2016, Vol. 18
2. 贵州大学 贵州山地农业病虫害重点实验室, 贵阳 550025;
3. 贵州省农产品质量安全监督检验测试中心, 贵阳 550004
2. The Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management in Mountainous Region, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
3. Guizhou Provincial Supervision and Testing Center for Agricultural Product Quality Supervision, Guiyang 550004, China
小菜蛾Plutella xylostella为十字花科蔬菜主要害虫，初龄幼虫取食叶肉，留下表皮，在菜叶上形成透明斑，3~4龄幼虫可蚕食菜叶。由于发生世代多，世代重叠现象严重，繁殖速度快，导致防治困难[1-2]。目前小菜蛾防治仍以化学防治为主，但长期大量、频繁地用药，导致其对多种杀虫剂已产生了抗药性。自Ankersmit首次报道小菜蛾在印度尼西亚对DDT产生约7倍的抗性以来，小菜蛾已对各种类型杀虫剂产生了不同程度的抗药性，几乎涉及所有的防治用药[3-5]。而昆虫体内的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多功能氧化酶系(MFOs)等代谢酶介的解毒作用在一定程度上参与了小菜蛾对杀虫剂的抗药性[6-8]。
乙基多杀菌素(spinetoram)是一种新型高效的广谱性农用抗生素，由多杀菌素经化学结构修饰后衍生而成(结构式见图式1)。与多杀菌素相比，乙基多杀菌素具有光稳定性好、杀虫活性好、持效期长、杀虫谱广、用量更少及对有益生物如蜜蜂等影响更小等特点[9-10]，而且有研究表明，乙基多杀菌素为低抗性风险药剂，目前已替代多杀菌素被广泛用于小菜蛾的防控[11]。
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图式1 多杀菌素(A)和乙基多杀菌素(B)结构式 Scheme1 Structures of spinosad (A) and spinetoram (B) |
杀虫剂施用于田间后，受到施药环境的影响或昆虫体内酶系的作用，其毒力会随时间延长而逐渐递减至亚致死剂量。药剂量低，不足以使昆虫死亡，但会使昆虫的生态行为、生育历期、生殖力和抗性发生改变，即产生亚致死效应，进而引起害虫的再猖獗[12-13]。乙基多杀菌素在田间使用后对小菜蛾同样可能存在亚致死效应，但目前尚未见相关报道。本研究采用叶片浸渍法，比较了乙基多杀菌素和多杀菌素对小菜蛾的毒力；分析了低剂量乙基多杀菌素处理与代谢酶(CarE、GST和MFOs)之间的量化关系，以期寻找小菜蛾解毒酶对低剂量乙基多杀菌素的应激效应，为了解乙基多杀菌素在田间的作用方式以及有效防治小菜蛾提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试昆虫小菜蛾Plutella xylostella敏感种群，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组惠赠，置于25 ℃±5 ℃、相对湿度60%~70%、光照L/D=16 h/8 h的养虫室内饲养，幼虫用无虫甘蓝苗连续饲养，成虫用10%蜂蜜水补充营养。目前在本实验室已经饲养15代，期间未接触任何杀虫剂。
1.2 供试药剂和仪器60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂(SC)和25 g/L多杀菌素(spinosad)悬浮剂(SC)(商品名菜喜)，美国陶氏益农公司；乙酸-α-萘酯(1-naphthyl acetate，化学纯)、固蓝B盐(Fast Blue B)、98%毒扁豆碱(eserine)和十二烷基硫酸钠(SDS，电泳级)，均为Sigma公司产品；牛血清白蛋白组份五(Albumin Fraction V)，Roche公司；考马斯亮蓝G-250 (Coomassie Brilliant Blue G-250)，BBI公司；α-萘酚(α-naphthol)，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；99%EDTA，Amresco公司；L-谷胱甘肽(还原型)(L-glutathione, Reduced)，纯度 > 99.5%，Rocha公司；2, 4-二硝基氯苯(CDNB，化学纯)和对硝基苯酚(4-nitrophenol，分析纯)，北京化学试剂公司；NADPH还原型辅酶II (NADPH Coenzyme II reduced)，Rocha公司产品；二硫苏糖醇(DTT)，Merck公司；苯硫脲(PTU)，上海化学试剂公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)，BBL公司；对硝基苯甲醚(p-nitroanisole)，化学纯，北京试剂厂。
