芒果蒂腐病是世界芒果产地仅次于炭疽病的重要采后病害，可导致芒果果实在贮运期间严重腐烂^[1-2]。可可球二孢 Botryodiplodia theobromae 是引起中国海南省芒果蒂腐病的主要病原菌，其还可危害除芒果以外的多种作物、果树及林木，造成田间及贮藏期病害^[3]。目前，芒果生产上及采后均大量使用苯并咪唑类杀菌剂 (BMZs) 多菌灵及作用机理相似的甲基硫菌灵，以及甾醇脱甲基抑制剂类 (DMIs) 的苯醚甲环唑和咪鲜胺等药剂防治芒果病害。由于芒果蒂腐病病原菌具有潜伏侵染的特性，通常其在田间就已侵入果实，等到芒果软熟时才发病，因此，田间防治芒果病害时大量使用的各种杀菌剂对该病原菌造成了很大的选择压力^[4]，使得其对杀菌剂的抗性日趋严重，并可能导致采后防腐保鲜的失败。胡美姣等^[5]于 2009 年首次报道海南省芒果上的可可球二孢菌株对多菌灵产生了抗性，并指出其抗性水平以高抗为主；2015 年，王萌等^[6]也报道海南省三亚、乐东、昌江等地芒果上的可可球二孢菌株对多种杀菌剂产生了抗药性，其中抗性最为严重的是多菌灵与甲基硫菌灵。表明海南省芒果主产区可可球二孢菌株对苯并咪唑类杀菌剂普遍存在较为严重的抗性。

大量研究表明，很多真菌对苯并咪唑类杀菌剂产生抗性的分子机制均主要是靶标蛋白 β-微管蛋白基因的氨基酸点突变^[7-8]，而且不同抗性菌株之间某些生理特性存在明显差异^[9]。因此，笔者拟针对不同年份海南省芒果可可球二孢菌株对多菌灵的抗性水平变化及其抗性菌株生理适合度展开研究，以期为该病原菌的抗性监测及抗性机制研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 供试材料

1.1.1 试验用果

芒果品种：台农 1 号 (Tainoung No.1)。

病果：于 2016 年 3 月至 5 月在海南省主要芒果产区乐东县、东方市、三亚市及陵水县等 16 个采样地采集发病的芒果，或将外表无症状未软熟的芒果于常温下后熟，选取具有典型蒂腐症状的果实进行病原物的分离。

致病性测定接种用芒果：采自海南省乐东县黄流大学生创业基地果园，选取八成熟外表无任何症状的果实供试。

1.1.2 菌株 采用组织分离法分离得到 139 株可可球二孢 B. theobromae，根据芒果产地与品种进行编号及命名 (表 1)，并按科赫法则确定分离到的可可球二孢为芒果蒂腐病的致病菌，按来源等从中挑选出 90 个菌株进行抗性检测及致病力测定。抗性及敏感菌株生理适合度研究中所用菌株来源于本实验室 2014 年及 2016 年分离保存的芒果可可球二孢。

1.1.3 供试药剂 96.9% 多菌灵 (carbendazim) 原药，海南正业中农高科股份有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 可可球二孢对多菌灵的敏感性测定 采用区分剂量法^[10]测定 90 株可可球二孢对多菌灵的敏感性。用 0.1 mol/L 的盐酸溶解原药，再用 0.1% 的吐温-80 水溶液定容，配制 50 000 mg/L 的多菌灵母液，稀释后加入马铃薯葡萄糖培养基 (PDA) 中， 制成多菌灵质量浓度分别为 1、10 和 100 mg/L 的含药 PDA 平板。以加入等量无菌水的 PDA 培养基为对照。接种不同菌株后置于 28 ℃ 恒温培养箱内培养 36 h，用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。试验重复 3 次。参照 Kim 和马慧霞等的判定标准^[11-12]，以在 1 mg/L 含药平板上不能生长的菌株，或者在 1 mg/L 下能生长、但在 10 mg/L 时不能正常生长 (抑制率 < 50%) 的菌株为敏感菌株 (S)；在 10 mg/L 含药平板上能生长，但在 100 mg/L 下不能正常生长 (抑制率 < 50%) 的菌株为中抗菌株 (MR)；在 100 mg/L 含药平板上能正常生长的菌株为高抗菌株 (HR)。

