2017, Vol. 19
2. 辽宁省生物农药工程技术研究中心, 沈阳 110866
2. Engineering & Technological Research Center of Biopesticide, Shenyang 110866, China
昆虫病原线虫共生菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌，属肠杆菌科(Entero-bacteriaceae)，其中包括致病杆菌属(Xenorhabdus)[1]和发光杆状菌属(Photorhabdus)[2]。这类共生菌与线虫之间的关系属于专性共生。其中：致病杆菌属与斯氏线虫属(Steinernema) 共生，发光杆菌属与异小杆线虫属(Heterorhabditis) 线虫共生[3]。在自然界，此类共生菌存在于3龄侵染期线虫的肠道内，共生菌以线虫为媒介进入昆虫的血腔中并释放毒素，进而与线虫协作杀死昆虫；共生菌还能分解昆虫组织，为线虫和自身的生长繁殖提供必需的养分；此外，当昆虫被杀死后，大量的腐生菌侵染虫体时，共生菌又可释放抑菌活性物质抑制腐生菌的生长[4]。近年来，随着对昆虫病原线虫共生菌的研究不断深入，共生细菌的许多生物学功能亦不断被发现，大量抗癌、抗肿瘤、杀虫及杀菌的活性成分已被开发应用于实际生产中[5]。同时，昆虫病原线虫共生菌也成为筛选了杀虫、杀菌和除草活性物质的重要资源[6]。
在从昆虫病原线虫共生菌中寻找新的农药活性物质研究中，本课题组从土壤中分离出一株具有较好抗菌活性的菌株，对其分类进行了鉴定。初步抑菌活性结果表明，该菌株发酵液对多种病原菌有良好的抑制作用。为了明确其发酵液的抑菌活性成分，笔者采用活性组分追踪法，利用大孔树脂吸附、硅胶柱层析和凝胶柱层析等技术手段，从该菌株发酵液中分离出了主要抑菌活性成分化合物1，通过核磁共振波谱及质谱技术对其结构进行了鉴定，并对其抑菌活性进行了初步研究。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 菌株供试菌株保存于沈阳农业大学植物保护学院微生物次生代谢产物研究室。
1.1.2 病原菌植物病原真菌：玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、向日葵菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum和瓜果腐霉病菌Pythium aphanidermatum。病原细菌：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠埃希杆菌Escherichia coli、柞蚕链球菌Streptococcus pernyi和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。上述病原菌均由沈阳农业大学植物保护学院微生物次生代谢产物研究室提供。
98.5%百菌清(chlorothalonil) 原药，由山东潍坊丰化工股份有限公司提供；卡那霉素(Kanamycin)，由Sigma-Aldrich贸易公司提供。
1.1.3 培养基NBTA培养基：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂粉15 g/L，氯化三苯基四氮唑(TTC) 0.040 g/L，溴百里酚蓝(BTB) 0.025 g/L，蒸馏水1 L。LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，蒸馏水1 L。M培养基：葡萄糖6.13 g/L，蛋白胨21.29 g/L，硫酸镁1.50 g/L，硫酸铵2.46 g/L，磷酸二氢钾0.86 g/L，磷酸氢二钾1.11 g/L，硫酸钠1.72 g/L，蒸馏水1 L。PDA培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，蒸馏水1 L。上述培养基pH值均为7.0~7.2。Mueller-Hinton肉汤培养基(Solarbio)。
1.1.4 主要试剂和仪器柱层析硅胶(200~300 mm) (青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20柱层析凝胶(瑞典Pharmacia公司)；XAD-16大孔树脂(罗门哈斯国际贸易有限公司)。暗箱四用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；Agilent 6540飞行时间质谱仪(美国Agilent公司)；AV-600 Hz核磁共振仪(德国Bruker公司)；Bruker D8 VENTURE X射线单晶衍射仪(布鲁克科技公司)。
1.2 试验方法 1.2.1 菌株的分离及鉴定供试菌株于2015年6月从辽宁省铁岭西风成平乡北兴得村榛子园的土样中分离得到，使用大蜡螟Gallreia mellonella进行诱导，在NBTA培养基上纯化，获得绿色初生型菌株。参照文献[7]中的方法对该菌株的基因组DNA进行提取，并以此为模板进行PCR扩增，扩增产物经纯化后测序，利用16SrDNA序列比对分析对其进行分类鉴定[8]。