UV 22800型紫外-可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；Sigma 3K15型冷冻离心机(BMH Instruments Co. LTD，德国)。
1.3 毒力测定参照Zhao等[14]的叶片药膜法。用含体积分数为0.05% Triton X-100的蒸馏水分别配制乙基多杀菌素稀释药液(质量浓度分别为0.0125、0.025、0.05、0.1和0.2 mg/L)。取新鲜无农药污染的甘蓝叶片，清洗后分别浸于上述药液中10 s，以蒸馏水(含体积分数为0.05%的Triton X-100)处理为对照。将处理后的叶片晾干，接大小一致的小菜蛾3龄幼虫(2~3 mg/头)。每浓度3次重复，每重复接20头幼虫，置于人工气候箱内，分别于24、48和72 h调查结果。数据用Polo软件处理，计算LC25、LC50值及其95%置信区间。
1.4 低剂量乙基多杀菌素浓度的确定根据毒力测定结果，分别配制乙基多杀菌素LC50和LC25浓度药液，以含体积分数为0.05% Triton X-100的蒸馏水处理为对照，采用与1.3节相同的方法处理小菜蛾3龄幼虫，分别于24、48和72 h调查幼虫死亡数，计算存活率和校正死亡率。验证上述结果，以此确定乙基多杀菌素的低剂量浓度。
1.5 低剂量乙基多杀菌素处理后小菜蛾解毒酶活性测定根据毒力测定结果，以48 h后的LC25和LC50值作为低剂量浓度，以含体积分数为0.05% Triton X-100的蒸馏水为对照，共3个处理。取新鲜无农药污染的甘蓝叶片，在两个低剂量多杀菌素药液中浸渍10 s，室温下晾干，分别置于塑料杯(7.0 cm × 7.0 cm)中，分别接入大小一致、已饥饿4 h的小菜蛾3龄幼虫(2~3 mg/头)，每处理共200~300头幼虫，分别饲喂6、12、24、48和72 h后取活虫制备酶液。
1.5.1 CarE活性测定参照Hama等[15]的方法进行。称取处理后的小菜蛾20 mg，分别加入pH 7.0、0.04 mol/L的磷酸缓冲液(PBS) 1 mL，冰浴匀浆，于4 ℃、9000 r/ min离心10 min，取上清液，稀释10倍后作为工作酶液。以α-萘酚为底物(其中含毒扁豆碱10-4 mol/L)，在30 ℃水浴中反应15 min后加入1 mL显色液[V (1%固蓝B盐水溶液) : V (5% SDS水溶液)=2 : 5]待反应完全后，在波长600 nm下测定OD值。每处理重复3次。建立α-萘酯标准曲线。同样以α-萘酚为底物，加入酶液，30℃水浴振荡15 min，加入1 mL显色液，室温下静置30 min，测定OD600值，重复3次。以酶量(μL)为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制酶活力曲线，测定工作酶液的蛋白质含量，计算CarE活性[mmol/(L·mg·30 min)]。
1.5.2 GST活性测定按照尹显慧等[16]改进后的方法进行。以CDNB为底物，在酶催化下形成谷胱甘肽-S芳基复合体，在340 nm处出现最大吸收峰。取20 mg各处理小菜蛾幼虫，加入pH 7.0、0.04 mol/L的PBS 1 mL，冰浴匀浆。于4 ℃ 、9 000 r/min离心60 min，取上清液稀释到适当浓度，作为工作酶液。向试管中分别加入2.4 mL 0.066 mol/L的PBS、0.3 mL 0.05 mol/L的谷胱甘肽(GSH)、0.1 mL 0.03 mol/L的CDNB和0.2 mL工作酶液，立即混匀，在27 ℃、340 nm下测定并记录5 min内的OD变化值。测定工作酶液的蛋白质含量，计算GST的活性[∆OD340/(min·mg pro)]。
1.5.3 MFOs活性测定参照Yu等[17]的方法，取处理后存活幼虫40 mg，置于1 mL 0.1 mol/L、 pH 7.8的PBS (含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU和1 mmol/L PMSF)中，冰浴匀浆。在4 ℃、12 000 r/min下离心10 min，取上清液再次离心30 min，再取上清液800 μL，用蒸馏水定容至3 mL，作为待测酶液。
