饲草主要是指供草食家畜食用的草本植物饲料，是畜牧业发展的重要基础和保障，主要包括干草料和青贮料，干草料是指青草或栽培青绿饲料在结实前的生长植株地上部分经一定干燥方法制成的粗饲料；青贮料是指由含水分多的植物性饲料经过密封、发酵而成的饲料。饲草在生长过程中容易受到农药污染。一方面是施用农药在饲草原料上的直接污染，如李梅等^[1]研究发现，在甜玉米上施用氯氰菊酯，收获后3 d在秸秆中的残留量仍达0.041 7~0.218 3 mg/kg；另一方面是从被污染的环境中吸收^[2]，如王晓娜^[3]对蒙、晋、津、京等地青贮料的质量安全情况进行调查发现，不同地区饲草中存在大量有机磷农药污染，李世俊等^[4]也在云南的奶牛饲草中检出农药残留，其中甲胺磷、马拉硫磷、倍硫磷的平均残留量分别为0.006~0.158、0.025~0.264和0.004~0.175 mg/kg。研究发现，饲草中的农药残留不仅能在畜禽体内蓄积，还能迁移到畜乳中^[5-6]，直接影响到肉、蛋、奶的质量，对人体健康构成威胁。因此，开展快速准确的检测技术研究，对监管饲草中农药残留状况、促进畜牧业发展意义重大。

与传统的前处理方法相比，QuEChERS方法能节省大约95%的溶剂，95%的耗材成本，以及90%的时间^[7]，大大提高了检测效率。目前已有采用QuEChERS进行前处理，色谱-串联质谱法检测饲草原料上农药残留的研究报道。陈武瑛等^[8]采用QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定了玉米秸秆中的莠去津残留；郭立群等^[9]采用相同方法测定了玉米秸秆中的烟嘧磺隆、莠去津及氯氟吡氧乙酸残留；李敏洁等^[10]采用QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定了花生植株中的噻虫啉残留等。但以上检测方法检测目标农药品种相对单一，且针对饲草产品如干草料、青贮料中多农药残留的检测尚未见报道。为此，本研究针对饲草产品的不同基质，以研究报道中检出浓度和现实生产中使用率较高的10种农药为目标，采用QuEChERS结合气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)，拟建立一种简单、快速、灵敏、准确的检测方法，以便用于大批量饲草的农药残留检测，及时掌握饲草中的农药残留状况，为畜牧业的健康发展提供技术支持。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 主要仪器

Agilent 7890B/7010气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(美国Agilent公司)，带有7693自动进样器；BSA224S-CW电子天平(德国Sartorius公司)；T18匀浆机(德国IKA公司)；MS3漩涡振荡器(德国IKA公司)；3K30高速冷冻离心机(德国SIGMA公司)；N-EVAP112氮吹仪(美国Organomation公司)；Milli-Q Reference超纯水系统(德国Merck公司)。

1.1.2 药剂与试剂

敌敌畏(dichlorvos)、乙酰甲胺磷(acephate)、乐果(dimethoate)、莠去津(atrazine)、乙草胺(acetochlor)、马拉硫磷(malathion)、倍硫磷(fenthion)、毒死蜱(chlorpyrifos)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)，以上农药标准品均购自农业部环境保护科研监测所，纯度均为100 μg/mL。无水MgSO₄、N-丙基乙二胺(PSA)、C₁₈、石墨化碳黑(GCB)(美国Agilent公司)；乙腈、乙酸乙酯为色谱纯(美国Thermo Fisher Scientific公司)；其他试剂为分析纯；超纯水由超纯水系统制备。

1.1.3 供试样品

供试青贮料和干草料样品取自山东省草种生产经营企业、饲草生产经营企业、国家“青贮玉米”示范场、“粮改饲”示范场及牛羊规模养殖场。其中，青贮料以玉米全株、玉米秸秆为主，干草料以干玉米秸秆、花生秧、苜蓿、羊草为主。依据《饲草产品抽样技术规程》^[11]采样后粉碎，于-18 ℃下保存，备用。

1.2 试验方法 1.2.1 样品的提取和净化

准确称取饲草样品2.0 g于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，先加入10 mL饱和氯化钠溶液浸泡10~15 min，再加入20 mL乙腈匀浆提取1 min，于4 000 r/min下离心3 min；取10 mL上清液转移至盛有600 mg无水MgSO₄、200 mg PSA、200 mg C₁₈和20 mg GCB吸附剂的离心管中，漩涡振荡30 s，于4 000 r/min下离心3 min；取2 mL上清液用氮气吹至近干，用乙酸乙酯定容至1 mL，待GC-MS/MS检测分析。

