噻霉酮 (图式1) 化学名称为 1,2-苯并异噻唑啉 -3-酮，属于有机杂环类杀菌剂，对真菌、细菌性 病害有很强的抑杀作用，具有高效、安全、低毒 和低残留等特点^[1]。虽然该农药对农作物具有良好 的保护和治疗作用，但若其残留过多会对食用者 产生潜在危害。关于噻霉酮的检测方法报道较 少，主要以液相色谱法^{[2, 3, 4]}为主，但该法的灵敏度 低、选择性差，属于半定性分析。GB 2763—2014 中规定了噻霉酮在黄瓜中的临时限量为 0 . 1 mg/kg^[5]，目前国内外尚未见食品中噻霉酮的标准 检测方法。液相色谱-串联质谱仪具有灵敏度高、 选择性强和定性准确等特点，在农药残留分析方 面应用广泛^{[6, 7, 8, 9, 10]}，但未见其用于分析噻霉酮的报 道。QuEChERS 技术是一种快速、简单、廉价、 高效、耐用和安全的样品前处理方法，已广泛用 于食品中农药残留的检测^{[11, 12, 13, 14, 15, 16]}。本研究采用改进的 QuEChERS 前处理方法，结合液相色谱-串联质谱 仪建立了果蔬及其制品中噻霉酮残留的分析方 法。

图式 1

Scheme 1

图式 1 噻霉酮 Scheme 1 benziothiazolinone

1260-6460A 液相色谱-串联质谱仪 (美国 Agilent 公司)；Sigma3-18 K 台式冷冻离心机 (Sigma 公司)；EYELA MMV-1000 W 振荡器 (东 京理化公司)；GM200 刀式混合研磨仪 (Retsch 公 司)；N-EVAP-112 水浴氮吹仪 (Organomation 公 司)；MiIIi-Q Advangtage A10 超纯水系统 (Millipore 公司)；MS3 型涡旋振荡器 (IKA 公司)。

99% 噻霉酮 (benziothiazolinone) 标准品 (德国Dr.Ehrenstorfer 公司)；乙睛、甲醇、丙酮、甲酸 和正己烷均为色谱纯 (德国 MERCK 公司)；试验 用水为 Milli-Q 超纯水 (符合 GB/T 6682—2008 一 级水要求)；C18 和 PEP 吸附剂均购自 Agela 公 司；分析样品为实验室送检和市售样品。

新鲜果蔬取可食部分，切碎混匀，用混合研 磨仪制成匀浆，备用；番茄酱搅拌均匀后直接称 样。葡萄干样品先于 -20 ℃ 下静置 6 h 以上，将 样品中水分冻成固态冰，迅速取出用混合研磨仪 加工成粉末状，备用。

称取新鲜果蔬样品 2 g (精确至 0.01 g) 于 50 mL 具塞离心管中，加入 1 g 氯化钠、5 mL 含 0 . 1 % 乙酸的乙腈，涡旋 3 0 s 后，振荡提取 15 min，于 5 000 r/min 下离心 2 min；取 3 mL 上 清液于 15 mL 具塞离心管中，加入吸附剂 C₁₈ 和 PEP 粉各 50 mg，摇匀并涡旋 30 s，于 5 000 r/min 下离心 1 min；取 2.5 mL 上清液于 10 mL 试管 中，于 40 ℃ 水浴中氮吹至干，用 1 mL 的 V (甲醇): V (水) = 1:9 溶解，涡旋 30 s 混匀，经 0.22 μm 滤 膜过滤，待分析。

分别称取 2 g 含水量较少的番茄酱和葡萄干样 品 (精确至 0.01 g) 于 50 mL 具塞离心管中，加入 5 mL 水，静置 30 min；加入 2 g 氯化钠及10 mL 含 0.1% 乙酸的乙腈，涡旋 30 s 后，振荡提取 15 min，于 5 000 r/min 下离心 2 min；取 7.0 mL 上清液于 15 mL 具塞离心管中，加入吸附剂 C₁₈ 和 P E P 粉各 5 0 m g ，摇匀并涡旋 3 0 s ，于 5000 r/min 下离心 1 min；取 5.0 mL 上清液于 10 mL 试管中，于 40 ℃水浴中氮吹至干，用 1 mL 的 V (甲醇):V (水) = 1:9 溶解，涡旋 30 s 混匀，经 0.22 μm 滤膜过滤，待分析。