1.2.2 抗性及敏感菌株适合度比较

1.2.2.1 菌株致病力测定　采用室内离体菌块接种法^[13]，针对已完成抗药性初步检测的 90 个芒果可可球二孢菌株进行致病力测定。菌株于 28 ℃ 培养 4 d 后，在边缘打取直径 5 mm 的菌饼，接种至健康芒果上。每个果实接种 3 点，每处理接种 3 个果实，以接种无菌琼脂块为对照，室温下保湿培养。接种 2 d 后开始检查芒果的发病情况，记录发病率并测量病斑直径大小，按公式 (1) 计算病情指数 (I_d)。

$I_{\rm d} = \frac{{\sum {\left( {s_i \times n_i} \right)} }}{{9N}} \times 100$

(1)

式中，s = 发病级别，n = 相应发病级别的接种点数，i = 病情分级的各个级别，N = 调查的总数目。

参照芒果炭疽病害严重度分级标准^[14]，根据接种点病斑直径 (X) 对病情进行分级：0 级，X = 0；1 级，0 < X ≤ 0.5 cm；3 级，0.5 cm < X ≤ 1.0 cm；5 级，1.0 cm < X ≤ 2.0 cm；7 级，2.0 cm < X ≤ 4.0 cm；9 级，X > 4.0 cm。

参照胡美姣等^[15]的致病力划分标准，按相同时间内病果的病情指数进行划分：强致病力 (HV)，I_d ≥ 70；中等致病力 (MV)，40 ≤ I_d ≤ 69；弱致病力 (WV)，I_d < 40。

1.2.2.2 抗性及敏感菌株菌丝生长及致病力比较　

　取供试的 90 个菌株，挑取纯净菌落制成直径 5 mm 的菌饼，接入 PDA 培养基上，每菌株 3 次重复，于 28 ℃ 培养 36 h 后用十字交叉法测量菌落直径。根据菌株对多菌灵的敏感性，对不同菌株的菌落直径及病情指数进行比较，用 SPSS Statistics 17.0 软件进行单因素方差分析，比较不同抗性水平菌株间菌丝生长能力及致病力的差异。

1.2.2.3 抗性及敏感菌株对渗透压的敏感性测定

　选取 5 个抗性菌株及 7 个敏感菌株进行测定。28 ℃ 培养 48 h 后，于菌落边缘打取直径 5 mm 的菌饼，分别接入到含有不同浓度葡萄糖或氯化钠的 PDA 培养基上，于 28 ℃ 下培养 36 h 后，采用十字交叉法测量菌落直径。试验重复 3 次。葡萄糖质量浓度分别设为：10、40、80、100、150 及 300 g/L，氯化钠分别设为：1.25、2.5、5、10、20 及 40 g/L。对葡萄糖浓度的敏感性测定中以含正常量 (20 g/L) 葡萄糖的 PDA 培养基为对照，对氯化钠浓度的敏感性测定中以不含氯化钠的 PDA 培养基为对照。分别计算菌丝生长抑制率，比较抗性菌株与敏感菌株对高渗透压 (高糖和高盐) 的敏感性，探索抗性产生是否与渗透压相关。