1.2.2 菌株培养将保存的供试菌株转接到NBTA固体培养基上，于28 ℃下培养24 h。挑取蓝色单菌落接种于装有20 mL M培养基的三角瓶中，并在28 ℃、180 r/min下培养24 h，得到种子发酵液。将种子发酵液以5%的接种量接种于装有18 g XAD-16大孔树脂及400 mL M培养基的2 L三角瓶中，总发酵量为28 L，并在相同培养条件下培养5 d。
1.2.3 活性成分的分离用蒸馏水洗去菌体，收集发酵液中的大孔树脂，28 ℃下烘干。烘干后的树脂用甲醇浸泡12 h，收集浸提液并浓缩成固体。用质量分数为50%的甲醇水溶液将固体再次溶解，用一倍体积的二氯甲烷萃取4次。收集有机相，真空浓缩，得到8 g粗提物浸膏。利用正相硅胶柱分离纯化粗提物，依次用V (二氯甲烷) :V (甲醇)=100 : 2、100 : 4、100 : 8、100 : 12、1 : 1及甲醇梯度洗脱，每200 mL收集1份。经薄层层析检测，展开剂为V (二氯甲烷):V (甲醇)=100 : 5，合并相同组分，共得到9个组分(A -I)。以瓜果腐霉病菌和大肠埃希杆菌为指示菌，采用活性追踪法测定各组分的抑菌活性，发现组分B (1 206.1 mg) 具有较强的抑菌活性。将组分B依次进行硅胶柱层析[V (石油醚) :V (乙酸乙酯)=9 : 1]，等度洗脱，以及Sephadex LH-20凝胶柱层析[V (二氯甲烷) :V (甲醇)=1 : 1]，得到化合物1 (50 mg)。
1.2.4 活性成分结构鉴定分别利用1H NMR、13C NMR、高分辨质谱和X-光单晶衍射对化合物1的结构进行确认。
1.2.5 对植物病原真菌抑制活性的测定采用菌丝生长速率法[9]。以V (丙酮):V (吐温-80)=1:1为溶剂，将化合物溶解后加入到PDA培养基中，使化合物的质量浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL。以含有相同质量浓度的百菌清为阳性对照，以只含丙酮-吐温-80混合溶剂的培养基为阴性对照。分别接入直径为6 mm的靶标菌菌饼，28 ℃培养。每组处理重复3次。5 d后用十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算目标化合物对菌丝生长的抑制率。所得数据经SPSS软件处理，求得EC50值、毒力回归方程和相关系数(r)。
1.2.6 对病原细菌抑制活性的测定采用改良的微量稀释法[10]。从PDA培养基中挑取1~2个形态相似的菌落，接入含5.0 mL灭菌的Mueller-Hinton肉汤试管中，于37 ℃下培养至轻度混浊，加入适量的Mueller-Hinton肉汤，调整到麦氏浊度为0.5，再加入Mueller-Hinton肉汤稀释，其接种量相当于7 × 105 cell/mL。将目标化合物用DMSO溶解并配制为250 μg/mL的母液。将稀释好的菌液和含有化合物的母转入96孔板中，每孔100 μL，再分别加入不同体积含有化合物的母液和Mueller-Hinton肉汤培养基，使总体积为200 μL，化合物终浓度分别为250.0、125.0、62.5、31.25、15.62、7.8、3.9、1.95和0.97 μg/mL。每板另设不加药剂的空白对照、卡那霉素阳性对照和加药不接菌的阴性对照。每处理3次重复。于37 ℃下培养20 h，记录药剂对菌株的最小抑制浓度(MIC)。
2 结果与分析 2.1 SN22菌株的分类鉴定将从土样中分离、诱导、纯化获得的绿色初生型菌株的基因组DNA进行提取，发现其16S rDNA序列长度为1 406 bp (图 1)。将该序列上传至NCBI GenBank，获得登记号KX870121。构建系统发育树(图 2)，并与NCBI GenBank中的序列进行相似性比较，发现其与埃勒斯致病杆菌Xenorhabus ehlersii DSM 16337T/AJ810294的亲缘关系最近，因此初步鉴定并命名其为埃勒斯致病杆菌X. ehlersii SN22。
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图 1 埃勒斯致病杆菌SN22菌株光学显微图 Fig. 1 Micrographs of strainsX. ehlersii SN22 |
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图 2 埃勒斯致病杆菌SN22菌株16SrDNA基因系列构建的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of strainX. ehlersii SN22 based on 16SrDNA gene sequence |
2.2 活性成分结构鉴定
