2016, Vol. 18
以吡虫啉 (imidacloprid) 为代表的新烟碱类杀虫剂是昆虫烟碱乙酰胆碱受体 (nAChRs) 的激动剂，具有杀虫活性高、杀虫谱广、对哺乳动物低毒及环境相容性好等特点，已被广泛用于防治烟粉虱、褐飞虱及蚜虫等刺吸式口器害虫[1]。自 20 世纪 90 年代吡虫啉上市以来，新烟碱类杀虫剂已成为全球市场份额最大的杀虫剂种类，2014 年的销量约占全球杀虫剂市场的 25%[2]。然而，经过长期持续使用，吡虫啉等新烟碱类杀虫剂面临的抗性及交互抗性问题日益严重，因而限制了该类药剂的发展[3-4]。
昆虫对杀虫剂抗性的产生和发展，除了与生物体内靶标位点亲和力的变化有关外，也与昆虫代谢该杀虫剂的路径和速率密切相关。昆虫可以通过增强对杀虫剂的吸附、储存和解毒代谢来保护自己，避免杀虫剂与靶标的结合[5-6]。昆虫对杀虫剂的解毒代谢作用，通常涉及谷胱甘肽 S-转移酶 (GSTs)、细胞色素 P450s 和酯酶等[7]。据报道，在抗吡虫啉棉蚜 Aphis gossypii[8-9]、褐飞虱 Nilaparvata lugens[10-11]、桃蚜 Myzus persicae[12]、烟粉虱 Bemisia tabaci[13-14]和西花蓟马 Frankliniella occidentalis[15]等害虫体内，相关解毒酶的活性及酶含量都出现了一定程度的上升，而害虫对吡虫啉等新烟碱类杀虫剂的解毒代谢作用则主要通过 P450s 完成[2]。
在商品化新烟碱类杀虫剂的结构中，硝基通常处于“反式”位置。华东理工大学李忠课题组通过控制硝基的取向，发现了系列“顺式”硝基烯类 (简称：顺硝烯类) 新烟碱化合物[16]，其典型代表为哌虫啶 (paichongding) 和环氧虫啶 (cycloxaprid)。其中，环氧虫啶含有新颖的氧桥环顺硝烯结构，对靶标具有独特的拮抗作用，可以有效防治稻飞虱等刺吸式口器害虫，对田间吡虫啉抗性害虫具有很好的防治效果，已于 2015 年获得国家新农药临时登记证。基于环氧虫啶的分子结构，李忠课题组[17]采用氮桥环替换氧桥环进一步衍生，发现了 IPP167 系列化合物 (图式 1)，其不仅对半翅目害虫具有高杀虫活性，同时对鳞翅目害虫也有较高活性，具有良好应用前景。
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图式 1 新烟碱类化合物结构 Scheme1 Structures of neonicotinoid compounds |
相比吡虫啉等商品化的新烟碱类杀虫剂，环氧虫啶等桥环新烟碱化合物具有结构骨架独特、作用机制新颖等特征。本文拟通过研究环氧虫啶等桥环新烟碱类化合物对苜蓿蚜的室内毒力、酶抑制剂的增效作用和药剂对相关解毒代谢酶活性的影响，初步探索苜蓿蚜对环氧虫啶可能的解毒代谢机制，以期为环氧虫啶等桥环新烟碱类杀虫剂的后期开发及应用提供理论支持。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试昆虫：苜蓿蚜 Aphis craccivora (Koch) 为国家南方农药创制中心上海基地饲养保存的室内敏感品系。于 25 ℃、光照周期 L:D = 16 h:8 h、相对湿度 70%~80% 条件下用蚕豆苗饲养，取羽化后的一日龄成虫供试。
药剂及试剂：96% 吡虫啉 (imidacloprid) 原药 (江苏克胜集团股份有限公司)；97% 环氧虫啶 (cycloxaprid) 原药 (上海生农生化制品有限公司)；IPP167201、IPP167103 和 IPP167140 (有效成分均大于 96%)，由本课题组按照文献方法[17]合成。TritonX-100、乙二胺四乙酸 (EDTA)、二硫苏糖醇 (DTT)、苯基硫脲 (PTU)、苯甲基磺酰氟 (PMSF)、7-乙氧基香豆素、7-羟基香豆素、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、顺丁烯二乙酯 (DEM) 及胡椒基丁醚 (PBO)(阿拉丁试剂)；Bradflod 试剂盒 (普利莱基因技术有限公司)；1-氯-2,4-二硝基苯 (CDNB)、α-醋酸萘酚、NADPH (Sigma 试剂)；磷酸三苯酯 (TPP，百灵威试剂)；二甲基亚砜 (DMSO)(国药集团化学试剂有限公司)。
