农药学学报  2016, Vol. 18 Issue (2): 241-248   PDF    
长枝木霉Trichoderma longibrachiatum T6水分散粒剂的研制
景芳, 徐秉良, 梁巧兰, 张树武, 刘佳    
甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心, 兰州 730070
摘要: 以土壤中分离得到的一株拮抗菌——长枝木霉Trichoderma longibrachiatum T6为研究对象,通过优化培养基配方及助剂类型的筛选,成功研制了长枝木霉T. longibrachiatum T6水分散粒剂,并测定了其贮存稳定性。结果表明:制备长枝木霉T6水分散粒剂的最佳配方(质量分数)为:羧甲基纤维素(紫外保护剂)0.5%,碳酸钙(稳定剂)4%,聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,黏结剂)5%,可溶性淀粉(崩解剂)5%,凹凸棒土(载体)5%及十二烷基硫酸钠(润湿剂)5%。由此配方制备的水分散粒剂中孢子含量为5.6×108 cfu/g,悬浮率53%,pH值6.0,水分含量3.5%,湿润时间52 s,且在冷藏温度为(4±2)℃条件下的稳定性显著高于在室温(25℃)下的。各项检测结果均符合国家标准。
关键词: 木霉     水分散粒剂     培养基质     产孢量     稳定性    
Research and development of water dispersible granules of Trichoderma longibrachiatum T6
JING Fang, XU Bingliang, LIANG Qiaolan, ZHANG Shuwu, LIU Jia    
College of Grassland Science, Gansu Agricultural University/Ministry of Education Key Laboratory of Grassland Ecosystem/Gansu Province Key Laboratory of Pratacultural Engineering/Sino-US Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability, Lanzhou 730070, China
Abstract: The water dispersible granules of Trichoderma longibrachiatum T6 was developed. This antagonistic bacteria was isolated from field soil. The T. longibrachiatum T6 water dispersible granules were developed by optimizing media formulations and screening the aid types. And the storage stability was measured. The results indicated that the best formulation(mass fraction) was hydroxymethyl cellulose(UV protective agents) 0.5%, calcium carbonate(stabilizing agents) 4%, polyvinylpyrrolidone(PVP, binders) 5%, soluble starch(disintegrating agents) 5%, attapulgite(carriers) 5%, sodium lauryl sulfate(witting agents)5%. The quality detection showed that the spores production of T. longibrachiatum T6 water dispersible granules was 5.6×108 cfu/g, the suspension rate of the production was 53%, pH was 6.0, the moisture amount was 3.5%, the wetting time was 52 s, the stability in low temperature of(4±2)℃ was significantly higher than that at room temperature 25℃, which came up to the formulation standards.
Key words: Trichoderma spp.     water dispersible granules     culture medium     spores production     stability    

木霉菌(Trichoderma spp.)作为一种重要的生防菌,广泛存在于土壤、植物残体、植物根围、植物叶片、种子、球茎表面及动物粪便上[1]。近年来,已有相关报道表明,木霉菌对镰刀菌Fusarium spp.、腐霉菌Pythium spp.、疫霉菌Phytophthora spp.以及立枯丝核菌Rhizoctonia solani均有抑制作用[2],目前已被广泛应用于植物病害的生物防治中[3];此外,木霉菌还可促进植物生长和提高植物的抗病性[4, 5, 6]。将木霉植入基质制成的新型生物制剂,不仅含有有机质、氮、磷和钾等作物生长所必需的营养成分,而且含有大量的有益微生物,其代谢物质在土壤中繁殖,能起到改良土壤、促进植物生长以及防治病害等作用[7, 8],目前,木霉制剂的研发和应用已成为国内外研究的热点[9]。有关木霉商品化的制剂已有很多报道,如美国的Topshield(哈茨木霉T22)[10]和以色列的Trichodex(哈茨木霉T39)[11]等,这些制剂在植物病害防治中都已取得很好的防治效果,并起到了明显的增产作用;中国已成功研制的木霉制剂有特立克木霉可湿性粉剂[12]、绿色木霉L24菌株分生孢子可湿性粉剂[13]以及哈茨木霉T4厚垣孢子水分散粒剂[14]等。但由于中国目前在微生物制剂研究方面的投入相对较少,致使产业整体发展水平不高,技术创新不足,产品质量以及应用效果不稳定[15],且这些制剂的菌株主要以哈茨木霉菌和绿色木霉菌为主,对长枝木霉制剂的研究尚未见报道。本实验室从田间土壤中分离得到1株具有广谱抗病性的长枝木霉菌株T.longibrachiatum T6。研究发现:该菌株分生孢子悬浮液对小麦禾谷胞囊线虫Heterodera avenae的胞囊、卵和2龄幼虫均具有较强的致死作用[16, 17, 18];同时其对牧草种子发芽也有明显的促进生长作用[19]

