农药学学报  2016, Vol. 18 Issue (6): 759-764   PDF    
引用本文
李文卓, 钱圆, MATSUMOTOHaruna, 刘晓玉, 秦丽, 王蒙岑, 朱国念 . 气相色谱-串联质谱检测蔬菜中氟吡菌酰胺及其代谢物残留[J]. 农药学学报, 2016, 18(6): 759-764,doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2016.0107   
LI Wenzhuo, QIAN Yuan, MATSUMOTO Haruna, LIU Xiaoyu, QIN Li, WANG Mengcen, ZHU Guonian . Simultaneous determination of fluopyram and its metabolite in vegetables using gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Pesticide Science, 2016, 18(6): 759-764, doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2016.0107   
气相色谱-串联质谱检测蔬菜中氟吡菌酰胺及其代谢物残留
李文卓1, 钱圆1, MATSUMOTOHaruna1, 刘晓玉1, 秦丽2, 王蒙岑1, 朱国念1     
1. 浙江大学 农药与环境毒理研究所, 杭州 310058;
2. 杭州市余杭区农产品质量安全检验检测站, 杭州 311100
收稿日期: 2016-09-24    录用日期: 2016-10-31.
作者简介: 李文卓,男,硕士研究生,E-mail:lwzrunning@163.com ;
*秦丽,并列通信作者(Co-author for correspondence),女,硕士研究生,主要从事农药残留分析及农产品质量安全研究,E-mail:qinli8523390@163.com
王蒙岑,通信作者(Author forcorrespondence),男,博士,主要从事农药生态毒理及微生物生态学研究,E-mail:wmctz@zju.edu.cn
摘要: 采用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）技术建立了同时检测7种类型蔬菜中氟吡菌酰胺及其代谢物残留的分析方法。样品采用乙腈提取，无水硫酸镁和氯化钠盐析后，经分散固相萃取（PSA）净化，GC-MS/MS检测。结果表明：在0.01、0.1和1 mg/kg 3个添加水平下，氟吡菌酰胺及其代谢物2-（三氟甲基）苯甲酰胺（BZM）的平均回收率在80%~108%之间，相对标准偏差（RSD）在1.5%~8.4%之间。氟吡菌酰胺及其代谢物在7种蔬菜中的检出限（LOD）（S/N=3）分别为2.17~3.13 μg/kg和1.22~2.04 μg/kg，两者的定量限（LOQ）均为0.01 mg/kg。该方法操作简便、稳定和快速，可以满足大部分蔬菜中氟吡菌酰胺及其代谢物的定性与定量分析要求。
关键词: 气相色谱-串联质谱     蔬菜     氟吡菌酰胺     代谢物     残留    
Simultaneous determination of fluopyram and its metabolite in vegetables using gas chromatography-tandem mass spectrometry
LI Wenzhuo1, QIAN Yuan1, MATSUMOTO Haruna1, LIU Xiaoyu1, QIN Li2, WANG Mengcen1, ZHU Guonian1     
1. Institute of Pesticide and Environmental Toxicology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;
2. Agricultural Products Quality and Safety Inspection and Monitoring Station of Yuhang District, Hangzhou 311100, China
Abstract: A method was developed for simultaneous determination of fluopyram and its metabolite residues in vegetables by gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). Samples were extracted with acetonitrile, and salted-out by magnesium sulfate and sodium chloride. After clean up with PSA, the analyte was subjected to determination using GC-MS/MS. The results showed that the average recoveries varied from 80% to 108% at the spiked concentrations of 0.01, 0.1 and 1 mg/kg, with the relative standard deviation (RSD) varied from 1.5% to 8.4%. The limits of detection (LOD, S/N=3) varied from 2.17 μg/kg to 3.13 μg/kg for fluopyram in different vegetable samples, while the LOD of fluopyram metabolite varied from 1.22 μg/kg to 2.04 μg/kg. For both fluopyram and its metabolite, the limit of quantification (LOQ) (based on the recovery test) was 0.01 mg/kg. Hence, the method developed in this work is convenient, rapid, reliable, and, more importantly, applicable for qualitative and quantitative analyses of residues of fluopyram and its metabolite in the majority of vegetables.
Key words: gas chromatography tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)      vegetable      fluopyram      metabolite      residue     

