向日葵 Helliantus annuus，全国均有栽培，包括食用、油用和混合 3 类，其果实葵花籽营养丰富，含多种不饱和脂肪酸、维生素和微量元素，具有抗衰老等保健功效^[1]。近年来，随着向日葵种植面积的扩大，病虫害的发生呈增加趋势，农药残留风险相应增加，葵花籽的质量安全问题被频频曝光^[2]，有必要对其农药残留进行监测，但质监部门质量监督抽查监测项目主要集中在酸价、过氧化值和大肠菌群等指标上，未涉及农药残留的检测。我国规定了 12 种农药在葵花籽中的最大残留限量(MRL)^[3]标准，国际食品法典标准(CAC)中规定了 27 种，此外欧盟 451 种，日本 253 种，韩国 30 种。

目前国内关于瓜籽的研究报道多集中在保健成分等方面，如脂肪酸的组成^[4]、氨基酸的含量^[5] 和添加物的含量^{[6, 7, 8]}等，而关于其农药残留检测的报道较少^[9]。

葵花籽的成分复杂^[8]，含油脂、蛋白质、色素等大分子化合物，尤其是油脂含量高达 49.9%(生葵花籽)^[10]、蛋白质含量达到 23.9%，需净化以去除其对检测结果的干扰。目前主要采用凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatogtaphy,GPC)^{[11, 12, 13]}净化样品，但存在净化不彻底等问题。本研究采用乙腈提取，凝胶渗透色谱结合石墨化碳黑/氨基固相萃取柱净化，气相色谱-串联质谱联用仪(GC-MS/MS)测定，建立了同时测定葵花籽中常见的28种农药^{[14, 15, 16, 17]}残留的分析方法。

咯菌腈、敌草胺、吡氟甲禾灵、菌核净、异丙甲草胺、仲丁灵和氟乐灵标准品(纯度均大于 90%，德国 Dr. Ehrenstorfer 公司)；其余农药(敌敌畏、乐果、克百威、抗蚜威、乙烯菌核利、甲霜灵、杀螟硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、三唑酮、甲基异柳磷、腐霉利、氟硅唑、三唑磷、异菌脲、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、苯醚甲环唑、溴氰菊酯)标准品(100 mg/L，中国标准技术开发公司标样开发部)。丙酮、正己烷、甲苯和乙腈，均为色谱纯(美国 Tedia 公司)；乙酸乙酯、环己烷和氯化钠，均为分析纯；Cleanert PestiCarb/NH₂，石墨化碳黑/氨基固相萃取小柱(500 mg/500 mg/6 mL，中国 Agela Technologies 公司)；Florisil 固相萃取小柱(500 mg/6 mL，中国 Agela Technologies 公司)；试验用水均为去离子水。

TSQ 8000 Triple Quadrupole MS 质谱仪和 TRACE 1310 Gas Chromatograph 气相色谱仪(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)；高速匀浆机(德国 IKA 公司)；WH-3微型涡旋混合仪(上海路西分析仪器厂有限公司)；凝胶渗透色谱仪(美国 J2 Scientific 公司)，配有内充 Bio-Beads S-X3 玻璃柱(内充凝胶 22 g，20 cm × 2 cm)；旋转蒸发仪(瑞士 Büchi 公司)；离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)

葵花籽样品包括三道眉、黑大片和 5009 系列 3 个品种，产地为内蒙和新疆，均购自当地市场及瓜籽生产企业。人工去壳，取可食部分制成粉状，于 - 4 ℃ 保存，备用。

准确称取 5.00 g 粉粹样品于盛有 5 g 无水硫酸钠的 50 mL 具塞离心管中，加入 20 mL 乙腈，静置 1 h，高速均质 3 min，于 4000 r/min 下离心 5 min，收集上清液于蒸馏瓶中，残渣用 20 mL 乙腈提取 2 次，合并提取液，于 40 ℃ 下旋蒸浓缩至近干；加入 5 mL V (乙酸乙酯) :V (环己烷) = 1:1，进行溶剂替换，重复两次，残渣用 10 mL 上述混合溶液溶解，过 0.45μm 有机滤膜，待净化。

流动相为 V (乙酸乙酯) : V (环己烷) = 1:1，流速为 4.7 mL/min，进样量为 5.0 mL。收集 7～26 min 组分，于 40 ℃ 下旋蒸浓缩至近干，定容至 5 mL，待固相萃取(SPE)净化。