鉴于水分散粒剂(water dispersible granule,WG)具有环境相容性好、有效成分含量高及悬浮率高等优点[20],本研究以长枝木霉T6作为研究对象,通过优化培养基质及助剂配方筛选,研制了其水分散粒剂,并测定了其相关指标及贮存稳定性,旨在为加快长枝木霉T6制剂的研制提供参考。

1 材料与方法 1.1 供试材料及仪器

长枝木霉T.longibrachiatum T6菌株(由甘肃农业大学植物病理学实验室提供)。

麦麸等基质(由甘肃省农科院食用菌研究室提供);99%炭黑(郑州正浩化工产品有限公司);99.3% β-环糊精(淄博千汇生物科技有限公司);99%抗坏血酸(VC,上海谱振生物科技有限公司);99%羧甲基纤维素(CMC,北京鼎丰基业生物科技发展有限公司);98%碳酸钙(天津市大茂化学试剂厂);96%聚乙烯基吡咯烷酮(PVP、木质素磺酸钠、十二烷基硫酸钠及十二烷基苯磺酸钠及聚乙烯醇(PVA)(天津市凯信化学工业有限公司);凹凸棒土、高岭土及硅藻土(上海中泰化学试剂有限公司)。

YK-90挤压造粒机(湖南省衡阳市一帆制药设备有限公司);恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司);食用菌罐头瓶(兰州华科生物有限公司)。

1.2 长枝木霉T6孢子悬浮液的制备

参照方中达[21]方法并加以改进。将低温保存的长枝木霉T6菌种活化后,打成直径为5 mm的菌块,接种于PDA培养基中,于28 ℃恒温培养箱中光照(24 h,10 000 lx)培养4 d后,加入10 mL无菌水并滴入0.05 mL吐温-80,缓慢摇晃,使分生孢子充分脱落,用无菌水将原液稀释成浓度为107 cfu/g的溶液,备用。

1.3 长枝木霉T6母药菌种的制备 1.3.1 液体菌种制备

取制备好的液体培养基(马铃薯200 g,葡萄糖20 g,MgSO4•7H2O 0.5 g,FeSO4•7H2O 0.007 5 g,MnSO4 0.002 5 g,ZnSO4 0.002 g,KH2PO4 3.83 g,NaNO3 1.42 g,(NH4)2SO4 1.1 g,CaC12 1 g,水1 000 mL[22])75 mL于150 mL三角瓶中,于1×105 Pa下高压灭菌30 min后,接入1 mL浓度为107 cfu/g的长枝木霉T6孢子悬浮液,在28 ℃、140 r/min摇床上培养5 d,备用。

1.3.2 固体菌种制备

m(麦麸): m(玉米渣)=3:1的固体基质置于食用菌罐头瓶中,厚度为4.5 cm,加入蒸馏水,使基质的质量分数为60%,拌匀后用8层纱布封口,于1×105 Pa下高压灭菌60 min[23]。冷却至室温后,接入占基质总质量20%的液体菌种,搅拌均匀,于28 ℃恒温培养箱中光照(24 h,10 000 lx)培养7 d后,置于30 ℃干燥箱中烘干。

1.4 长枝木霉T6母药的制备 1.4.1 最佳培养基质筛选

将腐熟的麦秸秆、牛粪、菇渣、草炭以及蛭石粉碎后过筛(孔径80 mm),分别按m(菇渣): m(牛粪): m(麦秸秆)=1 : 1 : 1、m(菇渣): m(牛粪): m(麦秸秆)=1 : 1 : 2、m(菇渣): m(牛粪): m(麦秸秆)=1 : 2 : 1、m(菇渣): m(牛粪): m(麦秸秆)=2 : 1 : 1及m(草炭): m(蛭石): m(牛粪)=1 : 1 : 1配制,置于食用菌罐头瓶中,厚度为4.5 cm,添加蒸馏水至基质的质量分数为60%,用8层纱布封口并灭菌。待瓶温冷却至室温,接入质量分数为50%的固体菌种,用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节pH值为5.6,于28 ℃恒温暗培养。每隔1 d搅拌通气,每个处理3次重复。20 d后测定长枝木霉T6的产孢量,以确定最佳基质。