氟吡菌酰胺 (图式 1A) 属吡啶基乙基苯甲酰胺类杀菌剂，其主要作用机制是抑制呼吸链中琥珀酸脱氢酶的电子转移，阻碍线粒体呼吸，从而抑制病原菌的生长，达到控制病害的目的[1-2]。可用于防治 70 多种作物上的病害，其中对丛梗孢属病菌、核盘菌、白粉病菌和灰霉病菌引起的病害防效优异[3-4]，近年来被广泛用于防治蔬菜上的真菌病害。

图式 1 氟吡菌酰胺 (A) 及其代谢物 BZM (B) 的结构式 Scheme1 The structural formula of fluopyram (A) and its metabolite BZM (B)

氟吡菌酰胺在植物源样品中残留定义为氟吡菌酰胺母体，而在动物源样品中的残留定义为氟吡菌酰胺母体及其代谢物 2-(三氟甲基) 苯甲酰胺 (BZM，图式 1B)(折算后以氟吡菌酰胺母体表示)[5]。据农药残留联席会议 (JMPR) 报告报道，氟吡菌酰胺在田间 GAP 试验中，主要以母体及 BZM 的残留形式分布于土壤和植物中，而在动物代谢试验中也发现氟吡菌酰胺及 BZM 可分布于多种器官内[5]。欧洲食品安全局规定[6]: 氟吡菌酰胺在马铃薯中的最大残留限量 (MRL) 值为 0.1 mg/kg，在洋葱中的为 0.1 mg/kg，在番茄中的为 0.9 mg/kg，在青花菜中的为 0.3 mg/kg，在莴苣中的为 15 mg/kg，在扁豆中的为 0.1 mg/kg，在黄瓜中的为 0.4 mg/kg；国际食品法典中则规定[7]：氟吡菌酰胺在马铃薯中的 MRL 值为 0.03 mg/kg，在洋葱中的 MRL 值为 0.07 mg/kg，在番茄中的 MRL 值为 0.4 mg/kg，在青花菜中的 MRL 值为 0.15 mg/kg，在莴苣中的 MRL 值为 15 mg/kg；在扁豆中的 MRL 值为 0.07 mg/kg；在黄瓜中的 MRL 值为 0.5 mg/kg。

目前，对氟吡菌酰胺的分析方法主要采用传统的气相色谱法[8-11]，存在检测灵敏度相对较低等不足[12]。Dong 等[13]利用气相色谱-串联质谱 (GC-MS/MS) 建立了氟吡菌酰胺在西瓜和土壤中残留的分析方法，但尚未见采用 GC-MS/MS 方法检测蔬菜中氟吡菌酰胺残留的报道。鉴于此，本研究采用 GC-MS/MS 分析方法，检测蔬菜样品中氟吡菌酰胺及其代谢物残留情况，旨在为中国制定氟吡菌酰胺在蔬菜中的 MRL 值提供依据，也为进一步探究氟吡菌酰胺及其代谢物 BZM 对非靶标生物的毒性效应提供参考。

1 材料与方法 1.1 主要仪器

气相色谱-质谱联用仪 (7890B GC-，7000C Triple Quad MS/MS) 和 Agilent HP-5ms UI 毛细管色谱柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)(美国安捷伦公司)；DHZ-DA 大型冷冻恒温振荡器 (苏州太仓公司)；R-210 旋转蒸发仪及 V-700 真空泵 (瑞士 BUCHI 公司)。

1.2 药剂与试剂

99.4% 氟吡菌酰胺 (fluopyram) 标准品 (德国 Dr.Ehrensorfer 公司)；98.0% 2-(三氟甲基) 苯甲酰胺 [2-(trifluoromethyl)benzamide，BZM] 标准品 (西格玛奥德里奇公司)；乙腈为色谱纯；无水硫酸镁、氯化钠、乙酸乙酯等试剂均为分析纯；N-丙基乙二胺 (PSA，美国 Welch Materials公司)。