反应体系为2 μmol/L的对硝基苯甲醚1.5 mL、9.6 mmol/L的NADPH 0.15 mL和酶液1.35 mL，在30 ℃下静置30 min后测定工作酶液的蛋白质含量。在405 nm下比色，用对硝基酚的生成量表示酶活力[μmol/(L·mg pro·30 min)]。
1.6 蛋白含量测定参照Bradford考马斯亮蓝G-250方法[18]。
1.7 统计分析采用SPSS18.0软件对各种酶活力测定结果进行单因素方差分析，用Turkey法进行多重比较(P=0.05)。
2 结果与分析 2.1 乙基多杀菌素和多杀菌素对小菜蛾的毒力从表 1可以看出：与多杀菌素相比，乙基多杀菌素杀虫活性高，见效快。χ220.05, 3=7.81，表中所有方程χ2均小于该值，说明所有方程符合实际。48 h后多杀菌素对小菜蛾3龄幼虫的LC50、LC25值分别是乙基多杀菌素的13.16和14.29倍。说明乙基多杀菌素对敏感小菜蛾的毒力优于多杀菌素，尤其是用药后2~3 d毒力更高。
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表 1 乙基多杀菌素和多杀菌素对小菜蛾3龄幼虫的毒力 Table 1 Toxicity of spinetoram and spinosad to the third instars of Plutella xylostella |
2.2 低剂量乙基多杀菌素浓度的确定
选用48 h的LC25和LC50浓度作为试验剂量处理敏感小菜蛾3龄幼虫。经过反向试验，即配制0.018和0.048 mg/L的乙基多杀菌素药液及清水对照，分别处理小菜蛾3龄幼虫，24、48和72 h各处理的存活率见图 1。可以看出，48 h后校正死亡率分别为24.58%和51.12%，接近预计死亡率，因此以该浓度作为乙基多杀菌素的低剂量浓度。
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图 1 乙基多杀菌素不同浓度处理后小菜蛾的存活率 Fig. 1 Survival of P. xylostella in different concentrations of spinetoram treatment group |
2.3 低剂量乙基多杀菌素对小菜蛾解毒酶活性的影响 2.3.1 CarE活性
低剂量乙基多杀菌素浓度处理对小菜蛾CarE活性有一定的影响，酶活力范围在2.318~6.254 mmol/(L·mg pro·30 min)之间，波动曲线呈峰形且范围较大。从图 2A可以看出：6~24 h，乙基多杀菌素处理组CarE活性高于对照，且均呈先升后降趋势；6~12 h，LC25和LC50浓度处理组CarE活性高于对照，表现为激活作用，12 h时LC50浓度CarE活性达到最大值，为6.250 mmol/(L·mg pro·30 min)；24~72 h，对照组CarE活性均高于LC25和LC50浓度处理组，表现为抑制作用。总体说来，经低剂量乙基多杀菌素处理后，小菜蛾CarE活性变化波动较大，并且具有一定的时间效应。
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图中数据为3次独立重复的平均值±标准差，同一时间点不同处理间标注不同小写字母表示在P=0.05水平上差异显著(Turkey's)。 Data were shown as mean±SD. The date at same time point followed with different small letter were significantly different at P=0.05 (Turkey's). 图 2 低剂量乙基多杀菌素对小菜蛾解毒酶活性的影响 Fig. 2 Effect of low dose spinetoram on specific activity of the detoxifying enzymes in P. xylostella |
2.3.2 GST活性
从图 2B可以看出，对照组、LC25和LC50浓度处理组GST活性在6~72 h的变化范围分别在0.408~0.584、0.605~1.520和0.537~0.947 ∆OD340/(min·mg pro)之间。其中LC25浓度处理的GST活性逐渐升高，在72 h达到最大值，为1.52 ∆OD340/(min·mg pro)，分别是CK、LC50浓度处理的2.71倍和1.60倍；LC50浓度处理的GST活性在48 h时达到最大值，远高于CK及LC25浓度处理。总体来看，用低剂量乙基多杀菌素处理小菜蛾后，GST活性总体变化趋势比对照组高，经过方差分析，酶活性数据间差异显著，说明低剂量乙基多杀菌素对小菜蛾体内GST具有激活作用。