1.4.2 长枝木霉T6母药制备

将50%固体菌种接入已筛选出的最佳基质中进行大量培养,得到长枝木霉T6母药。

1.5 长枝木霉母药中添加不同助剂对产孢量及孢子萌发率的影响

通过测定添加不同助剂对长枝木霉T6产孢量及孢子萌发率的影响,对助剂进行筛选。

1.5.1 产孢量测定

参考文献[21]方法。称取1 g在不同基质中培养的长枝木霉T6培养物或添加不同助剂的母药,用含0.1%吐温-80的无菌水稀释100倍,磁力搅拌器搅拌20 min后过滤,用血球计数板统计长枝木霉T6分生孢子的数量。每个处理3次重复。

1.5.2 孢子萌发率测定

参考文献[21]方法。用标准的PDB溶液将添加不同助剂的长枝木霉T6母药稀释成浓度为106 cfu/g的孢子悬浮液。以用PDA培养基所培养的分生孢子为对照。采用悬滴法测定。将0.1 mL已稀释好的长枝木霉孢子悬浮液置于盖玻片上,迅速将其翻转,盖于有凹面的载玻片上,放入铺有湿润滤纸的培养皿中。于28 ℃下暗培养17 h,在显微镜下测定孢子萌发率。每处理统计100个左右孢子,3次重复。

1.5.3 母药中添加助剂的筛选 1.5.3.1 紫外保护剂的筛选

称取10 g长枝木霉T6母药,分别添加炭黑、β-环糊精、抗坏血酸和羧甲基纤维素各0.05 g,搅拌均匀,置于波长254 nm紫外灯(20 W)下40 cm处照射5 min,于28 ℃培养箱中暗培养4 d,分别测定长枝木霉T6产孢量及其孢子萌发率。

1.5.3.2 稳定剂的筛选

称取10 g长枝木霉T6母药,分别添加碳酸钙、磷酸钾、羧甲基纤维素钠和磷酸氢二钾各0.4 g,搅拌均匀,热贮[(54±2)℃,4 d]试验后测定产孢量及其孢子萌发率。

1.5.3.3 黏结剂的筛选

称取10 g长枝木霉T6母药,分别添加淀粉、羧甲基纤维素、PVP和PVA各0.5 g,搅拌均匀,置于28 ℃培养箱中暗培养4 d,测定产孢量及其孢子萌发率。

1.5.3.4 崩解剂的筛选

称取10 g长枝木霉T6母药,分别添加可溶性淀粉、硫酸钠、尿素和硫酸铵各0.5 g,搅拌均匀,置于28 ℃培养箱中暗培养4 d,测定产孢量及其孢子萌发率。

1.5.3.5 载体的筛选

称取10 g长枝木霉T6母药,分别添加凹凸棒土、石英砂、高岭土和硅藻土各0.5 g,搅拌均匀,置于28 ℃培养箱中暗培养4 d,测定产孢量及其孢子萌发率。

1.5.3.6 湿润剂的筛选

称取10 g长枝木霉T6母药,分别添加木质素磺酸钠、十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸钠各0.5 g,搅拌均匀,置于28 ℃暗培养箱中培养4 d,测定产孢量及其孢子萌发率。

1.6 长枝木霉T6水分散粒剂制备

将长枝木霉T6母药用鼓风干燥机干燥制成母粉,在母粉中按照筛选好的比例添加紫外保护剂、稳定剂、崩解剂、载体及湿润剂等助剂,混匀后喷入黏结剂水溶液(5%),使含水量保持在35%左右。加入造粒机造粒,干燥,得到长枝木霉T6水分散粒剂。在能够满足颗粒强度前提下,尽可能地减少压力和控制产品直径(1~500 mm范围之内),并且在满足产品含水率的前提下,控制干燥时间和干燥温度[24]

1.7 制剂质量指标分析和贮存稳定性测定

参照国家标准方法分别测定水分散粒剂的悬浮率[25]、pH值[26] 、水分[27]及润湿时间[28]

