近年来，悬浮剂由于高活性、低成本和具有良好的环境相容性而得到广泛应用。农药悬浮剂组成复杂，一般包括润湿分散剂、黏度调节剂、防冻剂、消泡剂和防腐剂等组分，各组分之间的交互作用均会影响悬浮剂的稳定性^[1]。在悬浮剂配方研究中多采用正交设计^{[2, 3]}和三角坐标图法^[4]。然而采用这些方法虽然可以优化得到性能良好的悬浮剂配方，但不能有效地揭示不同助剂间的相互作用。响应面法(response surface method，RSM)是对多因素多响应试验进行分析和建模最有效的方法，已广泛应用于食品^{[5, 6]}及化学工程^{[7, 8]}中，近年来在农药制剂学领域也有报道^{[9, 10]}。响应面法最传统的试验设计是5水平的中心复合设计^{[6, 11]}和3水平的Box-Behnken设计^[5]。响应面法可以有效地应用于悬浮剂配方研究中^[12]，但采用中心复合设计优化3因素、4因素和5因素试验时，试验点可分别达到20、30和50个，Box-Behnken设计也高达17、29和46个，试验数相对较多。而将响应面法和均匀设计联用则可解决上述问题。

均匀设计具有试验点少(等于试验水平数)及代表性强的特点，将其与响应面法结合可以有效地优化多因素试验，极大地减少试验时间和成本^[7]。目前，将响应面法与均匀设计结合在飞航导弹、农业选种和化学工程等方面已取得良好的经济和社会效益^{[13, 14, 15]}。本研究以噻虫胺悬浮剂为模式制剂，在采用流点法确定润湿分散剂种类的基础上，联合均匀设计和响应面法，对30%噻虫胺悬浮剂配方进行了优化。分别采用二次多项式逐步回归和偏最小二乘(PLS)二次多项式回归模型拟合试验结果，考察了润湿分散剂和黏度调节剂对制剂热贮稳定性和悬浮率的影响，对预测得到的优化配方加以验证，并根据响应面法得到的规律对制剂配方进行了微调，以期为该优化策略在农药配方筛选中的应用提供参考。

95%噻虫胺(clothianidin)原药(河北威远生化农药有限公司)；润湿分散剂：NR1602(苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚，江苏省海安石油化工厂)和T2700(聚羧酸盐类润湿分散剂，美国Huntsman公司)；黏度调节剂：黄原胶(xanthan gum，淄博中轩生化有限公司)和硅酸镁铝(veegum，中材矿物材料公司)；防冻剂：乙二醇(天津科密欧化学试剂有限公司)；消泡剂：GP330(甘油聚氧丙烯醚，江苏省海安石油化工厂)。

RW20搅拌器(德国IKA公司)；Winner 2000B激光粒度分析仪(济南微纳颗粒仪器股份有限公司)。

根据流点法^[16]筛选出润湿性能良好的T2700和NR1602，其中T2700是聚羧酸盐类分散剂，自身的梳状结构赋予其有效的空间位阻，所带有的负电荷可以提供静电排斥作用；NR1602是非离子型乳化剂，属三苯乙烯基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚类(PEP)乳化剂，亲油性良好，低温条件下仍有良好的乳化能力。将二者配伍使用可有效提高制剂的分散和悬浮性能^[3]。黄原胶和硅酸镁铝是农药悬浮制剂中最常用的黏度调节剂，添加质量分数一般分别为0.1%～0.3%^{[2, 17]}和0.5%～2%^[4]，本研究选取二者作为试验因素，优化确定其用量。

采用湿法研磨：将31.58 g噻虫胺原药、一定质量的T2700、NR1602、黄原胶和硅酸镁铝(用量根据表 1确定)、2 g乙二醇和0.5 g GP330加入砂磨杯中，用去离子水补足至100 g。再加入100 mL氧化锆珠，于1 700 r/min下研磨1.5 h，即得30%噻虫胺悬浮剂。

表 1(Table 1)

表 1 均匀试验设计因素及水平 Table 1 Factors and levels of the uniform design 编号 No. T2700 NR1602 黄原胶 Xanthan gum 硅酸镁铝 Veegum 水平 Level 用量* Dosage/% 水平 Level 用量 Dosage/% 水平 Level 用量 Dosage/% 水平 Level 用量 Dosage/% U-1 1 1.00 7 1.40 8 0.21 6 1.40 U-2 6 2.25 1 0.40 7 0.20 7 1.60 U-3 9 3.00 3 2.00 4 0.17 5 1.20 U-4 4 1.75 6 1.20 1 0.14 4 1.00 U-5 8 2.75 5 1.00 9 0.22 3 0.80 U-6 3 1.50 4 0.80 5 0.18 9 2.00 U-7 7 2.50 8 1.60 2 0.15 8 1.80 U-8 2 1.25 2 0.60 3 0.16 2 0.60 U-9 5 2.00 9 1.80 6 0.19 1 0.40 注：*用量为质量分数。 Note: Dosage is displayed as wt. %.

