烟草赤星病(tobacco brown spot)是烟草生长中、后期发生的一种由链格孢属交链格孢菌(烟草赤星病菌)Alternaria alternata(Fr.)Keissl^[1]引起的真菌性病害。该病害具有间歇性和爆发性的特点，严重时烟叶发病率可高达90%，使烤烟质量下降1~2个等级，重病区减产、减收达50%以上^{[2, 3]}。近年来，烟草赤星病一直是严重威胁贵州省烟草生产的主要病害之一。

链格孢属植物病原真菌种类较多，种间遗传变异大^{[4, 5]}。化学防治是目前控制该类病害最为经济有效的方法^{[6, 7]}。现阶段中国烟草赤星病防治的主要药剂为菌核净。近年来，嘧菌酯及醚菌酯等新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂已陆续被登记用于防治链格孢属真菌病害^{[8, 9, 10]}，但目前尚未在中国烟草上取得使用登记。氟硅唑、异菌脲和多菌灵是生产中广泛使用的广谱性杀菌剂，但在烟草赤星病防治方面也鲜有报道^[6]。本研究以菌核净为对照药剂，测定了氟硅唑、异菌脲、多菌灵、嘧菌酯及醚菌酯对烟草赤星病菌菌丝生长和孢子萌发的毒力，以期为烟草赤星病防治筛选高效的替代药剂。

采用常规马铃薯培养基(PDA)。

在贵州省从未使用过测试药剂的烤烟种植区采集烟草赤星病病害样品，参照祖艳青等^[11]的方法从烟叶上分离病原菌，根据菌落特征、产孢表型、分生孢子形态和分子鉴定结果鉴定为烟草赤星病菌A.alternata，随机挑选4株[ZF1和ZF2(采自贵州省贞丰县烟草产区)，2(采自贵州省烟草科学研究院龙岗实验基地)，6(采自贵州省烟草科学研究院福泉实验基地)]进行抑制活性测定。各菌株置于4 ℃下、PDA培养基上保存。

95.30%氟硅唑(flusilazole)原药(南通柯林化学品有限公司)；96%醚菌酯(kresoxim-methyl)原药(盐城福利德化工有限公司)，96.80%嘧菌酯(azoxystrobin)原药[先正达(中国)投资有限公司]。将3种药剂分别溶于甲醇，配成1.0×10⁴ mg/L的母液。96%多菌灵(carbendazim)原药(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)，溶于0.2 mol/L的稀盐酸，配成1.0×10⁴ mg/L的母液。90%菌核净(dimethachlon)原药(浙江禾益农化有限公司)，97.30%异菌脲(iprodione)原药(泰安圣聚华有限公司)，均溶于丙酮，配成1.0×10⁴ mg/L的母液。旁路氧化途径抑制剂水杨肟酸(SHAM，纯度99%)由美国Acros Organics公司生产，溶于甲醇配成1.0×10⁵ mg/L的母液。

用无菌水将6种杀菌剂母液稀释成系列浓度药液，于4 ℃黑暗条件下保存，备用。试验时将上述系列浓度药液加至50 ℃左右的PDA培养基中，制备含药平板。其中溶剂甲醇、丙酮或盐酸的体积分数均小于0.25%，预试验表明，此浓度的甲醇、丙酮与盐酸均不影响烟草赤星病菌菌丝生长和孢子萌发(数据略)。以无菌水中加入相同体积的甲醇、丙酮或稀盐酸处理作为空白对照。

各菌株在PDA培养基上活化培养至菌落直径接近2/3培养皿直径时，用打孔器在菌落边缘打取直径5 mm的菌饼。

供试菌株于28 ℃、黑暗条件下在PDA培养基上培养，9 d后在平板表面形成大量分生孢子。将分生孢子用无菌水洗脱、离心(1 000 r/min)，获得孢子悬浮液。用无菌水定容至每mL含1×10⁵个孢子，备用。

采用菌丝生长速率法^[12]。含药PDA平板中嘧菌酯和醚菌酯的系列质量浓度为0、3.13、6.25、12.5、25、50和100 mg/L，另设相同系列浓度嘧菌酯分别与100 mg/L水杨肟酸协同处理；多菌灵、氟硅唑及异菌脲的系列质量浓度为0、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5、5和10 mg/L；菌核净为0、0.63、1.25、2.5、5、10、20和40 mg/L。将直径5 mm的菌碟接种于直径9 cm、含系列浓度药剂的PDA平板上，每处理重复3次。接菌后将平板置于28 ℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养6 d后，采用“十字交叉法”测量各处理菌落直径，计算药剂对菌丝生长的抑制率。

