农药在控制农业病虫草害、保证农作物稳产高产、提高劳动效率等方面发挥重大作用，其产品质量影响病虫草害的防治效果、农产品的质量安全以及生态环境的保护等诸多问题。近年来的农药质量监督检查结果表明，违法添加隐性成分(登记有效成分以外的农药成分)是农药产品不合格的主要原因之一。添加的隐性成分主要包括未经登记批准的农药、未过专利保护期的农药、已经禁止或限制使用的农药等^{[1, 2, 3, 4]}。

使用此类农药产品虽然在一定程度上可提高药效，但因缺少药害、残留和环境方面的试验数据，可能导致危害使用者安全、造成农产品中农药残留超标和导致农作物发生药害等现象，以及加快害虫抗药性或交互抗性的产生、危害天敌、导致生态自我调节能力减退和环境污染等^[4]。因此，各级农业主管部门近年来一直在加强对农药产品隐性成分问题的监管力度，但由于隐性成分种类繁多，对检测技术要求极高。目前，主要检测方法有气相色谱、液相色谱、气相色谱-质谱联用和液相色谱-质谱联用等，但存在检测周期相对较长，成本较高，不利于监管工作的全面开展等问题^[5]。我国明令禁止使用或在蔬菜、果树、茶叶及中草药材上不得使用和限制使用的农药共有50种，其中氨基甲酸酯类或有机磷类农药23种^{[6, 7, 8]}。因此，迫切需要建立农药制剂中非法添加氨基甲酸酯类或有机磷类农药隐性成分的快速检测方法，以便为相关农药产品质量安全的监管提供快速、方便和低成本的技术支持，进而为农产品质量安全提供有力保障。本研究利用我国农业基层检测部门广泛配备的农药残留速测仪，建立了上述23种禁、限用农药在非有机磷和氨基甲酸酯类农药制剂中的快速检测方法，采用在9种不同农药剂型和1种叶面肥中添加禁、限农药的方法对检测方法的可靠性进行了验证。

待测23种农药见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 供试农药及其检出限 Table 1 The tested pesticides and their detection limits 农药* Pesticides 纯度 Purity 使用现状 Current situation 检出限 Limit of detection/ (mg/L) 灭线磷 ethoprophos 1 000 mg/L 限用 restricted 0.03 灭多威 methomyl 1 000 mg/L 限用 restricted 0.05 氧乐果 omethoate 1 000 mg/L 限用 restricted 0.06 克百威 carbofuran 1 000 mg/L 限用 restricted 0.06 磷胺 phosphamidon 1 000 mg/L 禁用 prohibited 0.08 硫线磷 cadusafos 1 000 mg/L 禁用 prohibited 0.08 内吸磷 demeton 1 000 mg/L 限用 restricted 0.09 治螟磷 sulfotep 1 000 mg/L 禁用 prohibited 0.11 地虫硫磷 fonofos 1 000 mg/L 禁用 prohibited 0.21 氯唑磷 isazofos 98.0% 限用 restricted 0.25 甲拌磷 phorate 1 000 mg/L 限用 restricted 0.25 甲基异柳磷 isofenphos-methyl 1 000 mg/L 限用 restricted 0.29 水胺硫磷 isocarbophos 1 000 mg/L 限用 restricted 0.29 对硫磷 parathion 1 000 mg/L 禁用 prohibited 0.30 涕灭威 aldicarb 1 000 mg/L 限用 restricted 0.31 甲胺磷 methamidophos 1 000 mg/L 禁用 prohibited 0.32 甲基硫环磷 phosfolan-methyl 1 000 mg/L 禁用 prohibited 0.37 硫环磷 phosfolan 1 000 mg/L 限用 restricted 0.44 蝇毒磷 coumaphos 98.0% 禁用 prohibited 0.51 久效磷 monocrotophos 1 000 mg/L 禁用 prohibited 0.80 苯线磷 fenamiphos 1 000 mg/L 禁用 prohibited 1.5 甲基对硫磷 parathion-methyl 1 000 mg/L 禁用 prohibited 4.2 特丁硫磷terbufos 1 000 mg/L 禁用 prohibited 4.4 *氯唑磷来源于 Sigma Aldrich (美国，圣路易斯)，蝇毒磷来源于 Dr. Ehrenstorfer GmbH (德国，奥格斯堡)，其余农药均来源于农业部环境质量监督检验测试中心 (天津) (Center for Environment Quality Supervision & Testing (Tianjin) Ministry of Agriculture)。

