2017, Vol. 19
2. 佛山市环境健康与安全评价研究中心，广东 佛山 528000
, CHEN Qiuchu1,2, GUAN Liping1, JIA Penglong1, GUO Yaoquan1, TANG Jianbo1, ZHANG Hongtao1,2
2. Foshan Center for Environmental Health and Safety Assessment, Foshan 528000, Guangdong Province, China
甲嘧磺隆 ( Sheme 1a) 属于磺酰脲类除草剂，具有广谱、活性高和灭生性强等特性[1]，主要用于防治非耕地的一年生和多年生禾本科杂草和阔叶杂草[2]。甲嘧磺隆的作用机理是通过抑制乙酰乳酸合成酶，阻碍支链氨基酸 (缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸) 的生物合成[3]，可作为叶面处理剂也可作为土壤处理剂使用，其药效长且对哺乳动物安全。甲嘧磺隆对水生和陆生生物毒性低[4]。甲嘧磺隆在土壤中具有较强的移动性[5]，主要通过水解和微生物降解作用而消失[4, 6]，但由于其不易挥发，热稳定性强，在土壤中残留期较长，因此研究其对土壤生态系统的影响尤为重要。
炔草酯 ( Sheme 1b) 是一类芳氧苯氧丙酸酯类除草剂，对恶性禾本科杂草如鼠尾草 (Salvia officinalis)、看麦娘 (Alopecurus aequalis)、野燕麦 (Avena fatua)、黑麦草 (Lolium perenne)、早熟禾 (Poa annua) 和狗尾草 (Setaria geniculata) 等有优异的防效[7]。近年来，炔草酯每年在全球的销售额超过 1 亿美元[8]。炔草酯的作用机理是通过抑制植物体内的乙酰辅酶A羧化酶的活性，使植物的脂肪酸合成受阻，最终导致植物死亡[9]，主要作为苗后茎叶处理剂使用。根据美国环境保护署 (United States Environmental Protection Agency, EPA) 数据，炔草酯可引起哺乳动物 (如大鼠、小鼠、兔子等) 肝细胞肥大、坏死和胸腺萎缩[10]。美国环保署癌症评估审查委员会 (Cancer Assessment Review Committee，CARC) 基于对雄性大鼠前列腺癌和雌性大鼠的卵巢癌，以及雌雄小鼠肝癌等方面的研究，已将炔草酯归类为“可能会对人类致癌的物质”[8]。炔草酯对水生生物毒性较高，对陆生生物毒性较低[11]。炔草酯在土壤中能够迅速降解，不同类型土壤中其降解半衰期为 0.8~3.44 d，主要降解产物为炔草酸，同样具有除草活性[11-12]。
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图式 1 |
研究表明，除草剂在水稻田中使用时，至少有 70% 进入土壤[13]，土壤是主要的生态受体，直接影响微生物的数量、生化活性及功能多样性等。土壤中存在多种对污染物敏感的微生物种群，其数量、功能和多样性等的变化均能够指示土壤环境受污染的程度[14]。土壤微生物作为指示土壤污染的敏感标志物，已被国际标准化组织 (International Organization for Standardization, ISO)、经济合作与发展组织 (Organization for Economic Cooperation and Development, OECD) 和中国标准化管理机构作为化学品或农药登记管理的重要环境影响指标[15-20]。土壤微生物呼吸强度是反映土壤微生物代谢活性的重要参数，氮转化可评估农药或化学品对土壤微生物区系的影响，其两者的动态变化直接反映了土壤生态系统功能的变化[21]。甲嘧磺隆和炔草酯作为有效防治禾本科杂草的除草剂，作用机理不同，导致对土壤微生物的生态效应也会有所差异。目前，尚未见关于甲嘧磺隆和炔草酯对土壤微生物呼吸强度和氮转化影响的研究，鉴于此，本研究以呼吸强度和氮转化作为评价指标，对这两种除草剂进行生态毒理学试验并进行毒性评估，旨在通过揭示被两种除草剂污染的土壤中氮的消长和呼吸的动态变化，了解两种除草剂污染土壤的生态效应，同时为两种除草剂的土壤生态毒性学和环境风险评估提供基础数据。
