农药学学报  2016, Vol. 18 Issue (3): 317-322   PDF    
引用本文
陈娥, 张等宏, 王丹丹, 金辉, 李秀壮, 何小凤, 燕志强, 沈慧敏 . 三种酚酸类化合物对莴苣幼苗的化感作用及机理初探[J]. 农药学学报, 2016, 18(3): 317-322,doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2016.0043   
CHEN E, ZHANG Denghong, WANG Dandan, JIN Hui, LI Xiuzhuang, HE Xiaofeng, YAN Zhiqiang, SHEN Huimin . Allelopathic effect and mechanism of action of three phenolic acids on lettuce seedlings[J]. Chinese Journal of Pesticide Science, 2016, 18(3): 317-322, doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2016.0043   
三种酚酸类化合物对莴苣幼苗的化感作用及机理初探
陈娥1, 张等宏1, 王丹丹2, 金辉2, 李秀壮2, 何小凤2, 燕志强2, 沈慧敏1     
1. 甘肃农业大学草业学院, 兰州 730070;
2. 中国科学院兰州化学物理研究所/中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室, 兰州 730000
收稿日期: 2015-10-09    录用日期: 2016-04-07.
基金项目: 国家自然科学基金项目 (31300290，21302195)；甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目 (GNSW-2015-25)
作者简介: 陈娥, 女, 在读硕士研究生, E-mail: 1960086871@qq.com ;
*燕志强, 通信作者 (Author for correspondence), 男, 副研究员, 主要从事植物化学生态学研究, E-mail: yanzq@licp.cas.cn
沈慧敏, 共同通信作者 (Co-author for correspondence), 女, 教授, 主要从事生物农药开发利用和害虫抗药性研究, E-mail:ndshm@gsan.edu.cn
摘要: 化感物质通过植物体释放到农田土壤中，可对作物生长造成严重影响。酚酸是一类重要的化感物质，由于其相对分子质量小，结构稳定，因而不易降解而累积在土壤中，进而影响作物生长，是引起连作障碍问题的一类主要化合物。为了明确酚酸类物质对植物生长影响的途径，探讨其化感作用机理，以3种结构相似的化合物——苯甲酸、水杨酸和对羟基苯甲酸为研究对象，以莴苣幼苗为活性受体，通过测定化合物对莴苣幼苗根、茎生长的影响，评价了其对植物的毒活性；并借助于荧光显微镜，通过 FDA/PI 双染色法和 DHE 染色法，分别研究了3种酚酸类化合物对受体植物根尖细胞活力和活性氧积累的影响。结果表明：3种酚酸类化合物对莴苣幼苗根、茎的生长均表现出低浓度促进、高浓度抑制的作用模式；莴苣幼苗在高浓度酚酸的胁迫下，其体内活性氧大量积累，高浓度的活性氧对莴苣幼苗细胞膜结构等具有显著的破坏作用，进而导致细胞活力降低甚至凋亡，最终抑制植物生长。
关键词: 苯甲酸     水杨酸     对羟基苯甲酸     莴苣     化感作用机理    
Allelopathic effect and mechanism of action of three phenolic acids on lettuce seedlings
CHEN E1, ZHANG Denghong1, WANG Dandan2, JIN Hui2, LI Xiuzhuang2, HE Xiaofeng2, YAN Zhiqiang2, SHEN Huimin1     
1. Pratacultural College, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
2. Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources of CAS and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China
Abstract: Allelochemicals are released into the farmland soils by plants, which will affect the growth of other plants. Phenolic acids are one kind of important allelochemicals. Due to their small molecular weight and stable structure, phenolic acids are hardly decomposed in nature. Thus they would accumulate in the soil, and affect the crop production during a long period of time. In fact, phenolic acids are the main compounds causing the problem of continuous cropping obstacle. In order to evaluate the allelopathic effect and study the mechanism of action of phenolic acids, the allelopathic effects of benzoic acid, salicylic acid and 4-hydroxybenzoic acid were assayed using lettuce as the receptor. In addition, the influence on the cell viability and reactive oxygen species (ROS) accumulation of lettuce roots by the phenolic acids were studied with FDA/PI double staining and DHE staining, respectively. The results showed that the phenolic acids promoted the root and shoot elongation at low concentrations, and exhibited inhibitory effects at high concentrations. Moreover, under high concentrations, the above three allelochemicals could induce the accumulation of ROS. High concentrations of ROS might cause membrane structural damage and then influenc the cell viability, which will ultimately result in the growth inhibition of lettuce seedlings.
Key words: benzoic acid      salicylic acid      4-hydroxybenzoic acid      lettuce      allelopathic mechanism     