表 1 供试农药及其检出限 Table 1 The tested pesticides and their detection limits

10%吡虫啉(imidacloprid)可湿性粉剂(WP，南京红太阳股份有限公司)；70%吡虫啉水分散粒剂(WG，江苏龙灯化学有限公司)；10%醚菊酯(etofenprox)悬浮剂(SC，江苏辉丰农化股份有限公司)；10%烯啶虫胺(nitenpyram)水剂(AS，浙江世佳科技有限公司)；25%吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)乳油(EC，巴斯夫欧洲公司)；4%四氟醚唑(tetraconazole)水乳剂(EW，意大利意赛格公司)；10%腐霉利(procymidone)烟剂(FU，河南省浚县绿宝农药厂)；600 g/L吡虫啉悬浮种衣剂(FSC，拜耳作物科学(中国)有限公司)；0.1%氯吡脲(forchlorfenuron)可溶液剂(SL，四川省兰月科技开发公司)；叶菜专配叶面肥(德国施巴露作物科学有限公司)。

TMYQ-108P农药残留速测仪及配套试剂均购自杭州天迈生物科技有限公司。乙酰胆碱酯酶制剂用3.1 mL磷酸盐缓冲液溶解，显色剂和底物均用15 mL磷酸盐缓冲液溶解。所有试剂均于4 ℃保存，备用。

标准储备液：准确量取或称取各供试农药标准品，用丙酮溶解配制成100 mg/L的标准储备液，于4 ℃保存，备用。

标准工作液：分别量取标准储备液1 mL置于10 mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液分别稀释为10 mg/L标准工作液。

标准系列工作溶液：试验时，取适量上述各标准工作液，用磷酸盐缓冲液逐级稀释为10 000、5 000、4 000、3 000、2 000、1 000、500、100、50、25和1.0 μg/L的标准系列工作溶液。

标准曲线的绘制：对测试的农药标准工作溶液，在梯度浓度下通过农药残留速测仪检测，获得相应的酶抑制率，以横坐标代表农药浓度，根据酶抑制率值变化绘制标准曲线。

准确量取磷酸盐缓冲溶液2.5 mL作为空白对照，加入乙酰胆碱酯酶和显色剂各100 μL，涡旋摇匀，于37 ℃恒温水浴中保存5 min；加入100 μL底物后立即转入比色皿中，运用农药残留速测仪在波长412 nm处测定其反应3 min的吸光度变化值(△A₀)。随后量取2.5 mL各浓度的标准工作溶液，重复上述操作并测定相应的反应3 min的吸光度变化值(△A_t)。根据公式(1)求出乙酰胆碱酯酶被抑制的程度，即抑制率(I)^{[9, 10]}。

9种农药制剂和1种叶面肥分别用磷酸盐缓冲溶液稀释1 000倍后添加待测农药，添加水平分别为略低于检出限、接近检出限和略高于检出限3个，按1.2.2节所建的方法，计算其平均抑制率，每个处理重复3次。同时设农药制剂、叶面肥及空白对照处理。

参照国家标准《GB/T5009.199—2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》^[10]，当酶抑制率≥ 50%时，表示有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在。本研究选择当酶抑制率为50%时所对应的农药浓度为检出限。

将供试23种禁、限用农药标准品的标准系列工作溶液利用农药残留速测仪进行快速检测，选择灵敏度分别为高、中、低的3组农药氧乐果、甲拌磷和甲基对硫磷为代表，酶抑制率随农药质量浓度的变化情况见图 1。根据23种有机磷、氨基甲酸酯类禁、限用农药的不同浓度快速检测曲线，计算求得各农药的检出限见表 1。其中，灵敏度较高的灭线磷、灭多威、氧乐果和克百威等农药，其检出限在0.03~0.06 mg/L之间，均低于0.1 mg/L；灵敏度较低的甲基对硫磷和特丁硫磷检出限在4.0~5.0 mg/L之间，均高于4.0 mg/L，但已满足农业投入品中常量级别(质量分数0.1%以上)添加农药隐性成分的快速检测。

图 1

图 1 酶抑制率随农药浓度的变化关系 Fig. 1 The relationship between the enzyme inhibition rate and the pesticide concentration

结果(表 2)表明：除叶面肥外，9种农药制剂的基质背景对乙酰胆碱酯酶的抑制均略有影响，但均低于抑制率50%的判定值，即本研究中判定结果不会因基质背景因素导致假阳性。

表 2(Table 2)

