农药学学报  2016, Vol. 18 Issue (3): 402-406   PDF    
引用本文
周蓓蕾, 管文辰, 章虎, 王新全, 徐浩, 王强 . 高效液相色谱-串联质谱法检测多菌灵在啤酒加工过程中的残留量变化[J]. 农药学学报, 2016, 18(3): 402-406,doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2016.0056   
ZHOU Beilei, GUAN Wenchen, ZHANG Hu, WANG Xinquan, XU Hao, WANG Qiang . Fate of carbendazim residue during beer brewing process by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Pesticide Science, 2016, 18(3): 402-406, doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2016.0056   
高效液相色谱-串联质谱法检测多菌灵在啤酒加工过程中的残留量变化
周蓓蕾1,2, 管文辰3, 章虎2, 王新全2, 徐浩2, 王强2     
1. 江苏省农业科学院 食品质量安全与检测研究所, 南京 210014;
2. 浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所, 杭州 310021;
3. 浙江省温州市农业科学研究院 分析测试中心, 浙江 温州 325006
收稿日期: 2015-06-19    录用日期: 2016-03-28.
基金项目: 浙江省自然科学基金资助项目（LY15B070002）；浙江省植物有害生物防控重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地资助项目
作者简介: 周蓓蕾, 女, 硕士研究生, E-mail:zhoubl1620@163.com ;
*王强, 通信作者（Author for correspondence）, 男, 博士, 研究员, 研究方向为农产品安全, E-mail:qiangwang2003@sina.com
摘要: 利用高效液相色谱-串联质谱对啤酒加工过程中多菌灵残留变化进行研究，建立了大麦、干麦芽、麦糟、协定麦汁、定型麦汁和啤酒中多菌灵残留的检测方法。运用QuEChERS方法，大麦、麦芽和麦糟样品用6 g无水硫酸镁和1.5 g醋酸钠提取，150 mg无水硫酸镁、50 mg C18和50 mg PSA净化；协定麦汁、定型麦汁和啤酒样品用去离子水稀释后经C18固相萃取柱净化。经高效液相色谱-串联质谱测定。结果表明：在0.01~0.5 mg/kg添加水平下，多菌灵的平均添加回收率在72%~99%之间，相对标准偏差小于9%，定量限为0.01 mg/kg。采用所建立的方法测得多菌灵在各样品中的残留量分别为：大麦1.99 mg/kg、麦芽2.71 mg/kg、麦糟0.41 mg/kg、协定麦汁1.37 mg/kg、定型麦汁1.34 mg/kg和啤酒0.12 mg/kg。样品经糖化、煮沸和发酵后，其中的多菌灵残留量总体呈下降趋势，其加工因子分别为0.51、0.98和0.089，其中发酵过程对多菌灵的去除率最高。
关键词: 高效液相色谱-串联质谱     多菌灵     啤酒     加工过程     残留    
Fate of carbendazim residue during beer brewing process by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
ZHOU Beilei1,2, GUAN Wenchen3, ZHANG Hu2, WANG Xinquan2, XU Hao2, WANG Qiang2     
1. Institute of Food Safety and Inspection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
2. Institute of Agricultural Products Quality Standard, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;
3. Analytical & Testing Center of Wenzhou Agricultural Science Academy, Wenzhou 325006, Zhejiang Province, China
Abstract: Fate of carbendazim residue during the beer brewing process was determined by the high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The simultaneous determination of carbendazim in different samples (barley, malt, spent grain, agreement wort, finalize wort and beer) were developed. For barley, malt and spent grain samples, the QuEChERS method was used for the pretreatment. 6 g MgSO4 and 1.5 g NaAc were used for the extraction, and 150 mg of MgSO4, 50 mg C18 and 50 mg PSA were used for the purification. Agreement wort, finalize wort and beer samples were directly diluted with deionized water and then purified with C18 solid phase extraction column. The main results are presented as followed: The mean recoveries varied from 72% to 99% and the relative standard deviations (RSD) was less than 9%. The limit of quantitation was 0.01 mg/kg. The residues of carbendazim is 1.99 mg/kg in barley, 2.71 mg/kg in malt, 0.41 mg/kg in spent grain, 1.37 mg/kg in agreement wort, 1.34 mg/kg in finalize wort and 0.12 mg/kg in beer. During saccharification, boiling and fermentation processes, the residue of carbendazim has been reduced with the processing factor 0.51, 0.98 and 0.089, respectively. The removal efficiency of fermentation was the highest.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry      carbendazim      beer      process      residue     

