差异，从而更加全面地评价了高效氯氰菊酯亚致死浓度对桃小食心虫成虫酶活性的影响，但不足之处是本研究仅在桃小食心虫抗性水平较低及药剂短期胁迫下对桃小食心虫成虫解毒酶活性变化进行了初探，其具体作用机理及成虫生理生化的变化，有待进一步研究。
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