1.3 试验材料

按 GB273—2014 规定[14]，从中国浙江省杭州市余杭区良渚镇勾庄杭州农副产品物流中心随机抽取具有代表性的蔬菜样品：洋葱、青花菜、莴苣、番茄、黄瓜、扁豆和马铃薯，分别代表鳞茎类、芸薹属类、叶菜类、茄果类、瓜类、豆类和薯芋 7 类蔬菜。

1.4 样品提取与净化

称取蔬菜样品 20 g 于 250 mL 离心瓶中，加入 20 mL 水，准确加入 50 mL 乙腈，振荡 30 min；过滤至装有 5 g 氯化钠和 8 g 硫酸镁的具塞量筒中，剧烈振荡 1 min 后静置 15 min；取上清液 25 mL，于 40 ℃ 减压浓缩至近干，用乙酸乙酯定容至 2 mL，转入加有 0.1 g PSA[15]和 1.0 g 无水硫酸镁的离心管中，涡旋 1 min，于 4 000 r/min 下离心 5 min；取上清液，过 0.22 μm 有机膜，GC-MS/MS 待检测。

1.5 仪器分析条件

气相色谱条件：进样口温度 210 ℃；程序升温，初始温度 80 ℃，20 ℃/min 升至 120 ℃，保持 0.5 min；30 ℃/min 升至 240 ℃，保持 1 min；20 ℃/min 升至 290 ℃，保持 4 min；载气为高纯氦气 (99.999%)；进样量 1.00 μL，不分流进样；隔垫吹扫流量 3 mL/min。

质谱条件：电子轰击离子源 (EI 源)，轰击能量 -70 eV；离子源温度 230 ℃；四极杆温度 150 ℃；传输线温度 250 ℃；溶剂延迟 3.5 min；淬灭气 (氦气) 流量 2.25 mL/min；碰撞气 (氮气) 流量 1.5 mL/min；多反应监测 (MRM) 模式 (表 1)。

表 1 质谱多重反应监测参数 Table 1 The parameters of multi-reaction monitoring mode

1.6 标准溶液配制及标准工作曲线绘制

将氟吡菌酰胺及其代谢物BZM溶解于乙酸乙酯，配制成 1 000 mg/L 的标准母液，分别用不同的蔬菜空白样品 (基质) 提取液稀释成 0.01、0.05、0.1、0.5 和 1 mg/L 的基质匹配标准工作溶液，按 1.5 节的条件测定。以进样质量浓度为 x 轴、响应值为 y 轴绘制标准工作曲线。外标法定量[16]。

1.7 添加回收试验

向 7 种供试蔬菜空白样品中分别添加 0.01、0.1 和 1.0 mg/kg 的氟吡菌酰胺及其代谢物 BZM 标准工作溶液，采用所建立的方法测定其添加回收率及相对标准偏差 (RSD)。每个添加水平重复 5 次，同时设空白对照。

1.8 实际样品检测

于 2015 年 5—6 月，运用本研究中建立的 GC-MS/MS 分析方法，对从杭州农副产品物流中心随机抽取的 7 种蔬菜检测氟吡菌酰胺及其代谢物 BZM 的残留量。每种蔬菜来源地为 3~4 地，每种抽取 10 个样本，每个样本量大于 500 g，混匀后留样 400 g，备用。

2 结果与分析 2.1 质谱条件的确定

首先运用 MS1 Scan 全扫描方法，根据所得化合物的全扫描谱图，确定母离子的 m/z 值为 173.0，以该母离子编辑子离子扫描方法，根据质谱图中的碎片离子选择丰度相对较高的一组离子，即 144.9/94.9；通过 MRM 模式扫描，确定每个子离子的最佳碰撞电压为 30 eV。

2.2 提取溶剂的选择

比较了乙腈、甲醇和丙酮对马铃薯、洋葱、番茄、青花菜、莴苣、扁豆及黄瓜样品中氟吡菌酰胺及其代谢物BZM的提取效果。结果发现：分别以甲醇和丙酮为提取剂时，回收率相对较低。而以乙腈为提取剂时，回收率为 80%~108%，且操作简便，稳定性高，重现性好，提取杂质好且用量少，因此选择乙腈为提取溶剂。