分别称取100 g长枝木霉T6水分散粒剂在冷藏(4±2)℃和室温(25 ℃)条件下贮存,每隔30 d测定孢子萌发率,测定时长为9个月,以评估制剂的贮存稳定性。

2 结果与分析 2.1 最佳培养基质筛选

结果(图 1)表明:长枝木霉T6在由草炭、蛭石、牛粪、麦秸秆和菇渣等基质按不同配比制备的固体培养基中均可产生分生孢子。其中:在m(草炭): m(蛭石): m(牛粪)=1 : 1 : 1的基质(图 1E)中的产孢量最高,达7.12×108 cfu/g,与其他培养基上的产孢量差异显著(P<0.05);m(菇渣): m(牛粪): m(麦秸秆)=1 : 1 : 1(图 1A)的产孢量次之,为5.95×108 cfu/g;图 1BD培养基的产孢量最低。最终选用m(草炭): m(蛭石): m(牛粪)=1 : 1 : 1的基质作为长枝木霉T6的最优固体培养基质。这可能是由于草炭中含大量的有机质和腐植酸,当有机质被分解后,其分解物可成为微生物生长所需的养分,而腐植酸具有较强的吸附力,使基质具有较强的吸水性。

A. m (菇渣 mushroom residue) : m (牛粪 cow dung) : m (麦秸秆 wheat straw) = 1 : 1 : 1;B. m (菇渣 mushroom residue) : m (牛粪 cow dung) : m (麦秸秆 wheat straw) = 1 : 1 : 2;C. m (菇渣 mushroom residue) : m (牛粪 cow dung) : m (麦秸秆 wheat straw) = 1 : 2 : 1;D. m (菇渣 mushroom residue) : m (牛粪 cow dung) : m (麦秸秆 wheat straw) = 2 : 1 : 1;E. m (草炭 turf arid) : m (蛭石 vermiculit) : m (牛粪 cow dung) = 1 : 1 : 1。图上不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P < 0.05水平差异显著。
Different small letters in the figure showed significant difference at P < 0.05 level among the treatments by Duncan's new multiple range test.
图 1 不同培养基质中长枝木霉T6的产孢量 Fig. 1 Number of spore production of T. longibrachiatum T6 on different culture medium
2.2 不同助剂对长枝木霉T6产孢量和孢子萌发率的影响 2.2.1 紫外保护剂的影响

测定结果(表 1)表明:添加炭黑、β-环糊精、抗坏血酸和羧甲基纤维素4种紫外保护剂后,长枝木霉T6的产孢量和孢子萌发率均不同程度地高于对照,部分紫外保护剂之间存在显著差异。就产孢量而言,添加抗坏血酸和羧甲基纤维素的产孢量显著高于对照,分别为3.10×108 cfu/g和1.98×108 cfu/g,说明抗坏血酸和羧甲基纤维素对长枝木霉T6的产饱有显著的保护作用;就孢子萌发而言,添加4种紫外保护剂均可显著提高孢子萌发率,其中以添加羧甲基纤维素的最高,为83.3%。综合考虑,最终以羧甲基纤维素为紫外保护剂。

表 1 紫外保护剂对长枝木霉T6产孢量和孢子萌发率的影响 Table 1 Effect of UV-protective agents on number of spore production and spore germination rate
2.2.2 稳定剂的影响

结果(表 2)表明:4种稳定剂对长枝木霉T6的产孢量和孢子萌发率的影响存在较大差异。其中:添加碳酸钙的产孢量显著高于对照,说明该稳定剂对长枝木霉T6的产孢量具有促进作用;而羧甲基纤维素钠和磷酸氢二钾对产孢量有抑制作用。从孢子萌发率看,4种稳定剂中,添加羧甲基纤维素钠的孢子萌发率最高,为55.0%,其次是碳酸钙和磷酸氢二钾,分别为39.7%和37.0%。鉴于碳酸钙化学纯度高、化学惰性强,且热稳定性好,与长枝木霉T6具有较好的相容性,最终选用碳酸钙为稳定剂。

表 2 稳定剂对长枝木霉T6产孢量和孢子萌发率的影响 Table 2 Effect of stabilizing agents on number of spore production and spore germination rate
2.2.3 黏结剂的影响

结果(表 3)表明,供试的4种黏结剂对长枝木霉T6产孢量和孢子萌发率均有较大影响。就产孢量而言,除淀粉外,其他3种黏结剂对产孢量均有促进作用,其中添加PVP的处理产孢量最高,为4.02×108 cfu/g,添加PVA和羧甲基纤维素的次之;从孢子萌发率看,羧甲基纤维素和淀粉对孢子萌发率有抑制作用,而PVP对孢子萌发率则有明显促进作用,促进率达60.0%。说明PVP与长枝木霉T6有较好的相容性;另外,鉴于PVP具有较强的结合能力,可与不同化合物生成络合物而吸附在界面,在一定程度上可降低界面表面张力[29],故最终选用PVP为黏结剂。