在复合柱中加入 5 mL 乙腈预淋洗液，当液面到达碳黑顶部时，迅速加入样品提取浓缩液，用 5 mL × 5 的 V (乙腈) : V (甲苯) = 3:1溶剂洗脱，收集所有洗脱液于梨形瓶中，于 40 ℃ 下浓缩至近干，用 V (正己烷) : V (丙酮) = 9 : 1 定容至 2.5 mL，待测定。

色谱条件：RTX-5MS 色谱柱(0.25 mm × 30 m，0.25 μm)；进样口温度 250 ℃；恒流模式：1.2 mL/min；不分流进样；进样量 1.0 µL。柱温 60 ℃ (保持 1 min)，以 25 ℃/min 升至 150 ℃，不保持，再以 5 ℃/min 升温至 300 ℃ 保持 2 min。载气为高纯氦气(99.999%)。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)；电子轰击能 70 eV；灯丝电流 25 µA ；离子源温度 300 ℃；传输温度 280 ℃，溶剂延迟 4 min；碰撞气为氩气(纯度为 99.999%)；多反应监测模式(MRM)。各组分的保留时间、母离子、特征碎片离子、碰撞能量见表 1。运用 TraceFinder 工作站进行仪器控制和数据处理。

表 1 (Table 1)

表 1 串联质谱多反应监测模式下待测农药的分析参数 Table 1 GC-MS /MS parameters for the determination of pesticides in the MRM mode 序号 No. 农药 Pesticides 保留时间 Retention time/min 定量离子对, m/z Quantitative ion-pair 碰撞能量 Collision energy /eV 定性离子对, m/z Qualitative ion-pair 碰撞能量 Collision energy/eV 1 敌敌畏 dichlorvos 5.69 109→79 8 185→93 10 2 氟乐灵 trifluralin 10.79 306→264 8 264→160 10 3 乐果 dimethoate 11.78 87→42 10 93→63 8 4 克百威 carbofuran 11.98 164→149 10 149→77 30 5 抗蚜威 pirimicarb 13.71 238→166 10 166→96 15 6 乙烯菌核利 vinclozolin 14.61 212→172 15 285→212 10 7 甲霜灵 metalaxyl 14.98 132→117 12 160→130 18 8 杀螟硫磷 fenitrothion 15.55 277→109 25 277→260 10 9 马拉硫磷 malathion 15.91 127→99 10 173→127 10 10 异丙甲草胺 metolachlor 16.04 162→133 15 238→132 26 11 毒死蜱 chlorpyrifos 16.14 314→258 15 316→260 10 12 三唑酮 triadimefon 16.52 208→181 10 208→111 25 13 菌核净 dimethachlon 16.59 245→189 10 243→187 15 14 仲丁灵 butralin 16.81 266→190 10 266→220 8 15 甲基异柳磷 isofenphos-methyl 17.13 199→121 10 231→137 15 16 腐霉利 procymidone 18.02 283→96 10 285→257 10 17 氟吡甲禾灵 haloxyfop-methyl 18.57 316→91 16 375→316 15 18 敌草胺 napropamide 19.19 271→72 15 271→128 10 19 咯菌腈 fludioxonil 19.44 248→127 10 248→154 18 20 氟硅唑 flusilazole 20.00 206→151 15 233→165 15 21 三唑磷triazophos 21.82 161→134 10 257→162 10 22 异菌脲iprodione 24.13 314→245 10 316→247 10 23 氯氟氰菊酯 cyhalothrin 26.08, 26.42 181→152 25 208→181 10 24 氯菊酯 permethrin 27.91, 28.20 183→153 15 163→127 10 25 氯氰菊酯 cypermethrin 29.63, 29.85, 29.94, 30.03 181→152 15 163→127 10 26 氰戊菊酯fenvalerate 31.32, 31.72 167→125 10 125→89 20 27 苯醚甲环唑 difenoconazole 32.14, 32.38 323→265 15 325→267 15 28 溴氰菊酯 deltamethrin 32.38, 32.76 253→174 22 251→172 8

表 1 串联质谱多反应监测模式下待测农药的分析参数 Table 1 GC-MS /MS parameters for the determination of pesticides in the MRM mode

农药标准储备液：分别准确称取一定量的农药标准品，用甲苯溶解，配制成 1 000 mg/L 的标准母液，再用丙酮稀释成 100 mg/L 的标准储备液，于 -18 ℃ 下贮存，备用。

混合农药标准溶液的配制：分别量取一定量的标准储备液于 100 mL 容量瓶中，用丙酮稀释并定容，配制成质量浓度为 2.0 mg/L 的混合标准储备液，于 -18 ℃ 下贮存，备用。根据需要用 V (正己烷) : V (丙酮) = 9 : 1稀释成不同浓度的混合标准工作溶液。