1 材料和方法 1.1 供试土壤及处理供试 3 种类型的土壤分别为：1) 红壤，采自湖南省衡阳市祁东县双桥镇 (N：26°78′，E：112°12′)；2) 棕壤，采自山东农业大学校内 (N：36°19′，E：117°12′)；3) 潮土，采自河北省科学院院内 (N：38°03′，E：114°45′)。供试土壤未受过农药污染，其理化性质见表 1。
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表 1 三种供试土壤理化性质 Table 1 The physical and chemical properties of the tested soils |
土壤样品采自 0~20 cm 表层，去除石块、植物根系等杂质后过 2 mm 筛，一部分新鲜土壤置于无菌密封袋，于 4 ℃ 保存，用于微生物二氧化碳释放量和氮转化指标测定；另一部分土壤样品经风干，用于土壤理化性质分析。
1.2 供试材料1.2.1 药剂和试剂 甲嘧磺隆 (sulfometuron methyl) 原药 (纯度 98%。江苏瑞东农药有限公司)；炔草酯 (clodinafop-propargyl) 原药 (纯度 97%，江苏富田农化有限公司)；1 000 μg/mL 硝酸根标准溶液 (广州奥谱析实验设备有限公司)；其余试剂均为市售分析纯。
石英砂 (胜利石英砂厂，粒径为 178 μm)；苜蓿粉 (绍兴上虞万事达麦业有限公司，总碳含量为 45%，总氮含量为 3.0%，碳氮比为 15/1)。
1.2.2 主要仪器 Titrette 电子滴定仪 (BRAND GMBH + CO KG)；MGC-350HP-2 智能人工气候箱 (上海一恒科学仪器有限公司)；UV-3802H 紫外分光光度计[尤尼柯 (上海) 仪器有限公司]；TGL-16B 高速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂)；DHZ-032LR 大型冷冻光照数控恒温摇床 (上海申能博彩生物科技有限公司)；HKG-9055A 电热恒温鼓风干燥箱 (广东环凯微生物科技有限公司) 等。
1.3 试验设计1.3.1 土壤样品的预培养 经过贮存的土壤试验前需要进行预培养，以恢复微生物活性。
1.3.1.1 二氧化碳吸收法测定用的土壤预培养 将 50 g 土壤 (干重) 与 1 g 葡萄糖混匀；测得红壤混合样本的有机碳含量为 0.91%，棕壤的为 0.82%，潮土的为 1.06%；用去离子水调节土壤含水量为最大持水量的 40%~60% 之间，于 (25 ± 1) ℃ 恒温培养箱中避光培养 7 d，备用。
1.3.1.2 氮转化法测定用的土壤预培养 将土壤和苜蓿粉混匀，用去离子水调节土壤含水量为最大持水量的 40%~60% 之间，于 (20 ± 2) ℃恒温培养箱中避光培养 2 d，备用。
1.3.2 土壤微生物呼吸强度的测定 参照二氧化碳吸收法[20]进行。每种土壤设 3 个浓度水平的药剂处理，以模拟在使用农药添加水平为常用剂量、10 倍常用剂量和 100 倍常用剂量后在土壤表层 10 cm 土壤中的农药含量 (计算时假设土壤容重为 1.5 g/cm3)，同时设不添加农药的空白和溶剂对照组。3 次重复。甲嘧磺隆的添加水平分别为 (有效成分) 0.5、5 和 50 mg/kg，炔草酯的分别为 (有效成分) 0.04、0.4 和 4 mg/kg。两种农药均用丙酮溶解，包埋石英砂，待溶剂挥发后，将石英砂和土壤混匀，用去离子水调节土壤含水量至最大持水量的 40%~60% 之间，与另一个装有 50 mL 氢氧化钠吸收液的烧杯一起置于 2 L 标本瓶中，用凡士林封口，于 (25 ± 1) ℃ 恒温培养箱中避光培养。分别于 1、2、4、7、11 和 15 d 取出，用 0.2 mol/L 的盐酸标准溶液滴定剩余的氢氧化钠，同时更换标本瓶内的吸收液后继续培养。