啤酒因营养丰富，含有人体自身不能合成的8种氨基酸、多种维生素和较高的热能，被称为“液体面包”，且因其口感风味独特，成为风靡全球的饮料，近年来中国啤酒产销量已位居全球第一[1-2]。啤酒生产原料大麦易发生赤霉病、白粉病等病害，生产中常用多菌灵等杀菌剂进行防治[3]。但杀菌剂的不当使用，会造成其在大麦中的残留量超标，进而影响啤酒的品质与饮用安全[4]。因此有必要研究其在啤酒加工过程中的残留变化。Cuppen等[5]研究发现，多菌灵在水中的降解半衰期可长达6~25周，对动植物及人体有一定的危害性。孔志强等[6]研究了啤酒加工过程中敌敌畏和马拉硫磷的残留变化，以及多菌灵在苹果中的分布与加工成浓缩苹果汁过程中的变化规律。Inoue等[7]研究了啤酒发酵过程中300多种农药残留的变化，结果发现，大部分农药经发酵微生物作用后都得到降解，其降解程度与农药自身的辛醇-水分配系数有关。Navarro等[8-12]研究表明，若大麦原料中残留农药，经出芽和烘烤后依旧会存在于麦芽粉中，而啤酒花及麦芽中的农药亦会存在于麦芽汁中。目前，关于多菌灵在啤酒加工过程的残留变化未见研究报道，在大麦中施用后是否会在啤酒中残留尚不清楚。为了保证啤酒的饮用安全，本研究针对多菌灵在制麦、糖化和发酵等啤酒加工关键步骤中的残留变化进行研究，以期明晰大麦使用多菌灵后在啤酒中的蓄积情况，为评估多菌灵对人体健康风险和在啤酒中残留限量标准的制定提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 药剂与仪器

98%多菌灵(carbendazim)标准品(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH)；50%多菌灵可湿性粉剂(山东鑫星农药有限公司)；C18固相萃取小柱(500 mg，6 mL，迪马科技有限公司)；C18填料(40目，380 μm)和乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(40目，380 μm)(天津艾杰尔科技有限公司)；乙腈和甲醇均为色谱纯；氯化钠和无水硫酸镁均为分析纯。

液相色谱-串联质谱仪和TSQ Quantum Mass Spectrometer System(美国ThermoFinnigan公司)；ZF-60发芽箱(上海能共实业有限公司)；H-22恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)；LS-B50L立式圆形压力蒸汽灭菌锅(上海医用核子仪器厂)；BIOBASE生物安全柜(苏州净化有限公司)；LRH-150F生化培养箱(上海天呈实验仪器制造有限公司)。

1.2 试验方法 1.2.1 样品前处理方法

麦芽和麦糟样品：称取6 g样品(精确至0.01 g)于50 mL聚丙烯离心管中，先加入9 mL水，再加入20 mL乙腈，涡旋振荡2 min；加入6 g无水硫酸镁和1.5 g醋酸钠，涡旋振荡30 s，于6 000 r/min下离心5 min；取上清液1 mL于2 mL聚丙烯离心管(内含150 mg无水硫酸镁，50 mg C18和50 mg PSA)中，涡旋30 s，于7 000 r/min下离心3 min；取上清液0.5 mL于1.5 mL聚丙烯离心管中，加入0.5 mL去离子水混匀，过0.22 μm有机滤膜，待测[13]。

啤酒、协定麦汁和定型麦汁样品：将样品过0.45 μm滤膜后，分别准确量取20 mL，加入80 mL去离子水，配成100 mL混合溶液；依次用5 mL甲醇和5 mL去离子水活化C18固相萃取柱后，取100 mL样品以2 mL/min的速率淋洗柱，弃去淋出液，再用10 mL去离子水淋洗并弃去淋出液，加压抽干；用10 mL甲醇洗脱被测物，收集全部洗脱液于10 mL刻度管中，用弱氮气吹至约1 mL，再加入1 mL去离子水混匀，过0.22 μm有机滤膜，待测[14]。

1.2.2 检测条件

色谱条件：Lux Cellulose-3色谱柱(150 mm×2.0 mm，3 μm)；柱温30 ℃；流动相为V(乙腈): V(0.1%甲酸水溶液)=50 : 50；流速0.25 mL/min；进样量5 μL。在此条件下多菌灵的保留时间为1.68 min。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描；多反应监测(MRM)模式，其定性离子和定量离子的选择及碰撞能量见表 1；喷雾电压4 000 V；毛细管温度350 ℃；雾化气和气帘气为氮气；碰撞气为氩气(0.2 Pa)。

表 1 定性离子和定量离子的选择及碰撞能量 Table 1 Screening of qualitative ions and quantitative ions and the collision energy

1.2.3 标准溶液配制及标准曲线绘制

采用外标法定量。准确称取0.01 g多菌灵标准品(精确到0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配成1 000 mg/L的标准储备液；准确量取1 mL标准储备液(精确到0.01 mL)于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释，配成40 mg/L的母液，再梯度稀释成0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05和0.5 mg/L的系列标准工作溶液，按1.2.2节的条件测定。以样品质量浓度(x)为横坐标，对应的峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 添加回收试验