主要仪器：Synergy NEO2 酶标仪 (Bio-Tek 公司)；2-16PK 高速离心机 (Sigma 公司)；CP80MX 超速离心机 (Hitachi 公司)。
1.2 试验方法 1.2.1 毒力测定采用带虫浸叶法[18]。将供试药剂溶于 DMSO，用清水 (含体积分数为 0.05% 的 TritonX-100) 稀释至不同浓度。将带有 20~30 头无翅苜蓿蚜成虫的蚕豆苗分别在各浓度药液中浸泡 10 s，取出并吸干多余药液。将带虫豆苗插入用清水浸湿的海绵中，于 25 ℃ 下恒温培养，48 h 后统计蚜虫死亡率。每处理重复 3 次，以清水 (含体积分数为 0.05% 的 TritonX-100 和 1% 的 DMSO) 作空白对照，以吡虫啉为阳性对照药剂。
1.2.2 酶抑制剂对化合物毒力的影响测定分别将顺丁烯二乙酯、胡椒基丁醚和磷酸三苯酯 3 种酶抑制剂溶于 DMSO，并用清水 (含体积分数为 0.05% 的 TritonX-100) 稀释至 20 mg/L，于浸药前 1 h 采用带虫浸叶法处理蚜虫。随后同 1.2.1 节进行毒力测定，于 48 h 后统计蚜虫死亡率。
1.3 解毒酶活力测定 1.3.1 酶源制备参照 1.2.1 节方法，分别用 LC50 浓度的吡虫啉和环氧虫啶处理无翅苜蓿蚜成虫，每处理重复 3 次。48 h 后分别收集存活成虫，冻存于液氮中，用于制备酶源。
取 50 头冻存的苜蓿蚜成虫，加入 0.1 mol/L (pH 7.4) 的磷酸缓冲液 1.5 mL，冰浴研磨后，于 10 000 × g (4 ℃) 下离心 20 min，取上清液，作为谷胱甘肽 S-转移酶 (GSTs) 和羧酸酯酶酶 (CarE) 的酶源。
另取 50 头冻存的苜蓿蚜成虫，加入研磨液 [含 0.1 mol/L (pH 7.4) 的磷酸缓冲液，1 mmol/L 的 EDTA，0.1 mmol/L 的 DTT，1 mmol/L 的 PTU 及 1 mmol/L 的 PMSF] 研磨后，于 10 000 × g (4 ℃) 下离心 30 min。取上清液，于 100 000 × g (4 ℃) 下离心 60 min。取沉淀，用含体积分数为 20% 甘油的研磨液重悬浮，作为细胞色素 P450 酶源。
1.3.2 蛋白含量测定采用 Bradfold[19]的方法，通过蛋白定量试剂盒测定酶液中蛋白含量。
1.3.3 酶活性测定GSTs 活力测定参考 Gao 等的方法[20]。取 30 μL 酶液，加入 0.01 mol/L 的还原型谷胱甘肽溶液 20 μL，0.1 mol/L (pH 7.4) 的磷酸缓冲液 100 μL，0.01 mol/L 的 CDNB 溶液 80 μL；对照组不加酶液。在 27 ℃ 水浴条件下孵育，20 min 后分别测定 340 nm 处的 OD 值。每处理重复 3 次。依照公式 (1) 计算酶活力。
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(1) |
式中，GSTs activity 为酶活力 [μmol/(mg pro.·min)]，OD 为每分钟吸光度变化值，ε 为产物的消光系数 [0.009 6 L/(mol·cm)]，L 为光程 (cm)，c 为酶源中蛋白的质量浓度 (mg/mL)。