化合物1为无色无味固体，熔点为97.4~98.9 ℃，易溶于氯仿。高分辨质谱给出准分子离子峰[2M + K]+为315.0942，推出其分子式为C8H10O2。1H NMR (600 MHz, CDCl3)，δ：7.47 (d, 1H, J=10.2 Hz)，6.34~6.18 (m, 1H)，5.50 (s, 1H)，2.46~2.33 (m, 2H)，2.29~2.14 (m, 2H)，1.86~1.73 (m, 2H)；13C NMR (600 MHz, CDCl3)，δ：22.5 (t)，26.1 (t)，32.79 (t)，112.4 (d)，125.1 (d)，139.2 (d)，155.0 (s)，172.2 (s)。在化合物1的1H NMR谱图中，显示一个单峰的烯氢质子δ 5.50 (s, 1H)，推测该结构中含有一个3取代双键；在低场区还存在2个烯氢质子δ 7.47和6.34~6.18，推测该化合物还有一个双取代双键；在高场区还存在6个亚甲基质子δ 2.46~2.33，2.29~2.14和1.86~1.73。13C NMR谱图显示：化合物1的高场区有3个碳，分别为δ 32.79 (C-8)，26.1 (C-6) 和22.5 (C-7)，推测结构中含有3个亚甲基；13C NMR谱图显示，在低场部分有5个碳:δ 139.2 (C-5), 112.4 (C-2)，125.1 (C-4)，155.0 (C-3) 和172.2 (C-1)，推断该化合物含有2个双键和1个酯羰基。结合1H NMR、13C NMR和高分辨质谱数据，推断该化合物为3-(环己-2-烯) 丙烯酸。通过文献调研发现，该化合物的顺反异构混合物曾被化学合成过[11]，但文献中并未给出相关1H NMR和13C NMR数据，也未确定双键构型。故本研究对化合物1进行了X-光单晶衍射(结果见表 1)，并由此确认其双键构型为Z式(图 3)。因化合物1为新的天然产物，又是Xenorhabdus ehlersii的次生代谢产物，鉴于化合物1的结构中含有羧基，故将其命名为Xenorhabic acid。
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表 1 化合物1的晶体数据和结构修正参数 Table 1 Crystal data and structural modification parameters of compound 1 |
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图 3 化合物1的化学结构和晶体结构 Fig. 3 Chemical and crystal structures compound 1 |
2.3 化合物对植物病原真菌的抑制活性
菌丝生长速率法测定结果(表 2) 表明：Xenorhabic acid对3种病原真菌均有一定的抑制作用，其中，对向日葵菌核病菌和瓜果腐霉病菌的抑菌活性较为突出，其EC50值分别为27.99和29.55 μg/mL。
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表 2 Xenorhabic acid对植物病原真菌的抑制活性 Table 2 Antifungal activity of Xenorhabic acid against phytopathogenic fungi |
2.4 化合物对病原细菌的抑制活性
结果(表 3) 表明：Xenorhabic acid对部分革兰氏阴性细菌具有一定抑制活性，如对大肠埃希杆菌的最低抑制浓度为62.5 μg/mL。
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表 3 Xenorhabic acid对4种病原细菌的抑菌活性 Table 3 MIC values of Xenorhabic acid against bacteria |
3 讨论
埃勒斯致病杆菌于2005年首次被Lengyel等发现，并通过改良的Attila Lucskai方法分离得到[12]。本研究中笔者也采用类似的方法从已被病原菌侵染的大蜡螟体内分离得到了该致病杆菌。从系统发育树中获得的信息可知，与勒斯致病杆菌亲缘关系较近的菌株Xenorhabdus vietnamensis的次生代谢产物能够有效地抑制革兰氏阴性菌的生长[13], 而本研究发现，埃勒斯致病杆菌的次生代谢产物也有类似的特点。
通过文献调研发现，与Xenorhabic acid结构类似的天然产物有苄基丙酮和肉桂酸[14]，且其对部分革兰氏阴性细菌均有一定的抑制作用[15]。对比发现，这3类化合物中均含有α，β-不饱和双键和酯羰基，因此推断，α，β-不饱和双键和酯羰基可能是Xenorhabic acid的活性基团。已有研究表明，Xenorhabic acid顺反异构体的混合物可通过α-三甲基硅烷β内酯在BF3的催化下环化加成得到[11]，这为该化合物的合成奠定了基础。鉴于Xenorhabic acid对瓜果腐霉病菌、向日葵菌核病菌以及部分革兰氏阴性菌均具有一定的抑制作用，值得进一步研究。
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