表 2 9种农药制剂和1种叶面肥中添加氧乐果、甲拌磷和甲基对硫磷对乙酰胆碱酯酶抑制率的影响 Table 2 The effects of omethoate, phorate and parathion-methyl in 9 kinds of pesticide formulations and 1 kind of leaf fertilizer on the acetylcholine esterase inhibition rate 试验处理 Test treatments 乙酰胆碱酯酶抑制率 Acetylcholine esterase inhibition rate/% 空白对照 Blank control 氧乐果 omethoate/(mg/L) 甲拌磷 phorate/(mg/L) 甲基对硫磷 parathion-methyl/(mg/L) 0.025 0.060 0.10 0.050 0.25 1.0 3.0 4.2 5.0 磷酸盐缓冲液 Phophate buffer - 0 69 97 0 65 93 0 62 100 10% 吡虫啉 (imidacloprid) WP 25 26 72 100 21 69 100 21 70 100 70% 吡虫啉 (imidacloprid) WG 10 10 76 98 8 68 95 7 65 98 10% 醚菊酯 (etofenprox) SC 16 13 76 100 15 72 100 10 69 100 10% 烯啶虫胺 (nitenpyram) AS 19 20 72 100 15 70 100 24 64 100 4% 四氟醚唑 (tetraconazole) EW 19 20 66 98 9 67 97 14 67 98 25% 吡唑醚菌酯 (pyraclostrobin) EC 24 20 66 100 22 72 100 25 70 98 10% 腐霉利 (procymidone) FU 14 12 70 100 13 81 96 13 68 98 600 g/L 吡虫啉 (imidacloprid) FSC 28 25 69 100 20 69 100 17 66 100 0.1% 氯吡脲 (forchlorfenuron) SL 21 22 69 96 17 69 100 16 68 98 叶菜专配叶面肥 Leaf fertilizer 0 3 63 100 0 61 86 3 56 97

表 2 9种农药制剂和1种叶面肥中添加氧乐果、甲拌磷和甲基对硫磷对乙酰胆碱酯酶抑制率的影响 Table 2 The effects of omethoate, phorate and parathion-methyl in 9 kinds of pesticide formulations and 1 kind of leaf fertilizer on the acetylcholine esterase inhibition rate

在9种农药制剂和1种叶面肥中分别添加以氧乐果、甲拌磷和甲基对硫磷为代表的高、中、低灵敏度的农药速测结果(表 2)可知：当添加质量浓度(氧乐果、甲拌磷、甲基对硫磷分别为0.025、0.05和3.0 mg/L)低于检出限时，其对乙酰胆碱酯酶的最高抑制率分别为26%、22%和25%，均远低于50%的抑制率，说明基质对低于检出限的检测结果无影响；当以检出限浓度添加时，即氧乐果、甲拌磷和甲基对硫磷分别为0.06、0.25和4.2 mg/L时，其对乙酰胆碱酯酶的最高抑制率分别为63%~76%、61%~81%和56%~70%，均略高于50%的抑制率，说明基质对等于检出限的检测结果无影响；当添加浓度高于检出限时，即氧乐果、甲拌磷和甲基对硫磷分别为0.10、1.0和5.0 mg/L时，其对乙酰胆碱酯酶的最高抑制率分别为96%~100%、86%~100%和97%~100%，均远高于50%的抑制率，说明基质对高于检出限的检测结果亦无影响。综上所述，9种农药制剂和1种叶面肥基质背景对酶抑制法检测上述违禁农药结果无影响。

目前我国对农药管理和农产品质量安全的重视程度提高到了前所未有的高度，各市县均设有农业行政执法大队，对违反《农药管理条例》和《农产品质量安全法》等农业生产和经营领域的行政违法案件进行大力查处。但由于农药隐性成分看不见摸不着，基层农业部门配备的检测设备主要以定性的快速检测仪器为主，且缺少对于农药隐性成分的筛查方法，致使抽检的农药样品均需送至专业的检测机构进行检测，从而大大增加了检测成本，严重制约了农业行政执法的力度。

农药中掺杂违禁的有机磷、氨基甲酸酯类隐性成分具有成本低、效果好的特点，农民接受程度高，但也是造成农产品农药残留超标的主要因素，应大力查处。为了解决基层农业执法部门对这类违禁成分快速查处的难题，提高查处效率，本研究建立了利用农药残留速测仪对非有机磷、非氨基甲酸酯类农药产品中违禁添加有机磷、氨基甲酸酯类隐性成分进行快速定性检测的方法。该方法操作简便、适用面广、仪器设备在基层的普及率高，可以为农业执法、农药监管部门及检测机构对农药产品的质量监管，保证农药企业的规范生产与发展提供技术支持。但该方法也存在一定的局限性，无法适用于有机磷或氨基甲酸酯类农药制剂中的隐性成分检测，相应的快速检测方法有待进一步的研究。