细胞素色 P450s 活力测定参考 Kwon 等的方法[21]。取 450 μL 酶液，加入 25 μL NADPH 和 25 μL7-乙氧基香豆素，于 30 ℃ 恒温摇床反应 30 min。反应结束时加入 35 μL 氧化型谷胱甘肽 (0.03 mol/L) 和 35 μL 谷胱甘肽转移酶 (0.5 U)，室温下静置10 min，除去荧光背景。加入 570 μL 含体积分数为 50% 乙腈的 Tris 溶液 (0.05 mol/L，pH 10) 终止反应。检测荧光值，激发波长为 390 nm，发射波长为 465 nm。每处理重复 3 次。以 7-羟基香豆素制作标准曲线，根据酶源蛋白含量测定结果，计算细胞素色 P450s 活力 [μmol/(mg pro.·min)]。
CarE 活力测定参考 Saito 等的方法[22]。取 30 μL酶液，加入 0.1 mol/L (pH 7.4) 的磷酸缓冲液 40 μL，底物 100 μL (0.3 mmol/L 的 α-醋酸萘酯中含有 0.01 mmol/L 的毒扁豆碱)。在 30 ℃ 下分别孵育 20 min。加入 30 μL 显色剂，于室温下静置 30 min，立刻检测 600 nm 下的吸光值，每处理重复 3 次。以 α-萘酚制作标准曲线，根据酶源蛋白含量测定结果，计算 CarE 活力 [μmol/(mg pro.·min)]。
1.4 数据统计分析采用 POLO-Plus 对毒力测定数据进行处理，计算 LC50 值等相关数据；通过 DPS 软件的 LSD 法比较差异显著性。
2 结果与分析 2.1 桥环新烟碱类化合物对苜蓿蚜的毒力不同桥环结构新烟碱类化合物对苜蓿蚜的毒力测定结果见表 1。其中，七元桥环结构的环氧虫啶和 IPP167201 的 LC50 值分别为 3.454 和 2.481 mg/L，毒力与吡虫啉接近，分别是吡虫啉的 0.90 和 1.26 倍；八元桥环结构的 IPP167103 和 IPP167140 对苜蓿蚜的 LC50 值分别为 12.81 和 4.790 mg/L，毒力分别是吡虫啉的 0.24 和 0.65 倍，其中 IPP167103 的杀虫活性明显低于其他化合物。研究表明，七元氧桥结构的环氧虫啶和氮桥结构的 IPP167201 杀虫活性较好。
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表 1 新烟碱类化合物对苜蓿蚜的毒力及酶抑制剂 DEM、PBO、TPP 的增效作用 Table 1 Toxicities of neonicotinoid compounds to A. craccivora and synergistic effects of enzyme inhibitors DEM, PBO and TPP |
2.2 不同酶抑制剂对桥环新烟碱类化合物的增效作用
如表 1 所示，三类酶的抑制剂均可在不同程度上提高药剂对苜蓿蚜的毒力。其中，GSTs 抑制剂 DEM、P450s 抑制剂 PBO 及 CarE 抑制剂 TPP 对吡虫啉的增效比 (SR) 分别达到 1.74、2.40 和 1.42，PBO 的增效作用最好。研究表明，P450 酶在苜蓿蚜对吡虫啉的解毒代谢过程中具有重要作用。
环氧虫啶和 IPP167201 具有相似的七元桥环结构，仅桥环上的原子存在差异。DEM、PBO 和 TPP 对环氧虫啶的增效比分别为 4.02、3.22 和 1.39，对 IPP167201 的增效比分别为 3.83、3.01 和 2.20。即对这两种药剂而言，均是 DEM 的增效作用最强，其次是 PBO，而 TPP 的增效作用相对较弱。
由此推测，在苜蓿蚜对环氧虫啶和 IPP167201 的解毒代谢过程中，GSTs 和 P450s 均起着重要的作用，且前者更为突出。通过与吡虫啉的测定结果进行比较分析，可进一步推测，由于环氧虫啶等桥环新烟碱类化合物具有独特的骨架结构，因而在一定程度上致使苜蓿蚜的解毒代谢机制发生了改变。
2.3 环氧虫啶对苜蓿蚜相关解毒代谢酶活性的影响进一步选取环氧虫啶和阳性对照药剂吡虫啉，考察了 LC50 浓度下药剂对苜蓿蚜体内相关解毒酶活性的影响。结果 (表 2) 表明：经 LC50 浓度的环氧虫啶和吡虫啉处理后，苜蓿蚜体内 GSTs 和 P450s 活力与空白对照组相比均有显著提升 (P ＜ 0.05) ，即环氧虫啶和吡虫啉对苜蓿蚜体内 GSTs 和 P450s 活性均有一定的诱导能力，但环氧虫啶的诱导能力弱于吡虫啉。而两种杀虫剂对苜蓿蚜体内 CarE 活力影响不大，与空白对照组相比差异均不显著。