制作标准曲线的基质标准溶液：分别称取多份空白葵花籽样品，按本研究所建立的方法进行样品前处理，浓缩，用 V (正己烷) : V (丙酮) = 9 : 1稀释成基质空白溶液。分别吸取一定量的混合标准储备液，用基质空白溶液稀释，配成 0.01、0.02、0.05、0.1 、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mg/L 的系列基质标准工作溶液，按 1.4.4 节的条件测定。以各农药的质量浓度为横坐标(x)，以其对应的峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线。

为了确定目标农药的选择范围，首先查询了中国国家标准中规定的葵花籽中最大残留限量的 12 种农药^[3]，其次查询农药产品在向日葵中的登记情况^[18](见表 2)，同时调研了在向日葵种植中可能使用的农药种类^{[14, 15, 16, 17]}，剔除不再使用的农药及不能用 GC-MS/MS 准确定量的农药(如福美双等),最终选择了 28 种农药作为目标分析化合物。

表 2 (Table 2)

表 2 农药在向日葵中的登记情况[18] Table 2 Pesticides registration of the sunflower[18] 防治对象名称 Name of objects for the control 常用农药 Pesticides 地下害虫、蚜虫 Underground pest, aphid 辛硫·福美双、噻虫嗪 phoxim·thiram, thiamethoxam 根腐病 Fusarium solani (Mart.) App. et Wollenw. 辛硫·福美双 phoxim·thiram 菌核病 Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary 咯菌腈 fludioxonil 霜霉病 Plasmopara halstedii(Farlow) Berl.et de Toni 精甲霜灵 metalaxyl-m 一年生禾本科杂草及小粒阔叶杂草 Annual grasses and broad-leaved weeds 精异丙甲草胺、高效氟吡甲禾灵 S-metolachlor, haloxyfop-p-methyl

表 2 农药在向日葵中的登记情况[18] Table 2 Pesticides registration of the sunflower[18]

葵花籽中含有大量脂肪、丰富的氨基酸、蛋白质、多种矿物质和多糖等营养成分，采用乙腈作为提取剂，在能充分提取各种目标农药的同时，不可避免地提取出油脂和色素等杂质，干扰目标农药的测定。因此提取液需进一步净化。

本研究选用 V (乙酸乙酯):V (环己烷) = 1:1 为流动相，流速为 4.7 mL/min，将一定浓度的混合标准溶液通过凝胶渗透色谱系统，收集不同时间段的馏分，分别检测各段馏分中农药的含量。在保证较好地去除脂肪前提下，最终确定满足回收率检测要求的目标农药的最佳保留时间为 7～26min，共收集 20 min 馏出液。浓缩定容后样液为浅黄色，但将此样液上机测定时，样品基质干扰仍较大，故需进一步用固相萃取(SPE)小柱(Florisil 和 Carbon/NH₂)净化。结果表明：Carbon/NH₂ 复合柱的净化效果比较好，可获得满意的回收率，且重现性较好；Florisil 柱去除色素的效果较差，其中三唑磷回收率只有 50% 左右。故本研究选择 Carbon/NH₂ 复合柱作为第 2 步净化步骤的净化柱。

采用 MS/MS 技术^{[19, 20, 21, 22]}，以 Xcalibur TraceFinder 工作软件的多反应监测模式，对待测目标农药的色谱条件进行优化。先通过色谱分离全扫描模式确定 28 种农药组分的保留时间。从获得的质谱图中选择分子离子或相对丰度较大、高质量端的一级碎片离子，且能产生较强响应的子离子的碎片离子作为母离子，其他响应较强的碎片离子作为子离子，获得其子离子谱图，最后分别在不同的碰撞能量(5～50 eV)下对多反应监测方法进行优化，选择能使监测到的子离子产生最强响应的碰撞能量作为最终碰撞能量，从而得到优化后的多反应监测条件，结果见表 1。

在优化离子对时，通常使用试剂标准样品筛选得到的响应值最高且稳定的离子对作为定量离子对，如氯氰菊酯的离子对 163→91，其试剂标准样品的响应值较其他离子对高，但在基质标准样品中该离子对特征碎片 m/z 91 的峰形不是尖锐的正常峰形，基质干扰很大(见图 1)，不能准确定性定量；后改为响应值较低的离子对 181→152 (见图 2)，氯氰菊酯4个异构体峰形为正态分布、尖锐且基本对称的峰，选择 181→152 离子对可避免基质的干扰，同时也能满足分析方法对灵敏度的要求^[23]。结果表明，葵花籽样品存在基质背景离子干扰，影响同一时间出峰的目标农药的定性和定量，为了去除假阳性的干扰，使检测结果更加准确，在保证灵敏度的前提条件下，需选用不含背景干扰的离子作为目标物的特征离子。