2.3 样品净化条件的选择

采用 PSA 分散固相萃取净化，用无水硫酸镁除去水分，使样品提取液与 PSA 充分接触，可有效除去提取液中的杂质，且比 SPE 净化法省时，简便易行。

2.4 方法的线性范围与检出限

结果表明: 在 0.01~1 mg/L 范围内，氟吡菌酰胺及其代谢物 BZM 的进样质量浓度 (x) 与色谱峰面积 (y) 间线性关系良好，氟吡菌酰胺及 BZM 在 7 种蔬菜基质中的决定系数分别为 0.993 2~0.999 1 和 0.992 9~0.998 7 (表 2)，保留时间分别为 8.18 和 4.62 min (图 1)。

表 2 不同蔬菜样品基质的标准曲线方程、决定系数及检出限 (线性范围 0.01~1.0 mg/kg) Table 2 The standard curve, coefficient of determination, and the limits of detection of fluopyram and its metabolite in different matrixes at the concentrations ranged from 0.01 to 1.0 mg/kg

图 1 洋葱空白样品 (A) 及添加氟吡菌酰胺及其代谢物 (0.01 mg/kg) 后 (B) 的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion chromatograms of onion blank sample (A) and spiked sample with fluopyram and its metabolite at 0.01 mg/kg (B)

方法的检出限 (LOD)(S/N = 3) 氟吡菌酰胺在 1.92~3.13 之间，BZM 的在 1.22~2.04 μg/kg 之间；氟吡菌酰胺及 BZM 在检测样品中的定量限 (LOQ) 均为 0.01 mg/kg。

2.5 添加回收试验结果

结果 (表 3) 显示：在 0.01、0.1 和 1.0 mg/kg 3 个添加水平下，马铃薯、洋葱、番茄、青花菜、莴苣、扁豆和黄瓜中氟吡菌酰胺的回收率在 80~108% 之间，相对标准偏差 (RSD) 在 1.5%~8.0% 之间；其代谢物BZM的添加回收率在 83%~99% 之间，RSD 在 1.9%~8.4% 之间。表明方法的精密度和准确度均较好，符合农药残留分析的要求[17-18]。

表 3 氟吡菌酰胺及其代谢物在 7 种蔬菜样品中的添加回收率和相对标准偏差 (n = 5) Table 3 Recoveries of fluopyram and its metabolite in vegetable samples at different spike levels (n = 5)

2.6 氟吡菌酰胺及其代谢物 BZM 在 7 种市售蔬菜中的残留量

结果表明：在 7 种被抽检蔬菜中，马铃薯、洋葱、青花菜、扁豆和黄瓜均未检出待测物；而在青花菜中检出氟吡菌酰胺，检出率为 6.7%，最高含量为 0.014 mg/kg；在番茄中同时检出了氟吡菌酰胺及 BZM，检出率均为 5.0%，最高含量分别为 0.016 和 0.011 mg/kg。因中国暂无氟吡菌酰胺的 MRL 值标准，但 CAC 规定氟吡菌酰胺在青花菜和番茄中的 MRL 值分别为 0.15 和 0.4 mg/kg，以此为依据，本研究检测结果说明氟吡菌酰胺在本次抽检的蔬菜样品中均无超标情况。

3 结论

运用分散固相净化-气相色谱-串联质谱技术，建立了同时检测不同类型蔬菜中氟吡菌酰胺及其代谢物 BZM 残留量的分析方法。样品用乙腈匀浆提取，氯化钠和无水硫酸镁盐析后，经 PSA 净化，GC-MS/MS 检测。在 0.01~1 mg/kg 添加水平下，氟吡菌酰胺及其代谢物 BZM 在 7 种供试蔬菜基质中的平均回收率在 80%~108% 之间，相对标准偏差 (RSD) 在 1.5%~8.4% 之间。该方法快速、简便、灵敏、高效，可满足农药残留分析的要求，同时实现了代谢物 BZM 的定性与定量分析。

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