2.3.3 MFOs活性用LC25和LC50浓度乙基多杀菌素处理小菜蛾后，其MFOs活性随时间变化的范围分别在0.424~1.207和0.658~1.506 μmol/(L·mg pro·30 min)之间。如图 2C所示：对照组在24 h内活力上升，随后降低，到48 h后又呈上升趋势；LC50浓度处理的MFOs活性与对照变化趋势基本一致；而LC25浓度处理48 h内，酶活性呈上升趋势，但在48 h后MFOs活性下降。经低剂量乙基多杀菌素处理后的72 h内，除在48 h时相差不大外，其他时间小菜蛾体内MFOs活性均明显低于对照组，说明低剂量乙基多杀菌素对MFOs具有抑制作用。
3 结论与讨论乙基多杀菌素是3'-ethoxy-5, 6-dihydro spinosyn J和3'-ethoxy spinosyn L的混合物，即多杀菌素结构中的鼠李糖基3-位由天然的甲基醚转变为了乙基醚；尽管比多杀菌素只多了一个亚甲基，但其活性却提高了数倍[9, 19]。本研究通过比较两种药剂对小菜蛾3龄幼虫的毒力，验证了相同条件下乙基多杀菌素的杀虫活性远远高于多杀菌素这一结论。
通过测定解毒酶、保护酶、靶标酶活性等生化指标来研究杀虫剂的亚致死效应，已成为近年来预测害虫产生抗药性或再猖獗可能性的重要内容[20-21]。Rumpf等[22]明确提出，酶活性可以作为一种生物标记来测定杀虫剂的亚致死效应。据报道，用亚致死剂量溴氰虫酰胺处理甜菜夜蛾幼虫后，短时间内羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶可被激活参与对药剂的代谢，之后随取食量增加，酶活性逐渐被抑制，表现出明显的剂量效应[23]；亚致死浓度氰氟虫腙可通过诱导4种P450基因mRNA的上调表达而增强小菜蛾多功能氧化酶的活性[24]。
多杀菌素类杀虫剂作为防治农业上常见鳞翅目、双翅目、鞘翅目、缨翅目和同翅目等多种害虫的高效药剂，其作用机制、亚致死效应和抗药性演化备受研究者的关注[9, 11, 16]。王光峰等[25]报道，多杀菌素在活体条件下能增强虫体内CarE活性，从而降低害虫对杀虫剂的敏感度。本研究发现，低剂量乙基多杀菌素处理后，小菜蛾体内CarE活性与时间呈相关性，从3龄幼虫开始到处理后72 h内，CarE活性变化波动较大，呈先激活后抑制，同时与CK相比差异不显著，与前文报道的亚致死浓度多杀菌素对小菜蛾解毒酶活性的影响结果一致[16]。贾变桃等[26]也有类似发现，亚致死浓度虱螨脲进入小菜蛾幼虫体内后，初期可诱导解毒酶活力升高，以适应外界毒害的影响，但随着时间的延长，解毒酶活力被抑制，使药剂难以被代谢，从而增强了对小菜蛾的毒性。
龚佑辉等[27]发现，西花蓟马敏感种群经亚致死浓度多杀菌素选育36代后，其体内GST比活力有上升趋势，其亚致死种群解毒酶活力的动态调节能力要强于敏感种群。本研究也发现，用低剂量(LC25和LC50)乙基多杀菌素处理小菜蛾后，GST活性总体趋势高于对照组，说明小菜蛾体内GST对乙基多杀菌素的解毒代谢已经发挥作用。但Wang等[28]报道，甜菜夜蛾对多杀菌素抗性和敏感种群3龄幼虫GST的活性影响无差异，说明不同药剂对不同种类昆虫及昆虫不同发育龄期GST活性的影响是不同的。
乙基多杀菌素处理棉铃虫会引起多功能氧化酶(MFOs)活性升高[29]。而本研究采用乙基多杀菌素LC50和LC25剂量处理小菜蛾3龄幼虫后，与对照相比，MFOs活性受到了不同程度的抑制，且表现出一定的浓度和时间效应，这与魏辉等[30]对多杀菌素的研究结果一致，说明经低剂量乙基多杀菌素处理后，小菜蛾体内MFOs活性被抑制。但尹飞等[31]却发现，MFOs活性在抗性种群与敏感种群间差异不显著，GST和CarE活性随着小菜蛾对乙基多杀菌素抗性的升高而增强，这与本研究中小菜蛾在低剂量乙基多杀菌素胁迫下GST活性变化的趋势一致，但与CarE和MFOs活性的变化趋势不一致，说明乙基多杀菌素对小菜蛾体内解毒酶活性的影响随着抗性的变化而变化。
总之，亚致死剂量杀虫剂对昆虫体内酶活性的作用目前还没有统一定论，其原因可能是作用方式和作用机理不同的杀虫剂对特定解毒酶的影响不同，还可能与杀虫剂摄入量、害虫个体耐药性、群体抗药性强弱等有直接关系[13]。另外，目前多数报道对这些解毒酶活性的测定都是在药剂短期胁迫下或抗性水平较低时进行的，因此，有关小菜蛾对低剂量乙基多杀菌素的适应机制及解毒酶是否参与对乙基多杀菌素的抗性等仍需进一步研究。
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