参考Caten等^[13]所用的孢子萌发法。药剂用无菌去离子水稀释，氟硅唑和异菌脲的供试系列质量浓度为0、5、10、25、50、100和200 mg/L；菌核净为0、6.25、12.5、25、50和100 mg/L；多菌灵为0、15.13、31.25、62.5、125、250和500 mg/L；嘧菌酯和醚菌酯为0、1.25、2.50、5、10、20和40 mg/L，另设0、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5和5 mg/L嘧菌酯分别与100 mg/L水杨肟酸协同处理。分别将0.50 mL各浓度药液与0.50 mL孢子悬浮液混合均匀，取100 μL该混合液滴于载玻片上，置于保湿培养皿中，28 ℃、黑暗条件下培养12 h。当空白对照孢子萌发率达到90%以上时，检查各处理孢子萌发情况。以孢子芽管长度大于孢子的短半径时视为萌发。每处理重复3次，随机观察3个视野，调查孢子总数不少于200个，记录孢子萌发数及孢子总数，计算药剂对孢子萌发的抑制率。

采用Microsoft Excel 2010软件处理，以药剂质量浓度的对数为横坐标、抑制率几率值为纵坐标作图，得到毒力回归方程及有效抑制中浓度(EC₅₀)值。通过DPS(7.05)软件进行统计分析。

结果见表 1。在测试浓度范围内，除多菌灵外，其余各药剂对烟草赤星病菌菌丝生长均表现出了一定的抑制作用，但相互间活性存在差异，毒力由强到弱依次为氟硅唑>菌核净>异菌脲>嘧菌酯>醚菌酯；在100 mg/L水杨肟酸协同作用下，嘧菌酯的EC₅₀平均值为(40.73±16.43)mg/L，与嘧菌酯单独作用相比毒力提高了4倍，表明水杨肟酸对嘧菌酯的毒力测定具有显著的旁路氧化补偿作用。

表 1(Table 1)

表 1 供试6种杀菌剂对烟草赤星病菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用 Table 1 Inhibition activity of six fungicides against mycelial growth and conidial germination of A. alternata 药剂 Fungicide 菌株 Isolate 对菌丝生长的抑制作用 Inhibition effect of mycelial growth 对分生孢子萌发的抑制作用 Inhibition effect of conidial germination EC50/ (mg/L) EC50 平均值 Average value of EC50/(mg/L) 毒力回归方程 Toxicity regression equation 相关 系数 r EC50/ (mg/L) EC50 平均值 Average value of EC50/(mg/L) 毒力回归方程 Toxicity regression equation 相关 系数 r 菌核净 dimethachlon ZF1 0.30 1.13±0.68c y=1.96x+4.82 0.99 9.00 19.95±15.94bc y=1.37x+3.69 0.93 ZF2 1.97 y=2.61x+4.23 0.99 43.61 y=1.88x+1.92 0.91 2 1.16 y=1.93x+4.88 0.99 14.48 y=1.36x+3.42 0.96 6 1.08 y=2.01x+4.93 0.98 12.70 y=1.28x+3.59 0.96 氟硅唑 flusilazole ZF1 0.33 0.34±0.11c y=1.31x+5.63 0.98 48.98 53.14±17.32a y=6.32x-5.68 0.98 ZF2 0.43 y=1.89x+5.69 0.92 45.60 y=5.99x-4.94 0.96 2 0.41 y=1.53x+5.60 0.97 78.46 y=3.41x-1.47 0.98 6 0.18 y=1.09x+5.81 0.96 39.54 y=3.37x-0.38 0.99 异菌脲 iprodione ZF1 2.09 2.08±0.24c y=1.72x+4.45 0.98 27.80 23.33±11.33b y=4.18x-1.04 0.93 ZF2 1.75 y=1.83x+4.55 0.99 36.81 y=4.13x-1.46 0.98 2 2.18 y=1.76x+4.40 0.99 11.08 y=2.44x+2.46 0.98 6 2.30 y=1.98x+4.28 0.99 17.63 y=1.93x+2.60 0.99 嘧菌酯 azoxystrobin ZF1 237.3 203.95±66.46a y=0.91x+2.85 0.98 2.81 5.79±2.76cd y=1.21x+3.96 0.97 ZF2 129.6 y=0.39x+4.18 0.96 9.48 y=1.51x+3.52 0.97 2 278.2 y=0.67x+3.36 0.99 5.22 y=1.11x+4.21 0.98 6 170.8 y=0.55x+3.77 0.99 5.66 y=1.66x+3.75 0.95 嘧菌酯+ 100 mg/L 水杨肟酸 azoxystrobin+100 mg/L SHAM ZF1 42.11 40.73±16.43 bc y=0.54x+4.11 0.95 0.26 0.28±0.09 d y=2.73x+6.59 0.96 ZF2 63.42 y=0.48x+4.12 0.97 0.42 y=2.24x+5.83 0.97 2 30.19 y=0.83x+3.76 0.92 0.21 y=1.44x+5.94 0.98 6 27.22 y=0.88x+3.73 0.98 0.22 y=2.67x+6.73 0.99 醚菌酯 kresoxim-methyl ZF1 >100 >100a y=0.39x+3.57 0.98 7.12 11.93±3.93 bcd y=1.21x+3.96 0.99 ZF2 >100 y=0.33x+4.25 0.94 14.76 y=0.98x+3.85 0.98 2 >100 y=0.24x+4.13 0.97 15.49 y=1.29x+3.46 0.98 6 >100 y=0.22x+4.27 0.95 10.36 y=1.50x+3.48 0.97 多菌灵 carbendazim ZF1 无影响 No effect EC50>100 ZF2 2 6 注：表中数据为平均值±标准差；数据后不同字母表示采用Duncan′s新复极差法检验在P ≤ 0.05 水平差异显著 Note：Data in the table were expressed as average value±standard deviation; Mean values followed by the same letters in columns are not significantly different (P ≤ 0.05) according to Duncan′s new multiple range method.