化感作用 (allelopathy) 是植物将其在代谢活动中所产生的化感物质，通过茎叶挥发、茎叶淋溶、根系分泌以及植物残株的腐败降解等途径释放到环境中，进而对周围其他植物或微生物造成有利或不利的影响[1-4]。酚酸类化合物是一类重要的化感物质，广泛分布在农田土壤中，对农业生产造成了严重的影响[5-8]。研究表明，酚酸类化感物质能够影响植物生长[9-11]，是引起农业生产中连作障碍的主要因素之一[12-13]。例如，由草莓根系分泌并累积的苯甲酸和对羟基苯甲酸等物质，是导致草莓植株生长不良、根部病害加重、产量和品质严重下降的主要因素[14-16]；从化感水稻品系 PI312777的根系分泌物中鉴定出的水杨酸具有化感活性作用[17]。这3种酚酸被释放后能够进入作物的根际土壤中，例如：盆栽草莓土壤中对羟基苯甲酸的含量为1.74 mg/kg[18]；甜瓜根系周围中苯甲酸的含量为0.14 mg/kg，水杨酸含量为0.33 mg/kg[19]；苹果连作园0~30 cm 土层春季苯甲酸含量为6.670 mg/kg，水杨酸含量为5.870 mg/kg，对羟基苯甲酸含量为0.530 mg/kg，而秋季土壤中上述3种化合物的含量是春季的5倍左右[20]，对苹果的生长发育有自毒作用[21-23]；黑龙江省大豆重茬5 a 土壤中对羟基苯甲酸的含量为8.58 mg/kg[24]；连作2年的地黄土壤中对羟基苯甲酸的含量为1.40 mg/kg[25]。以上研究表明，苯甲酸、水杨酸和对羟基苯甲酸能够在农田土壤中大量积累，对作物生长产生明显的化感作用。

虽然苯甲酸、水杨酸和对羟基苯甲酸很早就被确定为化感物质，并发现这些化合物对草莓、水稻和甜瓜等作物生长具有抑制作用，是导致连作障碍的重要因素，然而有关其影响受体植物生长的活性作用途径尚未完全明确。本研究选用对化感物质敏感的双子叶植物莴苣为受体材料，在评价3种酚酸类化合物对莴苣幼苗化感作用的同时，运用植物细胞和生理试验方法，初步探讨了该类化合物对受体植物的化感作用机理。

1 材料与方法 1.1 供试材料及仪器

苯甲酸、水杨酸和对羟基苯甲酸，纯度均为95%，购于上海迈瑞尔化学技术有限公司。二氢乙锭 (dihydroethidium,DHE)，纯度95%；荧光素二乙酸酯 (fluorescein diacetate,FDA)，纯度98%；碘化丙啶 (propidium iodide,PI)，纯度95%；以上3种试剂均购于百灵威科技有限公司。二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide,DMSO)，纯度99.8%；丙酮，纯度99.5%；氯化钙 (CaCl2)，纯度99%；以上3种试剂均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。莴苣 (Lactuca sativa) 种子品种为‘丰农青笋’，购于兰州丰农种业科技有限公司。

HP150HS 恒温恒湿培养箱 (武汉瑞华仪器设备有限责任公司)；DMI4000B 荧光显微镜 (德国 Leica 徕卡显微公司)。

1.2 化感作用测定方法

参照 Yan 等[26]的方法，先用 DMSO 将苯甲酸、水杨酸和对羟基苯甲酸溶解并分别配制成100 mmol/L 的母液，再用 DMSO 进行梯度稀释。按体积分数为1% 的量将其添加到含1 mL 蒸馏水的6孔板中，摇匀后铺垫2层与孔径一样大小的滤纸，备用。以相同剂量的 DMSO 为对照。将莴苣种子置于铺有滤纸并湿润、直径为9 cm 的培养皿上，在恒温恒湿培养箱中25 ℃ 下无光照萌发24 h。选取长势大致相同的莴苣幼苗，转移到上述准备好的6孔板中，每个处理至少8株幼苗，在相同条件下继续培养48 h 后，用毫米尺测量幼苗根、茎长度。