表 3 黏结剂对产孢量和孢子萌发率的影响 Table 3 Effect of binders on number of spore production and spore germination rate
2.2.4 崩解剂的影响

崩解剂的主要作用在于消除因黏结剂或加压而形成的结合力,使其崩解。根据表 4可知,4种崩解剂对长枝木霉T6的产孢量和孢子萌发率的影响差异显著。就产孢量而言,可溶性淀粉对长枝木霉T6的产孢量有明显的促进作用,产孢量最高,为3.85×108 cfu/g,但是就孢子萌发率来看,却有抑制作用,说明添加可溶性淀粉的母药活孢率较低,相容性较差。其他崩解剂均对长枝木霉T6的孢子萌发率有促进作用,其中,以尿素的促进作用最大,为82.0%,硫酸钠次之。通过综合分析,可知尿素是最适的崩解剂。

表 4 崩解剂对产孢量和孢子萌发率的影响 Table 4 Effect of disintegrating agents on number of spore production and spore germination rate
2.2.5 载体的影响

表 5数据可见:在供试的4种载体中,除硅藻土对长枝木霉T6的产孢量有抑制作用外,其他3种载体均有不同程度的促进作用,其中凹凸棒土和高岭土对产孢量的促进作用最大,产孢量达到4.65×108 cfu/g,显著高于对照;石英砂次之。此外,凹凸棒土对长枝木霉孢子萌发的促进作用也最高,萌发率达55.0%;硅藻土次之,而石英砂和高岭土对其则有一定的抑制作用。此外,也有研究表明,凹凸棒土不仅能提高制剂利用率、改良土壤活性和调节土壤pH值、延长药效以及可提供植物生长的部分微量元素,而且添加该载体的制剂在田间应用上更具忍耐性[30]。综合考虑,本研究中最终选取凹凸棒土为载体。

表 5 载体对产孢量和孢子萌发率的影响 Table 5 Effect of carriers on number of spore production and spore germination rate
2.2.6 湿润剂的影响

制剂中添加润湿剂不仅能使药物分散度增大,制剂稳定性增强,而且有利于药物的释放、吸收和药效的增强[31]。本研究结果(表 6)表明,供试湿润剂对长枝木霉T6产孢量和孢子萌发率均有明显促进作用,其中,添加十二烷基硫酸钠的产孢量最高,达到2.12×108 cfu/g,添加十二烷基苯磺酸钠的次之;就孢子萌发率而言,除木质素磺酸钠对其有抑制作用外,其他两种湿润剂均具有显著促进作用,其中添加十二烷基硫酸钠的孢子萌发率最高,达71.0%。综合评价认为十二烷基硫酸钠是最好的湿润剂。

表 6 湿润剂对产孢量和孢子萌发率的影响 Table 6 Effect of witting agents on number of spore production and spore germination rate
2.3 最佳助剂配方下加工的长枝木霉T6水分散粒剂的相关指标及贮存稳定性

通过筛选,最终确定长枝木霉T6水分散粒剂中助剂的最佳配方(质量分数)为:羧甲基纤维素0.5%、碳酸钙4%、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)5%、可溶性淀粉5%、凹凸棒土5%和十二烷基硫酸钠5%。由此制备的长枝木霉T6水分散粒剂的孢子含量为5.6×108 cfu/g,悬浮率53%,pH值6.0,水分含量3.5%,湿润时间52 s,颗粒强度强,各项检测结果均符合国家标准。

将该制剂在室温25 ℃下贮藏9个月,其孢子萌发率为25.13%,显著低于冷藏条件[(4±2)℃]下的孢子萌发率(48.42%)(图 2)。可见,低温贮存更有利于菌种的保存和货架期的延长。

图 2 不同贮藏方式对长枝木霉T6水分散粒剂孢子萌发率的影响 Fig. 2 Spore germination rate of water dispersible granules of T. longibrachiatum T6 in different storage methods
3 结论与讨论