1.2.2 检测条件 1.2.2.1 色谱条件

不分流进样，进样量1 μL；进样口温度280 ℃；HB-5MS色谱柱(30 m × 250 μm，0.25 μm)，载气为高纯He，流速1.0 mL/min；程序升温至90 ℃，以80 ℃/min升至170 ℃，以10 ℃/min升至240 ℃，再以80 ℃/min升至300 ℃，保持6.25 min；MSD传输线温度280 ℃。

1.2.2.2 质谱条件

溶剂延迟2 min；电子轰击(EI) 离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃；多反应监测模式(MRM)；四极杆MS1和MS2温度均为150 ℃；碰撞池淬灭气(He) 2.25 mL/min，碰撞气(N₂) 1.5 mL/min。10种农药的保留时间及质谱参数见表 1。

1.2.3 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

分别量取一定量的农药标准品于100 mL容量瓶中，用丙酮稀释配成1 mg/L的混合标准储备液，于-18 ℃贮存，备用。试验时，用乙酸乙酯逐级稀释，配成1、2、5、10、50、100和200 μg/L的系列溶剂标准溶液；用基质空白溶液逐级稀释，配成1、2、5、10、50、100和200 μg/L的系列基质匹配标准溶液。

取基质匹配标准溶液与溶剂标准溶液，分别按1.2.2节的条件测定，以质量浓度为横坐标(x)，相应的峰面积为纵坐标(y)，分别绘制基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线。

1.3 基质效应

采用纯溶剂、青贮料和干草料基质分别绘制10种目标农药的标准曲线，并对基质效应(matrix effect，ME) 进行评价。根据公式(1) 评价基质效应^[12-14]。

$ {\rm ME}=\left( {\frac{{{K_{\rm x}}}}{{{K_0}}} - 1} \right) \times 100\% $

(1)

其中，K_x是基质匹配标准曲线的斜率，K₀是纯溶剂标准曲线的斜率。当ME为负值时存在基质抑制效应，为正值时存在基质增强效应，绝对值越大基质效应越强^[12-14]。干草料以苜蓿干草、青贮料以玉米全株为例，评价其基质效应。

2 结果与讨论 2.1 标准曲线、检出限与定量限

按1.2.3节配制的基质匹配标准溶液，用GC-MS/MS测定后绘制标准曲线，得到线性回归方程，相关系数r为0.995 1~0.999 9，表明各目标农药线性关系良好。10种农药的检出限(LOD) 为0.001 5~0.015 mg/kg，定量限(LOQ) 为0.005~0.05 mg/kg (表 2)。

查询国内外相关农药在饲草料上的MRL值可知^[15]，日本规定乐果在田生玉米草料中的为1 mg/kg，干草中的为2 mg/kg；马拉硫磷在田生玉米草料中的为8 mg/kg，干草中的为270 mg/kg；溴氰菊酯在田生玉米草料中的为0.7 mg/kg。美国规定乙草胺在饲草中的为1.3 mg/kg，干草中的为3.5 mg/kg；氯氰菊酯在饲草中的为8 mg/kg，干草中的为40 mg/kg。中国规定毒死蜱在玉米饲料中的为10 mg/kg，苜蓿饲料中的为5 mg/kg。目前，国内外尚未制定敌敌畏、乙酰甲胺磷、莠去津和倍硫磷在饲草中的MRL值。本方法检出限、定量限远远低于已有相关的MRL值，能够满足检测要求。

2.2 方法的准确度与精密度

在空白饲草样品中添加3个水平的农药混合标准溶液，进行添加回收试验，重复5次，干草料以苜蓿草、青贮料以玉米全株为例，结果见表 3。各目标农药的平均回收率为75%~110%，相对标准偏差(RSD) 为1.7%~11.6%，符合残留检测有关标准和法规的要求^[16]。

2.3 QuEChERS样品前处理方法 2.3.1 提取溶剂的选择

采用QuEChERS方法并加以改进：在用乙腈匀浆提取前，加入饱和氯化钠溶液浸泡10~15 min；净化后采取溶剂置换法，用乙酸乙酯浓缩定容。由表 3可知，改进后的前处理方法回收率为75%~110%，满足农药残留检测要求。

饲草，尤其是干草料样品中水分含量较低，加入水溶液可加大均质样品的分散程度，提高其比表面积，使溶剂与样品发生更多接触；同时乙腈与水互溶，也增加了其渗透性，提取效果更佳^[7]；而使用饱和氯化钠溶液，则更有利于水与乙腈的分层。