1.2.2.4 抗性及敏感菌株细胞膜透性测定　参照姜莉莉等^[16]的方法。先用去离子水将多菌灵原药稀释成质量浓度分别为 0.5、1、5、10 及 50 mg/L 的溶液。选取 3 株抗性菌株 (HR) JH21617、YCHJ80202、HLTN10402 及 3 株敏感菌株 (S) QP31001、YZTN100601、JSJH10101，分为 3 次测定，每次测定 2 株 (1 个抗性菌株和 1 个敏感菌株)。将菌株于马铃薯葡萄糖液体培养基中、28 ℃、120 r/min 下培养 2~3 d，过滤得到菌丝，用 0.067 mol/L 磷酸缓冲液 (pH = 8.04) 冲洗 1 次，再用去离子水冲洗 2 次。过滤至近干后称取鲜重为 2 g 的菌丝，分别加入盛有系列浓度多菌灵药液的试管中，于 25 ℃ 恒温水浴、120 r/min 下分别振荡培养 0、5、10、20、40、80 min 及 2、3、4、5、6 h 后测定电导率，以菌丝加去离子水的处理为对照，最后经煮沸 (死处理) 后再测定电导率。按公式 (2) 计算相对渗率 (L_r)，用 GraphPad Prism 5 软件处理数据，绘制图表，比较细胞膜的透性。试验重复 3 次。

${L_{\rm r}}/\text{\%} = \frac{{C_t - C_0}}{{C_{\rm{d}}}} \times 100$

(2)

式中：C_t 为 t 时刻的电导率值，C₀ 为初始电导率值，C_d 为死处理后的电导率值。

2 结果与分析 2.1 可可球二孢菌株的分离纯化

分别于 2016 年 3 月和 5 月从海南省芒果主产区 16 个采样地采回 522 个芒果，其中感染芒果蒂腐病的病果为 137 个，发病率为 26.2%；共分离得到 259 个菌株，通过形态鉴定有 139 株为可可球二孢 B. theobromae，检出率为 53.7%。

2.2 可可球二孢菌株对多菌灵的敏感性

针对 90 个菌株进行的敏感性测定中，51 个菌株能在多菌灵质量浓度为 100 mg/L 的含药平板上正常生长，初步判断为高抗性菌株；31 个菌株在 1 mg/L 浓度下生长即被抑制，初步判断为敏感菌株；其余 8 个菌株为中抗菌株 (表 2)。抗性菌株比率为 65.56%，而高抗菌株比率达 56.67%。抗性菌株与芒果的产地及品种间并无明显关联。

2.3 可可球二孢抗性及敏感菌株的适合度

2.3.1 致病力 结果见表 3。90 株可可球二孢中，强致病力菌株 65 株，比例达 72.22%；中等致病力菌株 14 株；弱致病力菌株 11 株。

2.3.2 抗性及敏感菌株菌丝生长能力及致病力比较 SPSS 软件统计分析结果见表 4。在菌丝生长速率方面，敏感菌株与高抗菌株之间存在极显著差异，高抗菌株与中抗菌株间有显著差异，而敏感菌株和中抗菌株间无显著差异；在致病力方面，高抗菌株、中抗菌株和敏感菌株之间均无显著差异。研究表明，菌株抗药性的产生可能有利于其菌丝的生长，但对其致病力没有明显影响。

2.3.3 抗性及敏感菌株生理生化特性

2.3.3.1 抗性及敏感菌株对渗透压的敏感性　从表 5 中可看出：在含不同浓度葡萄糖的 PDA 上，可可球二孢的菌丝生长存在差异。以 20 g/L 的葡萄糖为对照，发现低浓度 (10 g/L) 及高浓度 (80~300 g/L) 时均不利于菌丝生长；但是抗性及敏感菌株之间并没有明显差异，显示抗多菌灵的可可球二孢菌株对葡萄糖渗透压的敏感性并未发生变化。

在含不同浓度氯化钠的 PDA 上，可可球二孢的菌丝生长也存在差异 (表 6)。低浓度 (1.25~5 g/L) 下氯化钠对菌丝生长的影响没有规律性，而高浓度 (10~40 g/L) 下则随浓度增大对菌丝生长的抑制作用更明显，且表现为对抗多菌灵菌株的抑制作用明显高于敏感菌株，即抗性菌株对氯化钠的渗透压更为敏感。