表 1 均匀试验设计因素及水平 Table 1 Factors and levels of the uniform design

采用U₉(9⁴)均匀设计表，通过DPS 7.05软件优化得到均匀设计方案(表 1)。

准确称取16 g制剂样品密封于20 mL安瓿瓶中，于(54±2)℃恒温箱中处理。14 d后观察样品：若出现絮凝或结块现象，表明热贮物理稳定性不合格，无需进行下一步测定；若无絮凝或结块，则以热贮析水率表示热贮物理稳定性的优劣，热贮析水率越大则表明样品的物理稳定性越差。热贮析水率以贮存后样品析出水相的质量与样品总质量的比值表示。每个样品3次重复，结果取平均值。

采用激光粒度分析仪测定。3次重复，结果取平均值，即为平均粒径。

参照GB/T14825—2006《农药悬浮率测定方法》^[18]进行。

参照蔡梦玲等^[17]的方法进行。

运用DPS 7.05软件对试验数据进行统计和分析，平面图运用Sigmaplot 12.5绘制，3D响应面运用Matlab R2014a绘制，调用surfc函数(带等高线的三维表面图)。

试验结果发现：所有样品经热贮后未发现絮凝、结块或结底现象，且制剂均有良好的分散性和流动性。由表 2可知，U-1～U-9样品贮前悬浮率均在91%～96%之间，热贮14 d后样品的悬浮率轻微下降或无明显变化，悬浮率在90%～96%之间，符合悬浮剂质量控制的一般要求^[19]，可以满足实践需要，故本研究不对悬浮率进一步优化。样品的热贮析水率均在5%～16%之间，略偏高。大量研究表明，通过系统地分析均匀试验设计结果可以得到优化配方，但若试验次数少，则只能采用回归的方法分析试验数据，其中PLS和逐步回归是最常用的方法^[20]。本研究分别采用这两种方法对试验结果进行了统计分析，以期进一步获得热贮物理稳定性良好的优化配方。

表 2(Table 2)

表 2 热贮物理稳定性测定结果 Table 2 The experimental results of physical stability after hot storage 编号 No. 热贮析水率 Aqueous separation ratio after hot storage/% 悬浮率 Suspensibility/% 贮存前 Before storage 热贮后 After hot storage U-1 10.27 ± 0.09 c 95.08 ± 0.49 ab 94.65 ± 0.58 ab U-2 7.05 ± 0.16 e 93.92 ± 0.30 bc 93.76 ± 0.57 bc U-3 8.38 ± 0.15 d 93.76 ± 0.28 c 93.07 ± 0.50 cd U-4 15.14 ± 0.18 a 91.07 ± 0.35 e 90.40 ± 0.35 e U-5 5.37 ± 0.15 f 92.95 ± 0.50 cd 92.68 ± 0.09 cd U-6 10.76 ± 0.13 bc 93.19 ± 0.31 cd 92.71 ± 0.46 cd U-7 10.99 ± 0.16 b 95.45 ± 0.33 a 95.33 ± 0.25 a U-8 15.47 ± 0.29 a 93.99 ± 0.49 bc 93.87 ± 0.32 bc U-9 10.94 ± 0.12 b 92.28 ± 0.46 d 91.88 ± 0.46 d 注：表中数据为平均数 ± 标准误，同列数据后不同字母表示在 P < 0.05 水平差异显著 (Duncan 氏新复极差法)。 Note: Each data is the mean ± SE. Data with different lowercase letters are significantly different at P < 0.05 level by Duncan’s multiple range test.