1.3.3 土壤微生物氮转化的测定 参照氮转化法[15, 20]进行。根据低浓度应至少能反映实际条件下能到达土壤的最大量 (计算时假定供试物与 5 cm 的土壤均匀混合，且土壤容重为 1.5 g/cm3) 及高浓度应是低浓度倍数的原则，设置田间推荐高剂量和 5 倍推荐高剂量两个浓度处理，1 次性施入土壤。同时设置不含农药的空白和溶剂对照组，每组 3 个重复，每个重复每次取 6 个样品分析。甲嘧磺隆 (有效成分) 的添加水平分别为 1 和 5 mg/kg，炔草酯的分别为 (有效成分) 0.08 和 0.4 mg/kg。土壤和含农药的石英砂混合均匀后，用去离子水调节含水量至土壤最大持水量的 40%~60% 之间，于 (20 ± 2) ℃ 恒温培养箱中避光培养。
氮转化试验至少持续 28 d，如果第 28 天时处理组与对照组硝酸盐形成速率的差异大于 25%，则需要延长培养时间，直至该差异等于或小于 25%，但最长不超过 100 d[15, 20]。分别于 0、7、14 和 28 d 取样分析。如果需要延长培养时间，则应在 28 d 后每隔 14 d 取样测定 1 次硝酸盐含量。本研究中甲嘧磺隆对潮土微生物的氮转化试验持续了 70 d，炔草酯持续了 42 d。培养期间，用称重法定时测定土壤湿度，土壤湿度变化范围控制在 ± 5%。
1.3.4 土壤理化性质测定 参考文献[22-24]。土壤硝酸盐含量测定采用酚二磺酸比色法；土壤含水量测定采用烘干法；土壤 pH 值测定采用电位法；土壤有机碳含量测定采用重铬酸钾氧化-外加热法；土壤机械组成测定采用密度计法；土壤阳离子交换量测定采用乙酸铵交换法和氯化铵–乙酸铵交换法；土壤全氮测定采用半微量凯氏法；土壤水解性氮测定采用碱解-扩散法；土壤最大持水量的测定采用环刀法；土壤微生物量碳测定采用氯仿熏蒸法。
1.4 数据统计与分析利用 Excel 对试验数据进行处理，运用 SPSS 20.0 软件 (SPSS Inc.) 进行方差分析和回归分析，采用 Duncan’s 检验进行差异显著性分析，P < 0.05 表示差异显著。
1.5 评价方法二氧化碳吸收法中，当土壤中农药加入量为常用剂量，在 15 d 内对土壤微生物呼吸强度抑制达 50% 时则为高毒；农药加入量为常用剂量的 10 倍，能达到上述抑制水平的，划分为中毒；当农药加入量为常用剂量的 100 倍，能达到上述抑制水平的，划分为低毒；如果 3 种处理均未达到上述抑制水平，则同样划分为低毒[20]。
氮转化法中，在试验 28 d 后的任何时间所取样品，测定其低浓度处理组和对照组的硝酸盐形成速率的差异不大于 25%，则认为该农药对土壤中的氮转化没有长期影响[15, 20]。
2 结果与分析 2.1 甲嘧磺隆对土壤微生物呼吸强度的影响甲嘧磺隆施入红壤、棕壤和潮土 15 d 后，对土壤微生物呼吸强度均表现为低毒，但影响各不相同 (图 1)。在供试期内，各处理对红壤微生物二氧化碳释放量的影响均表现为先升高后下降的趋势，且处理与对照间无显著性差异 (图 1A)。
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图 1 甲嘧磺隆对不同类型土壤中微生物二氧化碳释放量的影响 Fig. 1 Effect of sulfometuron methyl on different typical soil carbon dioxide emission |
甲嘧磺隆施入棕壤 4 d，与对照组相比，0.5 mg/kg 处理组对微生物二氧化碳释放量表现出显著促进作用，促进率达 63.8%。5 和 50 mg/kg 处理组于第 7 天时二氧化碳的释放量显著高于对照组。试验结束时，3 个处理组的呼吸强度抑制率由低浓度到高浓度处理组依次为 35.3%、21.4% 和 26.9%。0.5 mg/kg 处理组微生物的呼吸强度被显著抑制，其余两组与对照组相比无显著变化 (图 1B)。已有研究表明，三氮苯类除草剂氰草津在 100 μg/g 时对土壤微生物呼吸强度有明显的抑制作用[25]。本研究与其结果吻合。因此推测可能是土壤微生物类群对不同浓度的甲嘧磺隆具有各自不同的反应，但还有待于进一步验证。