JADE-PAK CB-C₁₈ 色谱柱 (100 mm × 2.1 mm，3 μm)；柱温 30 ℃；进样量 10.0 μL。流动相：A 相为 0.1% 的甲酸水 (含 2 mmol/mL 乙酸铵)，B 相为甲醇，流速 0 . 2 5 m L / m i n；梯度洗脱程序： 0～3.5 min (B 相 10%～50%)，3.5～5.5 min (B 相 50%～90%)，5.5～7.5 min (B 相 90%)，7.51～10 min (B 相 10%)。

电离模式：电喷雾正离子源模式 (ESI+)；多重 反应监测 (MRM)；干燥气温度 300 ℃；干燥气流 量 1 0 . 0 L / m i n；鞘气温度 2 5 0 ℃；鞘气流速 9.0 L/min，毛细管电压 4 kV；碎裂电压：122 V； 驻留时间 50 ms；监测离子对分别为 m/z 152.0 > 109.0 (定量离子对) 和 m/z 152.0 > 134.0 (定性离子 对)。

标准储备溶液：准确称取噻霉酮标准品 10 mg (精确至 0.01 mg)，用甲醇溶解并定容至 10 mL，配成 1 000 mg/L 的标准储备液，于 4 ℃ 储存，备 用。

基质匹配标准曲线的绘制：准确称取 2 g 待测 果蔬样品 (精确到 0.01 g)，按 1.2 节的前处理及 1.3 节的条件分析，当农药的定性和定量离子信噪 比均小于 3 时，样品确定为空白基质；空白基质 按照 1.2 节前处理，获得基质空白提取液，逐步用 基质空白提取液将标准储备液稀释至 10、20、 50、100、200 和 500 ng/mL，以峰面积 (y) 对农药 的质量浓度 (x) 作线性回归，绘制标准曲线。

采用相对响应值法^[17]，根据公式 (1) 计算噻霉酮的基质效应 (ME)。当基质效应大于 1 时，表现为基质增强效应；当基质效应小于 1 时，为基质抑制效应。

式中，ME 表示基质效应；A_m 表示空白基质标准响应值；A_c 表示纯溶剂标准响应值。

配制 1.0 mg/L 的噻霉酮标准溶液，分别采用 电喷雾正离子模式 (ESI⁺) 和负离子模式 (ESI^-) 对 其进行母离子扫描。结果发现：噻霉酮在正离子 模式下信号丰度远高于负离子模式下的，从而确 定噻霉酮的母离子为 [M + H]⁺，即m/z 152.0。进 一步对子离子、碎裂电压、碰撞能量等参数进行 优化，获得噻霉酮子离子全扫描质谱图见图 1。结 合样品基质效应的影响，最终选取离子丰度最高、本底干扰最小的 m/z 152.0 > 109.0 作为定量离 子对，m/z 152.0 > 134.0 为定性离子对。

图 1

Fig. 1

图 1 噻霉酮的子离子扫描质谱图 Fig. 1 Chromatogram of product ion scan for benziothiazolinone

本研究选择常规的 JADE-PAK CB-C₁₈ 柱作为 分析柱，比较了不同浓度的甲酸水溶液、乙酸铵 水溶液、甲酸-乙酸铵水溶液、纯水所组成的水 相，乙腈和甲醇组成的有机相。通过不同水相与 有机相组合的分析发现，选择 0.1% 甲酸水 (含 2 mmol/L 乙酸铵) -甲醇为流动相时，噻霉酮离子 化效益较好。同时通过设计梯度洗脱程序，噻霉 酮的保留时间和峰形均十分理想，能够有效降低 基质干扰。标准溶液典型色谱图见图 2。