表 2 热贮物理稳定性测定结果 Table 2 The experimental results of physical stability after hot storage

采用PLS二次多项式模型拟合试验结果，得到热贮析水率的预测方程为：

其中，A、B、C、D和Y分别代表T2700、NR1602、黄原胶、硅酸镁铝用量和热贮析水率。将表 1中各配方的助剂用量代入方程(1)，以得到的热贮析水率的预测值与测定值作图。由图 1可见：大部分试验点分布在回归线附近，模型的决定系数R²为0.941 1，表示仅有5.89%的变异不能被该模型解释，模型的拟合性良好^{[7, 21]}，可用于预测热贮析水率。运用Matlab R2014a软件fmincon函数计算得出T2700、NR1602、黄原胶和硅酸镁铝的质量分数分别为3% 、0.4% 、0.22%和0.4%时，样品的热贮析水率取最小值0.53%。

图 1

图 1 热贮析水率的预测值及测定值 Fig. 1 Predicted and experimental values of aqueous separation rate after the hot storage

由方程(1)虽然可以预测热贮析水率，但不能直观分析各试验因素对该指标的具体影响。而响应面法可以直观有效地揭示自变量间的交互作用，从而获得最优的响应值和相应的试验条件^[11]。因此本研究在控制两个自变量处于最优水平的条件下，研究了其余两个自变量对热贮析水率的影响。由图 2a可知，随T2700质量分数增加，热贮析水率显著减小；当T2700用量较低时，NR1602用量对热贮析水率影响不大，但随NR1602用量增加，热贮析水率有增大的趋势；当T2700用量较高时，其与NR1602之间的交互作用较明显，随NR1602用量增加，热贮析水率明显增大。随黄原胶用量增加，不论其余助剂如何变化，样品的热贮析水率均呈减小趋势(图 2b、2d、2f)，表明其具有良好的抗沉降效果。硅酸镁铝对制剂热贮稳定性的影响主要体现在交互作用的强弱，在其他助剂用量较低时，其影响并不明显(图 2c、2f)；而当其他助剂用量较高时，随硅酸镁铝用量增加，热贮析水率反而增大，在硅酸镁铝与NR1602的交互作用中，这一现象更加明显(图 2e)，这与前人报道^{[22, 23]}不一致。其原因可能是因为均匀设计试验次数少且偏最小二乘法引入的预测项过多，有5.89%的变异不能被预测模型解释，即预测模型不能兼顾所有的自变量，导致了预测偏差大。

图 2

图 2 热贮析水率的3D响应面和重叠等高线图 Fig. 2 3D surface plots and contour plots of the aqueous separation after hot storage

采用二次多项式逐步回归模型拟合试验结果，在α=0.10的置信水平上引入和剔除不显著变量，得到预测方程为：

其中，A、C、D和Y分别代表T2700、黄原胶、硅酸镁铝用量和热贮析水率。回归模型的决定系数R²=0.999 9。F=8 051.68>F_0.01(4,4)=15.98，P<0.000 1，达极显著水平；Durbin-Watson是检验残差分布的统计量，若残差不服从正态分布，则模型有偏差，上述回归方程的Durbin-Watson统计量d=2.07，偏离数值2不大，表明该模型有良好的解释能力^[24]。

对偏回归系数进行显著性检验，可以判断引入的拟合项对因变量Y的单独影响^[20]。由表 3可知，A(T2700)、C和CD(黄原胶、硅酸镁铝)对热贮析水率均有显著影响。因为本研究是在α=0.10的置信水平上引入和剔除不显著变量的，所以部分拟合项(D²)对热贮析水率的影响不显著，各自变量单独影响热贮析水率的顺序为A>C>CD>D²。

表 3(Table 3)

表 3 偏回归系数的t检验 Table 3 The t-test of partial regression coefficient 拟合项 Fitting term 偏回归系数 Partial regression coefficient t-值 t-value P-值 P-value r (Y, A) –0.999 8 109.48 <0.000 1 r (Y, C) –0.999 6 69.55 <0.000 1 r (Y, D2) 0.775 4 2.46 0.057 5 r (Y, CD) –0.989 6 13.74 <0.000 1

表 3 偏回归系数的t检验 Table 3 The t-test of partial regression coefficient

运用Matlab R2014a软件fmincon函数处理预测方程(2)可知，当T2700、黄原胶和硅酸镁铝质量分数分别为3% 、0.22%和2%时，热贮析水率取最小值2.16%。NR1602的用量与热贮析水率高低无关，考虑到经济成本，其用量取试验范围内的最小值(0.4%)即可。在控制A、C和D中的一个自变量处于最优水平下，研究其余两个自变量对热贮析水率的影响，其3D响应面和重叠等高线见图 3。由图 3可知，随T2700、黄原胶和硅酸镁铝用量增加，样品的热贮析水率均显著下降，其中T2700和黄原胶的影响最大，这与偏回归系数的显著性检验结果一致。在高用量下，黄原胶与硅酸镁铝的协同作用比低用量下明显(图 3c)，随硅酸镁铝用量增加，热贮析水率明显下降。