1.3 细胞活力观察

将处理后的莴苣幼苗在根尖处切取约0.5 cm，放入含有 FDA 和 PI 的染液中，避光着色10 min，再用蒸馏水将根尖残留的染液清洗干净，置于载玻片上，在荧光显微镜下分别在450~490 nm 激发光和520 nm 发射光下观察并拍照[27]。

1.4 活性氧累积的测定

参考 Garnczarska[28] 的方法观察活性氧 (reactive oxygen species,ROS)。在25 ℃ 下，将处理后的莴苣根放入 DHE 染色液 (含10 mmol/L DHE,0.01% 丙酮和100 mmol/L CaCl2,pH 4.75) 中避光染色5 min，转移至100 mmol/L CaCl2 中振荡清洗去除残留染料，在荧光显微镜下分别在450~490 nm 激发光和520 nm 发射光下观察拍照。

1.5 数据处理

所测的数据用 Excel 2007处理，用 SPSS 17.0进行相关性分析，用 Duncan 氏法进行方差显著性分析，用 Photoshop 8.0进行图片处理。

2 结果与分析 2.1 苯甲酸、水杨酸及对羟基苯甲酸对莴苣幼苗的化感效应

结果 (表 1) 显示：苯甲酸在1 μmol/L 及以下浓度时对莴苣幼苗根的生长具有促进作用，在0.1 μmol/L 时促进作用可达到23.68%；10 μmol/L 及以上浓度时对根的生长具有抑制作用，1 000 μmol/L 时抑制率为56.02%。苯甲酸对茎的生长均具有较为明显的抑制作用，1 000 μmol/L 时的抑制率为31.21%。水杨酸在1 μmol/L 及以下浓度时对根、茎的生长均有明显的促进作用，其中在1 μmol/L 时其对根、茎的促进率分别为24.02% 和14.08%，但在10 μmol/L 及以上时则表现出抑制作用，其中在1 000 μmol/L 时其对根、茎的抑制作用最强，分别达到38.05% 和28.55%。对羟基苯甲酸在0.1 μmol/L 时对根和茎的生长均有一定的促进作用；在1 μmol/L 时对根具有促进作用，而对茎具有抑制作用；在10~100 μmol/L 时对根和茎的抑制率均为30% 左右，在1 000 μmol/L 时抑制作用最强，分别为54.72% 和35.10%。

表 1 苯甲酸、水杨酸和对羟基苯甲酸对莴苣幼苗的化感活性作用 Table 1 The allelopathic effects of benzoic acid, salicylic acid and 4-hydroxybenzoic acid on lettuce seedlings

2.2 苯甲酸、水杨酸及对羟基苯甲酸对莴苣幼苗根尖细胞活力的影响

当植物受到外界胁迫时，细胞活力会发生变化，因此，细胞活力可以作为评价有毒物质诱导植物细胞死亡的重要指标[28]。本研究采用双荧光染料染色法检测莴苣幼苗经过酚酸处理后的细胞活力变化情况。FDA 能够使活细胞着色，PI 能使死细胞着色，在荧光显微镜下能够观察到莴苣根尖细胞活力。结果显示：在处理2 d 后，苯甲酸在0.1和1 μmol/L 时，其染色结果与对照基本一致 (图 1，A~C)，说明苯甲酸在此浓度下不会使根尖细胞丧失活力，而在10~1 000 μmol/L 时红色区域有所增加 (图 1，D~F)，说明苯甲酸在此浓度下能使莴苣根尖细胞活力降低，导致部分细胞死亡。水杨酸在0.1~10 μmol/L 时对莴苣根尖细胞活力影响不明显 (图 1，G~J)，而当浓度升高到100 μmol/L 及以上时，莴苣根尖红色区域则明显增多，说明水杨酸在高浓度时对受体植物细胞活力有明显影响 (图 1，K~L)。对羟基苯甲酸在0.1 μmol/L 时与对照相比，不能使受体植物细胞活力丧失 (图 1，M)，而在1 μmol/L 时红色区域开始出现 (图 1，N)，在10~1 000 μmol/L (图 1，P~R) 时红色区域增加明显，说明丧失活性的细胞明显增多。