本研究筛选出了培养长枝木霉T6的最佳培养基质为1 : 1 : 1质量比的草炭、蛭石、牛粪。在木霉培养基质研究中,最早Lewis等[32]曾利用咖啡壳粉、可可壳粉、花生壳粉及石英砂加松锯末、玉米芯或麦麸皮为固体基质,朱辉等[33]在城市垃圾中加入30%的麦麸皮作为固体培养基质,王永东等[23]曾采用m(麸皮): m(玉米粉)=3 : 1的基质。用这些基质培养木霉,虽然能产生数目可观的木霉孢子,但基质多以淀粉为原料,且生产成本较高。因此,筛选易得、廉价且环保的材料作为培养木霉孢子的基质尤为重要[34]。目前,利用草炭、蛭石、牛粪等固体基质培养木霉的研究尚未见报道,本研究利用m(草炭): m(蛭石): m(牛粪)=1 : 1 : 1组成的固体基质培养的长枝木霉T 6,产孢量大、孢子萌发率高,同时还具有低投入、高产出、无污染的特点。

以产孢量及孢子萌发率为指标,通过对紫外保护剂、稳定剂、黏结剂、崩解剂、载体及润湿剂的筛选,确定了长枝木霉T6水分散粒剂的最佳助剂配方为:羧甲基纤维素0.5%、碳酸钙4%、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)5%、可溶性淀粉5%、凹凸棒土5%及十二烷基硫酸钠5%。由此制备的长枝木霉T6水分散粒剂的孢子含量为5.6×108 cfu/g,悬浮率53%,pH值6.0,水分含量3.5%,湿润时间52 s,颗粒强度强,制剂各项指标均达到国家水分散粒剂检测标准。贮存稳定性试验结果表明,低温贮藏的菌种稳定性及孢子萌发率更高,这与前人研究结果[35,36]一致。

本研究筛选了与长枝木霉T6母药配伍的生态环保型助剂,并首次将该菌株加工制备为水分散粒剂,为加快长枝木霉T6制剂的研制提供了依据。有关长枝木霉T6水分散粒剂的生物防治效果以及田间应用效果还有待进一步研究。