图 3

图 3 热贮析水率的3D响应面和重叠等高线图 Fig. 3 3D surface plots and contour plots of aqueous separation after hot storage

因为二次多项式逐步回归和PLS二次多项式模型均不能有效预测悬浮率试验结果(预测模型R²仅为0.7左右)，所以本研究只验证热贮析水率的优化结果。按照表 4中的配方，分别制备30%噻虫胺悬浮剂。采用上述两个模型优化的配方进行配制，其热贮析水率均低于5%，热贮后也未发现样品絮凝、结块或结底，且均具有良好的分散性和流动性。采用PLS二次多项式模型优化的配方进行配制，热贮前后样品的悬浮率分别为94.00%±0.27%和93.22%±0.59%；采用二次多项式逐步回归模型优化的配方进行配制，热贮前后样品的悬浮率分别为92.51%±0.25%和92.02%±0.46%。综上可知，两个配方均优于U-1～U-9处理，为优化配方，其中二次多项式逐步回归模型对热贮析水率的预测性更好，预测的相对标准偏差仅为-4.85%。因此，本研究中30%噻虫胺悬浮剂的最优配方为：3% T2700、0.4% NR1602、0.22%黄原胶和2%硅酸镁铝，此时制剂的热贮析水率最小，为2.27%±0.08%。在悬浮剂质量控制中一般认为热贮析水率低于5%^[3]即可，由响应面(图 3)可知，黄原胶和硅酸镁铝在最高用量下，当T2700的质量分数在2%～3%变化时，热贮析水率的变化相对较小，因此，作者设置了WT₁(表 4，只降低T2700用量)和WT₂(表 4，降低T2700用量并提高黄原胶用量)两个处理，结果表明，二者的热贮析水率均低于5%，且其他性能指标合格。

表 4(Table 4)

表 4 优化配方的验证结果 Table 4 The validation test of the optimized formula 优化模型源 Source of optimized model 各组分质量分数 Mass fraction of each component 热贮析水率 Aqueous separation after hot storage 预测值 Predicted value/% 实测值 Measured value/% 偏最小二乘二次多项式 Partial least squares quadratic polynomial 3% T2700; 0.4% NR1602; 0.22% 黄原胶; 0.4% 硅酸镁铝 3% T2700; 0.4% NR1602; 0.22% xanthan gum; 0.4% veegum 0.53 4.81 ± 0.12 逐步回归二次多项式 Stepwise regression quadratic polynomial 3% T2700; 0.4% NR1602; 0.22% 黄原胶; 2% 硅酸镁铝 3% T2700; 0.4% NR1602; 0.22% xanthan gum; 2% veegum 2.16 2.27 ± 0.08 WT1 2.5% T2700; 0.4% NR1602; 0.22% 黄原胶; 2% 硅酸镁铝 2.5% T2700; 0.4% NR1602; 0.22% xanthan gum; 2% veegum 3.66 3.50 ± 0.16 WT2 2% T2700; 0.4% NR1602; 0.23% 黄原胶; 2% 硅酸镁铝 2% T2700; 0.4% NR1602; 0.23% xanthan gum; 2% veegum 超出范围 Beyond the range 3.89 ± 0.12

表 4 优化配方的验证结果 Table 4 The validation test of the optimized formula

均匀试验设计只考虑试验点的高度均匀性，故其试验次数少(数目为试验因素的水平数)，也正因为忽略了试验点的整齐性，其方差分析无法通过常规的方法获得。线性回归、非线性回归和二次多项式回归是均匀试验设计中最常见的回归类型^[7]。对于交互作用不显著的试验，采用传统的多元线性回归或逐步回归即可实现良好的优化效果^[21]，但对于有明显多重共线性的试验，其优化能力较差^[25]。农药悬浮剂组成复杂，各助剂之间存在交互作用，而二次多项式考虑到了交互项，更易于建立可靠的预测模型^{[20, 26]}。PLS回归综合了多元线性回归、典型相关分析和主成分分析方法，可有效克服传统回归方法存在的诸多问题，特别适用于对样本点少的试验进行回归分析。逐步回归可以剔除对因变量影响不显著的拟合项，若拟合项的引入和剔除水平设置得当，可以获得精简且预测精度高的回归模型。二次多项式逐步回归和PLS二次多项式回归在食品^[27]、药剂学^[25]等领域已广泛应用于多因素试验的回归分析，表现出良好的预测精度，但在农药领域鲜有报道^[20]。本研究分别采用上述两个模型优化热贮析水率结果，经检验，两个预测配方均为优化配方，由于二次多项式逐步回归模型剔除了不显著项，其对热贮析水率的预测性更好。