A~F 为苯甲酸、G~L 为水杨酸、M~R 为对羟基苯甲酸对莴苣细胞活力变化的影响，浓度依次为0、0.1、1、10、100和1 000 μmol/L，标尺为500 µm。
A-F, G-L and M-R were the cell viability of lettuce root tips treated by benzoic acid, salicylic acid and 4-hydroxybenzoic acid at the concentrations of 0, 0.1, 1, 10, 100 and 1 000 μmol/L, respectively. Bar=500 μm. 图 1 苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸对莴苣幼苗根尖细胞活力的影响 Fig. 1 The influence of cell viability of lettuce root tips by benzoic acid, salicylic acid and 4-hydroxybenzoic acid, respectively

2.3 苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸对莴苣幼苗根部活性氧积累的影响

采用 DHE 荧光染料特异性显示活性氧积累的部位及程度[29]。结果显示：莴苣幼苗经苯甲酸处理2 d 后，其根部的活性氧随苯甲酸浓度的增加有一定程度的积累 (图 2，A~F)，其中低浓度 (0.1 μmol/L) 下与对照组差异不明显 (图 2，A)，当浓度达到1~1 000 μmol/L 时活性氧逐渐积累 (图 2，B~F)。经水杨酸处理2 d 后的莴苣幼苗根部活性氧，随水杨酸浓度的增加也有一定程度的积累 (图 2，G~L)，其中在0.1~10 μmol/L 时活性氧累积程度与对照无明显差异 (图 2，G~J)，在100 μmol/L 时明显增加(图 2，K)，在1 000 μmol/L 时累积量达到最大 (图 2，L)。经对羟基苯甲酸处理2 d 后，莴苣根部活性氧也有一定程度的积累 (图 2，M~R)，其中在0.1~1 μmol/L 时活性氧累积程度与对照无明显差异 (图 2，M~O)，但在10~1 000 μmol/L 时明显增加 (图 2，P~R)。

A~F 为苯甲酸、G~L 为水杨酸、M~R 表示对羟基苯甲酸对莴苣活性氧的影响，浓度依次为0, 0.1, 1, 10, 100和1 000 μmol/L，标尺为200 µm。
A-F, G-L and M-R were the ROS of lettuce root tips treated by benzoic acid, salicylic acid and 4-hydroxybenzoic acid at the concentrations of 0, 0.1, 1, 10, 100 and 1 000 μmol/L, respectively. Bar=200 μm. 图 2 苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸对莴苣根尖活性氧积累的影响 Fig. 2 The influence of ROS accumulation of lettuce root tips by benzoic acid, salicylic acid and 4-hydroxybenzoic acid, respectively

3 讨论

活性氧 (ROS) 是外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧化合物的总称，包括超氧阴离子 (O2-)、过氧化氢 (H2O2)、羟自由基 (HO·)、一氧化氮 (NO) 等。目前认为 ROS 不仅是一种毒性分子，而且具有很高的生物学活性[29-31]。植物在胁迫条件下，体内产生高反应性 ROS，ROS 在细胞内可引起生物膜过氧化损伤，破坏膜结构和功能，并使受体植物体内的抗氧化系统受到抑制，从而影响细胞活力，甚至造成细胞凋亡，最终导致受体植物生长被抑制或死亡[32]。

本研究通过对苯甲酸、水杨酸及对羟基苯甲酸的化感活性进行评价，明确了3个化合物对莴苣幼苗生长均表现出低浓度促进、高浓度抑制的作用模式，进一步运用植物细胞和生理学研究方法对其作用机理进行了探索，发现活性氧在这一过程中发挥了重要作用。化感物质能够引起活性氧的积累，且当抑制作用增强时，活性氧的累积也更加明显，同时细胞活力明显降低。根据本研究结果，可初步推测此类物质的化感作用途径为：通过诱导受体植物 ROS 大量积累，进而影响细胞活力，最终抑制植物生长。本研究通过对酚酸类化合物化感作用机理的初探，为作物连作障碍机制研究提供了一定的理论依据。

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