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表 2 环氧虫啶和吡虫啉对苜蓿蚜相关解毒代谢酶活性的影响 Table 2 Effects of cycloxaprid and imidacloprid on the activities of detoxification enzyme in A. craccivora |
3 结论与讨论
昆虫对新烟碱类杀虫剂的抗药性主要涉及其体内靶标 nAChR 的位点突变 (如褐飞虱 Y151S、桃蚜 R81T) 和解毒酶的解毒代谢作用两种机制[15, 23]。硝基是新烟碱类化合物的重要药效基团，其构型的变化易引起杀虫作用机制的改变，不仅有助于发现高活性化合物，同时也有助于解决新烟碱类杀虫剂的抗性问题[24-25]。以环氧虫啶为代表的七元桥环顺硝烯新烟碱化合物结构新颖，与现有新烟碱类杀虫剂结构相比差异显著，因此其除了对敏感的靶标害虫表现出高活性外[26-28]，对已对吡虫啉等药剂产生抗性的害虫也具有很好的防治效果[29]。
已有研究显示，环氧虫啶对褐飞虱[26]、白背飞虱 Sogatella furcifera[28]和麦长管蚜 Sitobion avenae[27]的防治效果均好于吡虫啉、烯啶虫胺 (nitenpyram)、噻虫嗪 (thiamethoxam)、噻嗪酮 (buprofezin) 和吡蚜酮 (pymetrozine) 等商品化药剂。笔者利用苜蓿蚜，研究比较了不同桥环结构新烟碱化合物的杀虫活性，结果显示，七元桥环结构的新烟碱类化合物对苜蓿蚜表现出较好的杀虫活性，具有良好的研究开发前景。
在新烟碱类杀虫剂抗性研究中，通常在室内对害虫进行抗性筛选，并进行相关解毒代谢酶活性测定，从而对可能的抗性机制进行预判。已有研究表明，在抗性发展过程中，害虫体内 GSTs、P450s 和 CarE 活性升高是害虫对新烟碱类杀虫剂敏感性降低的主要原因[6-7]，特别是与细胞色素 P450s 的过量表达密切相关。Bass 等[2]报道，部分地区桃蚜种群对吡虫啉和噻虫嗪的敏感性下降不仅与其 nAChR 的 R81T 位点突变有关，也与其 P450s CYP6CY3 的表达量升高密切相关。而褐飞虱体内 P450s 的 CYP6AY1 可以有效代谢吡虫啉[30]；在果蝇体内，吡虫啉的解毒代谢主要与 CYP6G1 相关[31]；在烟粉虱体内，吡虫啉的代谢主要由 CYP6CM1vQ 完成[13]，且 CYP6CM1vQ 与不同新烟碱类杀虫剂的结合能力存在差异[32]。目前，有关 P450s 对环氧虫啶代谢转化的研究较少，邵旭升等[29]报道，小鼠体内的 P450s 可将环氧虫啶部分代谢转化为氯吡啶硝基亚甲基化合物 (NTN32692) 及多种羟基化产物。但目前尚未见有关昆虫 P450s 对环氧虫啶代谢机制的研究报道。
本研究通过酶抑制剂增效试验，发现 DEM 和 PBO 均可有效提高七元桥环新烟碱类化合物对苜蓿蚜的毒力，进一步证明在苜蓿蚜对新烟碱类化合物的解毒代谢过程中，P450s 和 GSTs 都发挥了重要作用。其中，DEM 比 PBO 的增效作用更强。相关解毒代谢酶活性测定结果还表明，经环氧虫啶和吡虫啉处理后，会诱导苜蓿蚜体内 GSTs 和 P450s 活力发生改变，且诱导程度存在差异。
昆虫体内解毒代谢酶对环氧虫啶的代谢情况还有待进一步研究，以便为其交互抗性预测和田间推广应用提供依据。而以环氧虫啶为代表的桥环顺硝烯新烟碱化合物，由于其结构的独特性而表现出了对靶标害虫较高的活性，因此进一步研究其在生物体内的生化代谢机制，将有助于新烟碱类杀虫剂的设计研发。
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