参考文献
[1] 王艳丽, 沈瑛, 徐同. 哈茨木霉防治水稻纹枯病研究[J]. 植物保护学报, 2000, 27(2):97-101.WANG Y L, SHEN Y, XU T. Study on Trichoderma harzianum strains to control of rice sheath blight[J]. Acta Phytophyl Sinica, 2000, 27(2):97-101.
[2] 薛宝娣, 李娟, 陈永萱. 木霉(TR-5)对病原真菌的拮抗机制和防病效果研究[J]. 南京农业大学学报, 1995, 18(1):31-36.XUE B D, LI J, CHEN Y X. Studies on antagonism of Tricoderma sp. against six pathogenic funga and biological control[J].J Nanjing Agric Univ, 1995, 18(1):31-36.
[3] 李淼, 檀根甲, 丁克坚, 等. 木霉菌在植物病原真菌生物防治上的研究与应用前景[C]//植物病理学研究进展. 沈阳:中国植物病理学会, 2003.LI M, TAN G J, DING K J, et al. The application prospect and research of Trichoderma spp. in the biocontrol of phytopathogenic fungi[C]//Advances in the research of Plant Pathology, Shenyang:Chinese Society for Plant Pathology, 2003.
[4] SALAS-MARINA M A, SILVA-FLORES M A, URESTI-RIVERA E E, et al. Colonization of Arabidopsis roots by Trichoderma atroviride promotes growth and enhances systemic disease resistance through jasmonic acid/ethylene and salicylic acid pathways[J]. Eur J Plant Pathol, 2011, 131(1):15-26.
[5] 赵蕾, 滕安娜. 木霉对植物的促生及诱导抗性研究进展[J]. 植物保护, 2010, 36(3):43-46.ZHAO L, TENG A N. Research progress in Trichoderma-stimulated plant growth and induced plant resistance[J]. Plant Protect, 2010, 36(3):43-46.
[6] 胡琼, 邵菲菲. 木霉对植物促生作用的研究进展[J]. 安徽农业科学, 2010, 38(10):5077-5079.HU Q, SHAO F F. Research advances on the growth-promoting effect of Trichoderma on plants[J]. J Anhui Agric Sci, 2010, 38(10):5077-5079.
[7] 张琪晓, 林林, 叶舟华, 等. 利用微生物肥料改善海岛农田土壤前景探析[J]. 浙江农业科学, 2012(2):217-219.ZHANG Q X, LIN L, YE Z H, et al. Study on using microbial fertilizer to improve soil prospect of island farmland[J]. J Zhejiang Agric Sci, 2012(2):217-219.
[8] 王粉莲, 苏利民, 王萍, 等. 生物肥料在国内外的研究现状[J]. 内蒙古农业科技, 2010(6):74-75.WANG F L, SU L M, WANG P, et al. The research status on biological fertilizer at home and abroad[J]. Inner Mongolia Agric Sci Tech, 2010(6):74-75.
[9] 陈翔兰. 生物菌肥的作用及推广应用前景[J]. 内蒙古农业科技, 2008(4):96.CHEN X L. The role of bio-fertilizer and promotion prospects[J]. Inner Mongolia Agric Sci Tech, 2008(4):96.
[10] HARMAN G E. Myths and dogmas of biocontrol changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzinum T-22[J]. Plant Dis, 2000, 84(4):377-393.
[11] ZIMAND G, ELAD Y. Effect of Trichoderma harizianum on Bollrylis cinerea pathogenicity[J]. Phytopatholigy, 1996, 86:945-956.
[12] 曾艳君. 特立克防治番茄灰霉病应用效果[J]. 辽宁农业科学, 2009(6):53-54.ZENG Y J. Application effect of laid-gram prevent Botrytis cinerea[J]. Liaoning Agric Sci, 2009(6):53-54.
[13] 杨春平, 张晋康, 陈华保, 等. 绿色木霉L24菌株分生孢子可湿性粉剂的研制[J]. 西北农业学报, 2010, 19(9):43-47.YANG C P, ZHANG J K, CHEN H B, et al. Preparation of Trichoderm viride L24 conidia wettable powder[J]. Acta Agric Boreali-Occident Sinica, 2010, 19(9):43-47.
[14] 李秀明, 李卿, 韦灵林, 等. 哈茨木霉T4厚垣孢子水分散粒剂的研制[J]. 农药, 2013, 52(1):24-27.LI X M, LI Q, WEI L L, et al. Research on water dispersible granules of Trichoderma harzianum T4 chlamydospores[J].Agrochemicals, 2013, 52(1):24-27.
[15] 李俊, 姜昕, 李力, 等. 微生物肥料的发展与土壤生物肥力的维持[J]. 中国土壤与肥料, 2006(4):1-5.LI J, JIANG X, LI L, et al. Development of microbial fertilizer and maintaining of soil biological fertility[J]. Soil Fertil China, 2006(4):1-5.
[16] ZHANG S W, GAN Y T, XU B L. Biocontrol potential of a native species of Trichoderma longibrachiatum against Meloidogyne incognita[J]. Appl Soil Ecol, 2015, 94:21-29.
[17] ZHANG S W, GAN Y T, XU B L. Efficacy of Trichoderma longibrachiatum in the control of Heterodera avenae[J]. Bio Control, 2014, 59(3):319-331.
[18] ZHANG S W, GAN Y T, XU B L, et al. The parasitic and lethal effects of Trichoderma longibrachiatum against Heterodera avenae[J]. Biol Control, 2014, 72:1-8.
[19] 陈臻, 古丽君, 徐秉良, 等. 长枝木霉对6种牧草种子发芽与生理效应的影响[J]. 草地学报, 2013, 21(3):564-570.CHEN Z, GU L J, XU B L, et al. Effects of Trichoderma longibrachiatum on seed germination and physiological effects of six forage varieties e[J]. Acta Agrestia Sinica, 2013, 21(3):564-570.