在空白干麦芽、麦糟、协定麦汁、定型麦汁和啤酒中分别添加0.01、0.1和0.5 mg/kg 3个水平的多菌灵标准工作溶液，每个水平重复5次，按本研究所建立的方法进行提取、净化及测定，计算添加平均回收率和相对标准偏差(RSD)。

1.3 田间试验

大麦田间试验地点设在浙江省嘉兴市秀洲区小麦高产创建万亩示范田。在有代表性的大麦种植地设置试验小区，每小区面积30 m2，3次重复，小区间设保护行，同时设空白对照小区。各小区种植条件一致，采用一次性施药和一次性采收的方法。50%多菌灵可湿性粉剂按推荐高剂量1 800 g/hm2，对水喷雾。于施药7 d后取样测定。采用五点取样法，每小区取样约10 kg。

1.4 啤酒加工过程

参照谷方红等[15]的工艺流程：制麦→糖化→协定麦汁→定型麦汁→啤酒发酵。

1.5 加工因子的计算

加工因子(processing factor,PF)可以直观地反映加工过程对农产品中农药残留的影响，即农药残留量的浓缩或稀释。当PF=1时，表明加工过程对农药残留的水平无影响；当PF <1时，表明加工过程会降低农产品中农药残留的水平；当PF >1时，表明加工过程会对农产品中农药残留产生浓缩效应[16-18]。根据公式(1)计算加工因子。

(1)
2 结果与讨论 2.1 标准曲线

结果表明：在0.001~0.5 mg/L范围内，多菌灵的质量浓度与对应的峰面积间呈良好的线性关系，线性方程为y=9.1×107x –5 587.8，R2=0.999 8，满足农药残留分析的要求[18]。定量限(LOQ)为0.01 mg/kg。

2.2 方法的准确度和精密度

结果(表 2)表明：在0.01~0.5 mg/kg 3个添加水平下，多菌灵在大麦及啤酒加工中的回收率和相对标准偏差(RSD)均符合农药残留分析标准的要求[19]。

表 2 多菌灵在样品中的平均添加回收率及相对标准偏差(n=5) Table 2 The average recovery and RSDs of carbendazim in the samples(n=5)

2.3 多菌灵在啤酒加工过程中的残留量变化

笔者对田间收获的大麦，啤酒加工过程中得到的干麦芽、麦糟、协定麦汁、定型麦汁和啤酒中残留的多菌灵进行了检测。结果(表 3)显示：多菌灵在啤酒加工过程中的残留量呈下降趋势。田间收获的大麦中多菌灵的残留量为1.99 mg/kg，而处理后的干麦芽中其残留量增加至2.71 mg/kg，这可能是由于大麦在烘干处理过程中蒸发水分，质量变轻，而多菌灵的含量变化不大，从而导致其含量升高。糖化处理后，部分多菌灵随麦糟流走，导致其在协定麦汁中的残留量高于麦糟中的。在制作定型麦汁的过程中由于需要加入一定量的水分，致使农药浓度被稀释，造成了多菌灵浓度降低。在发酵过程中，加入的微生物可能对多菌灵有降解作用，另外，发酵的外界环境有益于微生物的生长，促进了微生物对多菌灵的降解作用，使得啤酒中多菌灵的残留量远远低于定型麦汁中的。目前已报道的多菌灵降解菌有红城红球菌[20]、罗尔斯通氏菌[21]和短小芽孢杆菌[22]。其中，罗尔斯通氏菌在无机盐培养基中加入酵母膏后的降解率大大增强[16]。在发酵过程中添加酵母和水后对多菌灵的降解起到了促进作用，因而多菌灵的降解率最大，但具体是何种菌种还需要进一步研究确定。

表 3 多菌灵在啤酒不同加工阶段中的残留量变化 Table 3 Residues of carbendazim in the different processing stages(n=3)

2.4 啤酒加工过程对多菌灵残留量的影响

在大麦制干麦芽过程中，加工因子为1.36，说明该加工过程中，多菌灵的浓度是增加的。大麦从田间采收后，水分充足，在制作干麦芽过程中，经反复浸水断水、发芽、干燥，制成干麦芽。多菌灵为脂溶性杀菌剂，在制成干麦芽过程中浓度会升高。啤酒加工的糖化、煮沸和发酵3个阶段中，其加工因子分别为0.51、0.98和0.089。从中可以看出，发酵过程对多菌灵的去除率最高。糖化和煮沸过程中，温度升高，但是多菌灵性质稳定，降解率不大。

3 结论

本研究建立了用HPLC-MS/MS测定大麦、干麦芽、麦糟、协定麦汁、定型麦汁和啤酒中多菌灵残留的分析方法，该方法重现性好、灵敏度高，准确度和精密度符合农药残留分析的要求。在啤酒加工过程中多菌灵残留量呈下降趋势，说明啤酒加工过程可以有效地降低多菌灵的残留量。

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