表 1 供试6种杀菌剂对烟草赤星病菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用 Table 1 Inhibition activity of six fungicides against mycelial growth and conidial germination of A. alternata

相同杀菌剂处理下，烟草赤星病菌不同菌株间菌丝生长的敏感性存在差异，其中对菌核净的敏感性差异最大，其最不敏感菌株(ZF2)的EC₅₀值是最敏感菌株(ZF1)的6.57倍；其次是氟硅唑(2.39倍)；各菌株间对异菌脲、多菌灵、醚菌酯和嘧菌酯的敏感性差异均较小(表 1)。

结果见表 1。在测试浓度范围内，供试药剂对烟草赤星病菌分生孢子萌发均有一定的抑制作用。在100 mg/L水杨肟酸协同下，嘧菌酯的抑制作用最强，其EC₅₀平均值为(0.28±0.09)mg/L，而嘧菌酯单独作用时EC₅₀平均值为(5.79±2.76)mg/L，再次证明水杨肟酸对嘧菌酯毒力测定具有显著的旁路氧化补偿作用。其余药剂对烟草赤星病菌分生孢子萌发的毒力由强到弱依次为醚菌酯>菌核净>异菌脲>氟硅唑>多菌灵，抑制作用最差的为多菌灵，EC₅₀值均大于100 mg/L。

相同杀菌剂处理下，烟草赤星病菌不同菌株间分生孢子萌发的敏感性也存在差异，其中对菌核净的敏感性差异最大，其最不敏感菌株(ZF2)的EC₅₀值是最敏感菌株(ZF1)的4.85倍；其次为嘧菌酯(3.37倍)、异菌脲(3.32倍)、醚菌酯(2.18倍)、100 mg/L水杨肟酸协同下的嘧菌酯(2倍)和氟硅唑(1.98倍)(表 1)。

由于作用机制不同，不同种类杀菌剂对病原菌各生长发育阶段的作用不同。研究表明，与常用药剂菌核净类似，氟硅唑和异菌脲对烟草赤星病菌菌丝生长均有强烈的抑制作用(EC₅₀平均值小于2.50 mg/L)，而对其分生孢子萌发的抑制活性相对较差；而嘧菌酯和醚菌酯对分生孢子萌发的抑制作用较强(EC₅₀平均值均小于12 mg/L)，对菌丝生长的抑制活性较差(EC₅₀平均值均大于100 mg/L)。加入旁路氧化途径专性抑制剂水杨肟酸后，甲氧基丙烯酸酯类药剂的抑制作用会增强^{[10, 14]}。本研究中加入100 mg/L的水杨肟酸后，嘧菌酯对烟草赤星病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用均显著增强，且对孢子萌发阶段的影响较菌丝生长阶段明显，这可能与孢子萌发阶段需要更多的三磷酸腺苷(ATP)有关。此外，多菌灵对烟草赤星病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用均较差。本结果与严清平等^[7]、施永平等^[6]和刘霞等^[15]对其他链格孢属病菌的研究结果类似。

近年来，由于国内在烟草赤星病防治方面长期高浓度、高频率使用菌核净，已导致部分地区病原菌对其产生了较严重的抗药性^{[16, 17]}。本研究筛选的药剂中，嘧菌酯和醚菌酯虽然高效，但价格较贵，同时也存在一定的抗药性风险^[18]；氟硅唑和异菌脲虽然具有一定的活性，但却易出现残留量超标等问题^{[19, 20]}。因此，还需结合田间药效试验的防治效果及农药残留和抗药性等方面的研究，进一步对这4种药剂进行考察。