甲嘧磺隆对潮土中微生物的二氧化碳释放量表现出促进作用。其中，0.5 和 5 mg/kg 处理的二氧化碳释放量于试验开始后第 4 天至试验结束，均显著高于对照组，而 50 mg/kg 处理组于 15 d 时显著高于对照组。试验结束时，3 个处理组的呼吸强度均表现为促进作用，其促进率由低浓度到高浓度处理组依次为 17.6%、20.1% 和 19.6% (图 1C)。这一结论与盛宇等[26]对同为磺酰脲类除草剂的氯嘧磺隆的研究结果一致。研究表明，土壤中存在对甲嘧磺隆的降解微生物，如睾丸酮从毛单胞菌和食酸丛毛胞菌等[6]。潮土微生物呼吸强度的促进作用可能是甲嘧磺隆作为外源营养物质被微生物利用。
2.2 炔草酯对土壤微生物呼吸强度的影响如图 2A 所示，施用炔草酯后，红壤中微生物二氧化碳的释放量呈逐渐升高的趋势。试验开始后第 4 天，4 mg/kg 处理组的二氧化碳释放量显著高于对照组，呼吸强度促进率达到 67.8%。试验结束时，各处理组的二氧化碳释放量均低于对照组，但未达到显著水平，其呼吸强度抑制率由低浓度到高浓度处理组依次为 21.8%、12.4% 和 2.67%。棕壤中微生物二氧化碳释放量呈逐渐下降趋势。处理组的呼吸强度与对照组相比表现出抑制作用，但未达显著性差异。试验结束时，其呼吸强度抑制率由低浓度到高浓度处理组的抑制率分别为 13.0%、9.76% 和 6.64% (图 2B)。潮土也表现出类似的规律，但整个试验期间，对照组和处理组间没有显著性差异 (图 2C) 。
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图 2 炔草酯对不同类型土壤中微生物二氧化碳释放量的影响 Fig. 2 Effect of clodinafop-propargyl on different typical soil carbon dioxide emission |
综上所述，不同浓度的炔草酯施入红壤、棕壤和潮土 3 种土壤 15 d 后，3 个处理组的呼吸强度抑制率均低于 50%，可判定对呼吸强度为低毒。但是，抑制作用的存在表明炔草酯的施入对红壤和棕壤中微生物群落的正常代谢带来了负面影响。
2.3 甲嘧磺隆对潮土中微生物氮转化的影响不同浓度甲嘧磺隆施入土壤后，对氮转化速率和土壤硝酸盐含量的影响如表 2 和图 3 所示。两个处理组硝酸盐形成速率在 0~42 d 均高于对照组，但试验结束时，低浓度组氮转化速率低于对照组，抑制率为 23.2%，由此可判定甲嘧磺隆低浓度处理对土壤中的氮转化没有长期有害影响。从土壤微生物中硝酸盐含量看，随着暴露时间的延长，处理组和对照组硝酸盐含量均呈逐渐上升的趋势。从 7 d 开始至试验结束，两个处理组的硝酸盐含量均显著高于对照组，并且 5 mg/kg 处理组的硝酸盐含量高于 1 mg/kg 处理组。Kara 等[27]研究发现，除草剂 Topogard 50 处理的两种微碱性土壤中，硝化作用被激活可能与除草剂的持续作用有关，当除草剂被降解时硝化作用被激活。由此推测，本研究中的硝酸盐含量显著高于对照组可能是由于甲嘧磺隆被微生物降解，最终作为碳源或者氮源等外源营养物质进行代谢和繁殖。然而，土壤中硝酸盐含量的增加可能会增加农业系统氮损失的风险[28]。
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表 2 甲嘧磺隆对潮土中微生物硝酸盐形成速率的影响 Table 2 Effect of sulfometuron methyl on soil nitrate formation rate |
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图 3 甲嘧磺隆对潮土中微生物硝酸盐含量的影响 Fig. 3 Effect of sulfometuron methyl on soil nitrate contents |
2.4 炔草酯对潮土中微生物氮转化的影响