图 2

Fig. 2

图 2 10 ng/mL 噻霉酮标准溶液的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of 10 ng/mL benziothiazolinone standard solution

以苹果为分析样品，比较了乙腈、含 0.1% 乙 酸的乙腈、正己烷、乙酸乙酯、丙酮对噻霉酮的 提取效果。结果 (图 3) 表明：用正己烷和丙酮提 取时，回收率达不到检测要求；以乙腈、含 0.1% 乙酸的乙腈、乙酸乙酯为提取剂时，回收率均可满足检测方法的要求。但乙酸乙酯提取时样品的 基质效应相对较大，后续吸附剂净化效果不明 显；含 0.1% 乙酸的乙腈提取时，回收率较乙腈提 取时稳定，相对标准偏差较小，故最终选择含 0.1% 乙酸的乙腈作为提取剂。

图 3

Fig. 3

图 3 不同提取溶剂对噻霉酮的提取效率 Fig. 3 Extraction efficiencies of benziothiazolinone with different solvents

以番茄为分析样品，当添加 100 μg/kg 的噻霉 酮，且吸附剂用量均为 50 mg 时，比较 PSA、 C₁₈、PCX、PEP、NH₂、酸性氧化铝和石墨化炭 黑 (GCB) 7 种吸附剂对样品的净化效果。结果发 现：以 PCX、PSA、GCB、NH₂ 和酸性氧化铝为 净化剂时，噻霉酮的回收率均达不到检测要求； 以 C₁₈ 和 PEP 为净化剂时，噻霉酮的回收率均可 满足检测要求。研究比较了未净化和以C _{1 8} 、 PEP及 C₁₈ 和 PEP 共同净化时噻霉酮的基质效 应，分别为 0.295、0.365、0.505 和 0.565。可见： 以 PEP 和 C₁₈为混合吸附剂时净化，效果更好，故本研究最终选择 C₁₈ 和 PEP 共同净化样品。

进一步比较 C₁₈ 和 PEP 的用量均为 20、50、 75、100、125、150、175 和 200 mg 时的回收率和 基质效应。结果表明：两者用量均为 50～200 mg 时，回收率和基质效应无明显差别；两者用量均 为 20 mg 时，提取液颜色相对较深，样品基质效 应相对较大。故最终选择 C₁₈ 和 PEP 各 50 mg 净 化样品。经前处理净化的空白番茄和空白番茄添 加标准品色谱见图 4。

图 4

Fig. 4

图 4 番茄空白样品 (a) 和添加 10 μg/kg 噻霉酮 (b) 色谱图 Fig. 4 Chromatograms of blank tomato (a) and blank tomato spiked 10 μg/kg benziothiazolinone (b)

本研究尝试在上清提取液中加入 100 mg 硫酸 镁，以达到吸附提取液中水分或盐析的效果。结 果发现：加入硫酸镁后，噻霉酮的回收率低于30%，表明硫酸镁对噻霉酮有一定的吸附作用，故未使用硫酸镁。

同时本研究对前处理方法的兼容性进行了考 察。以番茄为分析样品，在样品中添加吡虫啉、 啶虫脒、哒螨灵、多菌灵、抗蚜威、灭多威、残 杀威、克百威、甲萘威、仲丁威、嘧啶磷、三唑 磷、二嗪磷、甲基嘧啶磷、百治磷、杀扑磷、治 螟磷、氧乐果、甲胺磷、敌百虫、马拉硫磷、喹 硫磷、久效磷、速灭磷、伐灭磷、倍硫磷、辛硫 磷、吡呀酮、噻虫嗪、噻虫啉、烯啶虫胺、恶霜 灵、戊唑醇、二甲戊灵、苯霜灵、甲霜灵和噻霉 酮 37 种常用农药的混合标准溶液，每种农药的添 加水平为 1.0 mg/kg；按照 1.2 节的条件进行前处 理，参照文献^[18]的条件测定。结果表明：嘧啶 磷、哒螨灵和噻虫啉的回收率分别为 65%、60% 和 62%；其余 34 种农药的回收率均在 80% 以 上。表明该前处理方法的通用性较强。