图 1

Fig. 1

图 1 氯氰菊酯的选择离子定量(a)和定性(b)离子对色谱图 Fig. 1 SIM chromatogram of cypermethrin quantitative (a) and qualitative (b) ion

图 2

Fig. 2

图 2 氯氰菊酯的选择离子定量(a)和定性(b)离子对色谱图 Fig. 2 SIM chromatogram of cypermethrin quantitative (a) and qulitative (b) ion

对配制在溶剂中及在空白基质中的 0.100mg/L 标准溶液分别进行测定，计算峰面积的平均值。结果表明：相对于配制在溶剂中标准品峰面积，配制在基质中标准品峰面积超过 30% 的农药有克百威、杀螟硫磷、马拉硫磷、敌草胺、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯 9种，超过 50% 的农药有乐果、咯菌腈、氟硅唑、三唑磷、异菌脲和苯醚甲环唑 6 种，表明这些农药基质增强效应比较明显。由于 GC-MS/MS 分析中存在基质增强效应^[24]，影响结果的准确性与重复性，因此本研究在使用外标法定量条件下，采用对应的空白基质配制标准曲线进行校正，一定程度上减弱了基质效应对结果的影响。

在 0.01～0.5 mg/L 范围内，各农药定量离子的峰面积与对应的质量浓度间呈良好的线性关系，决定系数均大于 0.994，以被测物质的定量离子对的信噪比为 10 确定定量限在 0.2～7.6 μg/kg 之间，结果见表 3。

表 3 (Table 3)

表 3 28 种农药的平均添加回收率、相对标准偏差、线性方程、决定系数和定量限 Table 3 Recoveries and RSD, linear equations, determination coefficients, and quantitative limits of 28 pesticides 序号 No. 农药 Pesticides 添加水平 Spiked level(n=5)/(µg/kg) 线性方程 Linear equation 决定系数Determination coefficient, R2 定量限LOQ/(μg/kg) 50 100 200 回收率 Recovery /％ 相对偏差 RSD /％ 回收率 Recovery /％ 相对偏差 RSD /％ 回收率 Recovery /％ 相对偏差 RSD /％ 1 敌敌畏 dichlorvos 75 3.9 74 3.6 75 4.9 y = 1.28 × 107x – 4.14 × 104 0.999 6 1.0 2 氟乐灵 trifluralin 93 6.1 86 5.2 81 6.9 y = 8.42 × 106 x – 1.81 × 104 0.999 6 0.7 3 乐果 dimethoate 99 3.0 118 1.8 105 5.7 y = 5.04 × 106 x + 9.37 × 103 0.996 9 0.2 4 克百威 carbofuran 109 4.4 96 3.7 105 3.7 y = 6.53 × 106 x – 2.51 × 104 0.999 4 1.2 5 抗蚜威 pirimicarb 93 0.9 81 7.6 79 2.3 y = 1.04 × 107 x – 3.20 × 104 0.999 7 0.3 6 乙烯菌核利 vinclozolin 101 5.3 96 3.2 88 8.4 y = 2.49 × 106 x – 3.37 × 103 0.999 1 1.5 7 甲霜灵 metalaxyl 106 3.1 102 4.2 93 7.7 y = 2.66 × 106 x – 8.03 × 102 0.999 0 1.4 8 杀螟硫磷 fenitrothion 103 6.9 110 4.9 107 7.0 y = 1.90 × 106 x – 3.90 × 103 0.998 4 0.8 9 马拉硫磷 malathion 118 4.0 102 2.6 102 6.6 y = 9.01 × 106 x – 5.42 × 103 0.999 4 0.3 10 异丙甲草胺 metolachlor 107 4.2 98 5.7 93 7.2 y = 1.53 × 106 x – 3.84 × 103 0.997 4 3.2 11 毒死蜱 chlorpyrifos 97 2.8 95 5.3 88 9.0 y = 3.09 × 106 x – 6.87 × 103 0.999 5 1.2 12 三唑酮 triadimefon 110 5.5 98 5.2 94 5.6 y = 4.30 × 106 x – 6.04 × 103 0.999 2 1.0 13 菌核净 dimethachlon 109 4.6 98 2.7 98 6.9 y = 1.99 × 106 x – 1.85 × 103 0.998 6 0.7 14 仲丁灵 butralin 106 5.0 97 4.4 92 6.4 y = 2.13 × 106 x – 6.84 × 103 0.998 8 1.5 15 甲基异柳磷 isofenphos-methyl 106 7.3 91 5.5 94 6.3 y = 2.62 × 107 x – 5.08 × 104 0.999 7 1.1 16 腐霉利 procymidone 104 5.7 97 4.8 88 7.7 y = 4.20 × 106 x – 5.28 × 103 0.999 5 7.6 17 氟吡甲禾灵 haloxyfop-methyl 99 4.5 96 4.0 89 7.0 y = 3.30 × 106 x – 6.03 × 103 0.999 7 1.4 18 敌草胺 napropamide 105 5.2 98 3.0 91 6.2 y = 2.65 × 106 x + 6.14 × 102 0.998 1 2.8 19 咯菌腈 fludioxonil 120 3.4 117 4.0 110 7.5 y = 7.25 × 106 x – 4.18 × 103 0.994 0 0.5 20 氟硅唑 flusilazole 97 2.9 102 4.6 89 7.4 y = 1.42 × 106 x + 3.10 × 103 0.996 2 1.2 21 三唑磷 triazophos 112 2.5 116 6.5 115 6.6 y = 3.90 × 106 x – 7.06 × 103 0.998 7 0.3 22 异菌脲 iprodione 101 3.6 94 6.4 100 4.3 y = 9.96 × 105 x – 1.63 × 103 0.999 5 1.5 23 氯氟氰菊酯 cyhalothrin 107 3.0 97 5.1 100 6.1 y = 4.59 × 106 x + 7.16 × 103 0.998 2 0.6 24 氯菊酯 permethrin 80 4.8 82 4.6 75 5.6 y = 2.95 × 106 x + 8.51 × 103 0.996 3 0.9 25 氯氰菊酯 cypermethrin 90 2.5 88 7.8 93 5.6 y = 3.43 × 106 x + 8.91 × 103 0.996 3 2.2 26 氰戊菊酯 fenvalerate 87 3.5 85 6.0 91 6.5 y = 5.18 × 106 x + 1.07 × 104 0.997 0 1.7 27 苯醚甲环唑 difenoconazole 98 4.8 98 7.9 114 6.6 y = 6.84 × 106 x + 1.60 × 104 0.994 4 0.4 28 溴氰菊酯 deltamethrin 88 8.0 84 9.5 101 6.8 y = 5.29 × 105 x + 7.15 × 102 0.994 1 5.7