为了防止乙腈在气相色谱柱导致柱流失及溶剂峰拖尾和色谱峰裂分^[17]，采取了溶剂置换法，即乙腈提取液用氮气吹至近干后，用乙酸乙酯复溶进样。

2.3.2 净化填料的选择

采用QuEChERS方法基质分散萃取的净化方式。即取待净化液于预装有600 mg无水MgSO₄、200 mg PSA、200 mg C₁₈、20 mg GCB吸附剂组合的离心管中，漩涡振荡30 s。净化后，萃取液澄清，在GC-MS/MS上的背景噪声也显著降低；同时，由表 3可知，回收率并未因净化过程而降低至70%以下，净化效果令人满意。

饲草中基质成分复杂，以青贮料为例，经检测含有2%~5%的有机酸、0.5%~1.0%的粗脂肪，并且含有色素等大分子杂质。在提取过程中，乙腈在充分提取各种目标农药的同时，不可避免地提取出各种杂质。PSA可以去除极性有机酸、脂类和糖类，C₁₈可以去除脂类和固醇类，PSA与C₁₈一起添加除脂效果更好，而且不会造成目标农药的损失^[7]；GCB可去除叶绿素、类胡萝卜素等大分子杂质，但某些平面环状结构的农药会被其吸附，造成回收率的损失^[7]，所以仅作少量添加；而加入无水MgSO₄是为了把有机层中的水分从7%降到2%，有助于PSA的净化以及减少进入GC系统中的水分^[7]。

2.4 质谱条件的选择

采用MRM模式进行测定分析(表 1)。每种农药选择2~4对特征离子对和碰撞能量，保证了检测方法的定性准确度；MRM监测过程分为4个时间段，调整驻留时间，使扫描频率达到7.7~8.0 Hz以满足定量的需求；定量时选择丰度比较高的双定量离子对，相比单定量离子对灵敏度大幅提升。

特征离子对以及相应的碰撞能量、丰度比是串联质谱提供的定性依据，数量越多越准确。选择2~4对特征离子对，结合色谱分离的保留时间，大大降低了假阳性的可能。图 1为10种目标农药的选择离子流图，通过提取选择离子对，对每种农药实现准确判定，很好地避免了杂质干扰。

在扫描周期中，特征离子对总数越少，驻留时间越长，响应值越高，方法越灵敏，但其扫描频率越低，峰面积计算时点数越少，误差越大。将扫描过程分为4个时间段可以减少每段内特征离子对总数；调整驻留时间，使每段的扫描频率达到7.7~8.0 Hz，可以保证目标农药的出峰至少有25~30个响应点，确保峰面积计算准确、稳定。

定量计算时，通常以丰度最大的特征离子对的峰面积作为依据。采用双定量离子对加和的方式，与单定量离子对相比，数据重复性、线性相关性均略微提高；同时，响应信号叠加使峰面积增加20%~95%，而噪声的不规则叠加造成一定程度的噪声消除，因此基线上升、信噪比增大，使灵敏度大幅提升。

2.5 基质效应

结果(表 2) 显示：10种农药在青贮料和干草料基质中均表现为基质增强效应，且青贮料略强于干草料；乙酰甲胺磷、氯氰菊酯和溴氰菊酯受到的基质增强效应明显。为了有效减小基质效应，本研究中除了优化样品前处理方法、保证目标农药在色谱柱的有效分离，还采用了基质匹配标准溶液作为定量计算的依据。

2.6 实际样品测定

采用本研究建立的方法，对中国山东省抽取的100批次饲草样品进行测定，其中青贮料和干草料各50批次。共检出8种农药(表 4)。其中，毒死蜱的检出率较高，参照中国制定的毒死蜱在饲草中的MRL值，受检饲草料的毒死蜱残留不超标。参照美国和日本制定的MRL值，乐果、乙草胺、马拉硫磷、氯氰菊酯和溴氰菊酯在受检饲草中的残留不超标。莠去津和倍硫磷在青贮料和干草料的检出率为2%~4%，残留量在0.032~0.187 mg/kg之间，目前国内外尚未制定莠去津和倍硫磷在饲草上的MRL值来评价其残留水平的安全性。

3 结论

本研究通过优化QuEChERS的提取、净化方法和GC-MS/MS的分离、MRM参数，建立了同时检测饲草中10种农药残留的方法。该方法简单、快速、灵敏、准确，能够满足大批量饲草的农药残留检测的需要。