结果 (表 1) 表明：不同样品基质对噻霉酮均 有抑制效应。采用基质匹配标准曲线可有效消除 样品基质效应。在 10～500 ng/mL 范围内，噻霉 酮的峰面积 (y) 与其质量浓度 (x) 间呈良好的线性 关系，决定系数 (R²) 均大于 0.996。通过在基质空 白提取液中添加标准溶液的方式，确定噻霉酮在 黄瓜、葡萄、葡萄干、番茄酱、番茄和苹果中的 检出限 (LOD) (以 S/N ≥ 3 计) 均为 3.0 μg/kg，定 量限 (LOQ)( 以 S/N ≥ 10 计) 均为 10 μg/kg。

表 1 (Table 1)

表 1 噻霉酮的基质效应、线性关系、检出限和定量限 Table 1 Matrix effects, linear relationships, LODs and LOQs of benziothiazolinone 基质 Matrix 基质效应 Matrix effect 线性范围 Linear range/ (ng/mL) 线性方程 Linear equation 决定系数 R2 检出限 LOD/(μg/kg) 定量限 LOQ/(μg/kg) 黄瓜 Cucumber 0.886 10～500 y = 1 298.6x + 158.3 0.996 5 3.0 10.0 葡萄干 Raisin 0.422 10～500 y = 550.3x + 300.5 0.999 9 3.0 10.0 葡萄 Grape 0.853 10～500 y = 1 145.4x + 124.9 0.998 2 3.0 10.0 番茄酱 Tomato sauce 0.287 10～500 y = 258.4x + 60.6 0.999 0 3.0 10.0 番茄 Tomato 0.586 10～500 y = 748.5x + 241.4 0.998 7 3.0 10.0 苹果 Apple 0.565 10～500 y = 935.6x + 80.7 0.999 9 3.0 10.0

表 1 噻霉酮的基质效应、线性关系、检出限和定量限 Table 1 Matrix effects, linear relationships, LODs and LOQs of benziothiazolinone

从表 2 可知：在 10、20 和 100 μg/kg 3 个添 加水平下，噻霉酮的平均回收率在 80%～98%，相对标准偏差在 2.4%～13% (n = 6)，表明该方法的准确度高，通用性好。

表 2 (Table 2)

表 2 不同基质中噻霉酮的添加平均回收率和相对标准偏差 (n = 6) Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of benziothiazolinone in different matrix (n = 6) 基质 Matrix 添加水平 Spiked level/(μg/kg) 10 20 100 平均回收率 Average recovery /% RSD /% 平均回收率 Average recovery /% RSD /% 平均回收率 Average recovery /% RSD/% 黄瓜 Cucumber 89 9.3 90 2.4 86 11 葡萄干 Raisin 86 5.0 80 4.0 96 7.6 葡萄 Grape 98 3.6 82 3.8 93 7.9 番茄酱 Tomato sauce 87 11 91 12 85 7.3 番茄 Tomato 87 10 90 6.6 93 13 苹果 Apple 94 10 89 5.9 94 8.2

表 2 不同基质中噻霉酮的添加平均回收率和相对标准偏差 (n = 6) Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of benziothiazolinone in different matrix (n = 6)

利用本方法对市售的黄瓜、葡萄、葡萄干、 番茄酱、番茄和苹果约 50 余份样品进行噻霉酮残 留的检测。结果均未检测出目标分析物。

本研究以含 0.1% 乙酸的乙腈为提取剂，经 QuEChERS 方法净化，通过色谱和质谱条件的优 化，建立了果蔬及其制品中噻霉酮残留的检测方 法。该方法操作简单、快速、灵敏度高、实用性 强，适用于果蔬及其制品中噻霉酮残留快速确证 检测。