由表 3 可知，以田间推荐最高剂量及 5 倍田间推荐最高剂量的炔草酯处理土壤 42 d 后，低浓度处理组土壤微生物硝酸盐的形成速率略低于对照组，抑制率为 8.55%，因此可判定该农药对土壤中的氮转化没有长期有害影响。炔草酯对微生物硝酸盐含量的影响如图 4 所示。随着暴露时间的延长，处理组和对照组的硝酸盐含量均呈逐渐上升的趋势。0.08 mg/kg 处理组硝酸盐含量于试验 28 d 时显著高于对照组；但试验结束时，两个处理组的硝酸盐含量与对照组均没有显著性差异。结合 15 d 炔草酯对潮土微生物二氧化碳释放量与对照组无明显差异的结论，推测炔草酯对土壤微生物的呼吸作用和氮转化无显著性影响可能与其降解速度快有关。炔草酯在土壤中能够迅速降解，在有氧条件下的半衰期为 0.8~3.44 d，降解的主要产物为 2-甲氧基-3-氟-5-氯吡啶和游离的炔草酸[11, 29]，有关这两种物质对土壤微生物的呼吸强度和氮转化的研究尚未见报道。由本研究结果可推测这两种转化产物对微生物的呼吸强度和氮转化无明显有害影响。
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表 3 炔草酯对潮土中微生物硝酸盐形成速率的影响 Table 3 Effect of clodinafop-propargyl on soil nitrate formation rate |
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图 4 炔草酯对潮土中微生物硝酸盐含量的影响 Fig. 4 Effect of clodinafop-propargyl on soil nitrate contents |
3 结论与讨论
本研究以土壤微生物的呼吸强度和氮转化作为检测指标，考察了甲嘧磺隆和炔草酯对土壤微生物的毒性效应。结果表明：甲嘧磺隆和炔草酯以田间推荐剂量、10 倍量和 100 倍量施入土壤后，对红壤、棕壤和潮土微生物的呼吸强度的毒性作用总体上表现为低毒。15 d 试验结束时，甲嘧磺隆和炔草酯对棕壤中微生物呼吸强度表现为抑制作用，对潮土中微生物的呼吸强度表现为促进作用。对于红壤微生物的呼吸强度，甲嘧磺隆不同浓度处理表现出不同的作用效果，而炔草酯各处理均表现为抑制作用。两种除草剂对 3 种土壤微生物表现出的毒性效应由高到低为棕壤 > 红壤 > 潮土。已有研究表明，土壤有机质可以通过吸附有机污染物来降低其生物有效性，最终降低生态毒性 [30]。在土壤有机质含量高的土壤中，微生物数量多，种类丰富，土壤生态系统的抗逆性会更强[14]。本研究中，红壤、棕壤和潮土分别是中国南方和北方代表性的农田土壤，理化性质各异，其中潮土有机质含量最高，红壤次之，棕壤最低。甲嘧磺隆和炔草酯施入后，对潮土的毒性作用低于红壤和棕壤，可能是由于潮土有机质高于红壤和棕壤，对两种除草剂有更强的吸附能力，更能降低农药对微生物的毒性效应。该结论与程金金等[31]的研究一致。综上所述，土壤有机质含量的高低可能是甲嘧磺隆和炔草酯对土壤微生物呼吸强度影响的重要因素。有关两者之间的作用机理还需要进一步研究。
本研究中，两种除草剂对潮土氮转化没有长期有害影响。甲嘧磺隆和炔草酯对潮土中微生物的氮转化表现出不同的生态毒性效应。甲嘧磺隆表现为显著促进作用，可能是由于甲嘧磺隆作为碳源或氮源等外源营养物质被微生物降解来进行代谢和繁殖。研究表明，土壤微生物中氮代谢与碳代谢密切相关[32]。甲嘧磺隆施入土壤 15 d 后，能显著提高潮土二氧化碳释放量与硝酸盐含量并显著高于对照组的结果相互印证，表明甲嘧磺隆能够刺激土壤微生物的氮代谢和碳代谢，虽然没有造成有害影响，但甲嘧磺隆的施入已经对土壤微生物群落的正常代谢、功能等产生影响。炔草酯施入潮土后，其微生物的硝酸盐含量和二氧化碳释放量无显著性变化，推测处理组和对照组的产氮量和碳降解途径未受到影响，功能正常，也可能是代谢产物对微生物的呼吸强度和氮转化无明显有害影响。
综上所述，甲嘧磺隆和炔草酯对土壤微生物的毒性作用受土壤性质的影响，对其呼吸强度和氮转化均没有长期有害影响，但对呼吸强度和氮转化表现出的抑制或促进作用，已对土壤微生物的正常代谢和功能造成了影响。因此建议延长培养试验，结合农药降解和转化产物浓度分析，观察土壤微生物的长期影响，同时开展两种除草剂对土壤微生物影响的其他指标的测定如微生物类群、呼吸熵、微生物量、微生物功能多样性等，并结合农药的降解数据，以期更加全面、系统和准确地评估甲嘧磺隆和炔草酯对土壤微生物的毒性效应。
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