[20] 马超, 刘峰, 慕卫, 等. 三角坐标图法在农药水分散粒剂配方研制中的应用[J]. 农药学学报, 2006, 8(4):379-382.MA C, LIU F, MU W, et al. Study on the formulation of water dispersible granule with triangle-coordinate figure[J]. Chin J Pestic Sci, 2006, 8(4):379-382.
[21] 方中达. 植病研究方法[M]. 3版. 北京:中国农业出版社, 1998.FANG Z D. Disease research methods[M]. 3rd ed. Beijing:China Agriculture Press, 1998.
[22] 杨力帆. 深绿木霉Trichoderma atroviride 生物菌肥的研制及对油菜菌核病、根肿病的生物防治[D]. 成都:四川农业大学,2010.YANG L F. Preparation of compost and biocontrol of oilseed rape sclerotinia stem rot and club root with Trichoderma atroviride[D]. Chengdu:Sichuan Agricultural University, 2010.
[23] 王永东. 哈茨木霉H-13固体发酵工艺及其应用效果的研究[D]. 合肥:安徽农业大学, 2007.WANG Y D. Study on solid fermentation technology and application of Trichoderma harzianum strain H-13[D]. Hefei:Anhui Agricultural University, 2007.
[24] 李秀明. 生防木霉菌T4和枯草芽孢杆菌B99-2制剂的研制及田间试验[D]. 上海:华东理工大学,2012.LI X M. Studies on the formulation of biocontrol agents Trichoderma harzianum T4 and Bacillus subtilis B99-2 and biocontrol in the green house[D]. Shanghai:East China University of Science and Technology, 2012.
[25] 李文凤. 70% 吡虫啉水分散粒剂配方及生物活性研究[D]. 福州:福建农林大学, 2010.LI W F. Research on formulation and biological activity of 70% imidacloprid water dispersing granule[D]. Fuzhou:Fujian Agriculture and Forestry University, 2010.
[26] 刘步林. 农药剂型加工技术[M]. 2版. 北京:化学工业出版社, 1998.LIU B L. Pesticide processing technology[M]. 2nd ed. Beijing:Chemical Industry Press, 1998.
[27] 明亮, 刘程程, 杨晓云, 等. 生物杀菌剂解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂配方及助剂筛选[J]. 中国生物防治学报, 2015, 31(4):529-535.MING L, LIU C C, YANG X Y, et al. Screening on formula and auxiliaries for biological germicide Bacillus amyloliquefaciens B1619[J]. Chinese J Biol Control, 2015, 31(4):529-535.
[28] 刘刚, 苏冬梅. 2009年我国发布的农药相关国家标准[J]. 农药科学与管理, 2010, 31(5):53-55.LIU G, SU D M. National standards for pesticide related in China in 2009[J]. Pestic Sci Admin, 2010, 31(5):53-55.
[29] 黄祖志, 罗凌虹, 吴也凡, 等. 不同黏结剂体系对水基流延成型Y2O3 稳定ZrO2 的影响[J]. 硅酸盐学报, 2008, 36(11):1590-1594.HUANG Z Z, LUO L H, WU Y F, et al. Effect of different binders systems on aqueous tape casting of yttria-stabilized zirconia[J]. J Chinese Ceramic Soc, 2008, 36(11):1590-1594.
[30] 王桂苓, 马友华, 江云, 等. 凹凸棒土在土壤改良和新型肥料开发上的应用[J]. 磷肥与复肥, 2008, 23(3):77-78.WANG G Q, MA Y H, JIANG Y, et al. Application of attapulgite in soil improvement and new type fertilizer development[J]. Phosph & Compd Fert, 2008, 23(3):77-78.
[31] 郑德赞. 100 g/kg苯醚甲环唑水分散粒剂的研制[J]. 农药, 2005, 44(9):399-401.ZHENG D Z. Preparation of a 100 g/kg difenoconazole water dispersible granule[J]. Chin J Pestic, 2005, 44(9):399-401.
[32] LEWIS J A, PAPAVIZAS G C. Biocontrol of plant diseases:The approach for tomorrow[J]. Crop Prodt, 1991, 10(2):95-105.
[33] 朱辉,娄沂春,林福呈,等. 利用城市垃圾发酵生产绿色木霉孢子[J]. 微生物学通报, 1999, 26(6):387-390.ZHU H, LOU Y C, LIN F C, et al. Utilizing municipal refuse to process conidial preparation of Trichoderma viride[J]. Microbiology, 1999, 26(6):387-390.
[34] 姜兴印. 抗药木霉菌高效生防菌株生物学及其制剂加工技术[D]. 泰安:山东农业大学, 2006.JIANG X Y. Biological characteristics and preparation making on fungicide-resistance strains of Trichoderma[D]. Tai'an:Shandong Agricultural University, 2006.
[35] 徐雅娟, 袁桂峰, 陈森洲,等. 29种细菌用新鲜牛乳低温保存菌种的新方法[J]. 海南医学, 2008, 19(10):150-151.XU Y J, YUAN G F, CHEN S Z, et al. A new method of 29 kinds of bacteria strains with fresh milk cryogenic preservation[J]. Hainan Medi J, 2008, 19(10):150-151.
[36] 张爱梅,郭大城,王建丽,等. 国内菌种保藏材料及保藏方法研究现状[J]. 河南预防医学杂志, 2011, 22(6):405-407.ZHANG A M, GUO D C, WANG J L, et al. The recent research of our country in the material and methods of the Virus preservation[J]. Henan J Prevent Med, 2011, 22(6):405-407.