本研究主要考察了热贮析水率、贮前悬浮率和热贮后悬浮率共3个因变量，但由于试验中各配方的悬浮率绝对数值差异不大，采用上述两个模型无法有效地预测热贮前后的悬浮率，因此本研究仅优化了热贮析水率。农药悬浮剂有多个质量指标，除了热贮稳定性、悬浮率外，还有分散性、起泡性、pH等，所以在筛选配方时可能会遇到需要设置多个因变量的情况。对于多因变量试验，可以采用PLS二次多项式回归，通过DPS软件设置合理的权重系数，即可得到折中的试验条件和相应的响应值。也可以引入渴望函数(desirability function)并通过Matlab软件绘制重叠等高线图(overlay plot)，获得多个响应值折中的目标区域。但值得注意的是，引入的因变量越多，回归模型的拟合性越差，若某因变量不是制剂的关键指标，可在优化前通过初步筛选先排除该因变量，如：本研究通过润湿分散剂种类的筛选，得到的U-1～U-9配方分散性和悬浮率都符合质量控制指标的要求，在后续配方优化的过程中就可以减少因变量数量，也更容易得到拟合度高的回归方程。

本研究在测定悬浮率时，样品稀释100倍后由于稀释液浓度较小，磨细的噻虫胺颗粒可近似认为是球状粒子，因此在不考虑颗粒间的相互作用时，可用Stokes公式近似估计粒子的沉降速率V。由于V与悬浮颗粒直径的平方呈正相关，可知，随粒子的粒径减小，其沉降速率显著降低。华乃震等^[1]指出，粒径为5 μm的颗粒在介质中沉降10 cm需4 d，而2 μm的颗粒则需26 d。本研究中的U-1～U-9样品经热贮后，虽然平均粒径均有不同程度增大，但均在1.1～1.8 μm之间(图 4b)，而且样品的粒度分布较窄，d₉₀在1.5～2.6 μm之间(图 4a)，d₁₀仅为0.6～1.0 μm(图 4c)，这可能是样品具有高悬浮率的主要原因。

图 4

图 4 热贮前后样品的粒度测定结果 Fig. 4 Experimental results of samples before and after hot storage

二次多项式逐步回归模型和PLS二次多项式模型均可用于预测农药悬浮剂热贮析水率，但不能有效地预测热贮前后样品的悬浮率。经验证，两个预测配方均为优化配方，样品的热贮析水率均低于5%，热贮前后样品的悬浮率均高于92%。其中二次多项式逐步回归模型对热贮析水率的预测性更好，相对标准偏差仅为-4.85%。配制30%噻虫胺悬浮剂的最优条件为：3% T2700、0.4% NR1602、0.22%黄原胶和2%硅酸镁铝，此时热贮析水率最小为2.27%±0.08%。根据响应面结果，适当降低T2700的用量，样品的热贮析水率仍低于5%，且其他性能指标变化不大。因此，均匀设计和响应面法联用优化悬浮剂配方具有良好的适应性，不仅可得到优化配方，而且可以根据实际需要，在制剂性能合格的条件下适当调整某些助剂的用量，以得到综合效益最佳的配方。

柴方堃等^[28]采用经验法筛选噻虫胺悬浮剂配方，首先需要确定助剂体系，随后筛选各助剂的合适用量，确定最佳配方，对4种助剂逐一筛选共需进行21次试验，试验盲目性较大。而本研究仅进行了9次试验，在筛选出最优配方的同时，明确了各助剂间的交互作用，最终得到的配方均为稳定配方。相比较而言，将均匀设计与响应面法联用筛选噻虫胺悬浮剂配方，可以显著减少试验次数，降低筛选成本；虽然在减少试验次数的同时增大了预测的不稳定性，但回归模型仍具有较高的预测性，同时能系统地考察各因素间的交互作用和对悬浮剂稳定性的影响，优点突出。因此，在农药配方筛选和其他工程设计领域，将均匀设计和响应面法联用具有逐步取代现有筛选方法的应用潜力，有希望在实际生产过程中占据主要位置，应用前景广阔。