2.3.3.2 抗性及敏感菌株细胞膜透性比较　各菌株的相对渗率变化见图 1。测定时间内，在不同质量浓度多菌灵处理下，6 个菌株的相对渗率均随着多菌灵浓度的增大而降低，且随处理时间的延长而升高。相同多菌灵浓度下，敏感菌株相对渗率的上升速率均快于抗性菌株。其中，敏感菌株 QP31001 与抗性菌株 JH21617 相比，敏感菌株 YZTN10601 与抗性菌株 YCHJ80202 相比，敏感菌株相对渗率均明显高于抗性菌株，表明敏感菌株细胞膜的透性较大，胞内电解质渗出较多。但敏感菌株 JSJH10101 与抗性菌株 HLTN10402 之间差异却不大。

3 结论与讨论

海南省芒果蒂腐病致病菌可可球二孢潜伏期长、发病快、致病力强，给当地芒果生产造成了很大的危害。从试验结果看，可可球二孢在海南省各芒果产区均有分布，发病率高、致病力强，且对多菌灵已产生较为严重的抗性。2014 年本课题组共分离获得 132 株致病菌，其中 124 株为芒果可可球二孢，分离率达 93.94%，强致病力菌株占 28.23%^[17]；2016 年分离得到 259 个菌株，139 株为可可球二孢，分离率为 53.67%，且强致病力菌株比例高达 72.22%。2014 年测得该菌对多菌灵的抗性频率达 90.14%^[6]，本研究测得的抗性频率为 65.56%，抗性频率较 2014 年有所降低。强致病力菌株及抗性频率在不同年份上的差异，可能与不同年份多菌灵等杀菌剂用量及芒果蒂腐病的发生率等有关，因此，相关研究需要长期的跟踪检测。本研究表明，海南省芒果可可球二孢对多菌灵的抗药性普遍且比较严重，同时来自不同产区菌株的抗性差异不大，这可能与该地芒果产区普遍长期频繁施用苯并咪唑类杀菌剂有密切关系。

有些研究发现，病原菌产生抗药性后，抗性菌株的适合度会降低，如致病力降低、生长速率下降及竞争力减弱等^[18-19]。而本研究中，高抗多菌灵的芒果可可球二孢菌株菌丝生长能力均强于敏感菌株，且致病力亦无明显差异，说明该菌株在产生抗药性后并不存在适合度降低的现象，因此其抗性风险较高。此外，大量研究表明，病原菌对药剂产生抗药性主要存在 3 种机理，分别是药剂吸收减少及排出增加、解毒代谢增强、药剂靶标位点亲和力降低^[20-21]。其中前两种抗性机理均可能伴随着菌株体内生理生化特性的转变。本研究中，芒果可可球二孢抗性及敏感菌株对低渗透压均不敏感，在较高的氯化钠浓度下，抗性菌株较敏感菌株对渗透压更为敏感。抗性及敏感菌株在细胞膜透性上表现出明显差异，敏感菌株的相对渗率明显高于抗性菌株，说明敏感菌株的细胞膜透性高于抗性菌株；而抗性菌株相对渗率随时间变化的幅度小于敏感菌株，说明抗性菌株的抗逆性明显强于敏感菌株，也表明其适合度较高，比敏感菌株具有更强的竞争力。夏晓明^[22]等在研究禾谷丝核菌时发现，抗性菌株相对渗率在短时间内高于敏感菌株，但随着时间延长，敏感菌株的相对渗率会高于抗性菌株，说明抗性菌株细胞膜受损程度相对较小，细胞膜透性低于敏感菌株，本研究结果与之相似。但本研究中抗性菌株的相对渗率及细胞膜透性均高于敏感菌株，这与陈夕军等^[23]和姜莉莉等^[16]的研究结果相反。表明抗性及敏感菌株与细胞膜透性的关系，在不同病原菌及不同药剂间均存在差异。因此，海南芒果可可球二孢对多菌灵的抗性机制是否与细胞膜透性有关，还需通过对大量菌株的试验验证。