表 3 28 种农药的平均添加回收率、相对标准偏差、线性方程、决定系数和定量限 Table 3 Recoveries and RSD, linear equations, determination coefficients, and quantitative limits of 28 pesticides

我国食品标准^[3]中规定葵花籽中农药的MRL值：苯醚甲环唑(0.02 mg/kg)、氟硅唑(0.1mg/kg)、甲霜灵(0.05 mg/kg)、抗蚜威(0.1mg/kg)、氯菊酯(1 mg/kg)和溴氰菊酯(0.05mg/kg)均高于本方法定量限；此外标准^[3]规定含油种籽中农药的 MRL 值：氯氰菊酯 (0.05mg/kg)和氯氟氰菊酯 (0.2 mg/kg) 也均高于本方法定量限，表明本方法的定量限可满足我国葵花籽残留限量分析要求。

结果 (表 3) 表明：在 50、100 和 200 μg/kg 3 个添加水平下，葵花籽样品中 28 种农药的平均回收率为 74%～120%，相对标准偏差(RSD，n = 5)为 0.9%～9.5%，符合农药残留分析方法的要求^[25]，空白样品与样品添加回收色谱图见图 3。

图 3

Fig. 3

图 3 空白样品(A)和样品添加(50 µg/kg)(B)总离子流图 Fig. 3 TIC chromatogram of blank solution(A) and spiked blank sample (50 µg/kg)(B)

本研究测定了采自成都批发农贸市场 (7 个批次)、瓜籽企业 (2 个批次)和菜市场 (1 个批次) 共 10 个批次的葵花籽样品。测定结果显示，所有样品中均未检出这 28 种农药，表明向日葵实际调查推广使用的一些农药如氯氰菊酯、咯菌腈、甲霜灵和仲丁灵是安全的，未见残留。

本研究建立了气相色谱-串联质谱检测葵花籽样品中 28 种农药的方法。样品经乙腈提取、GPC 及 SPE 净化，背景值显著降低，定量时检测的灵敏度明显提高，其定量限均小于 0.01 mg/kg (国家标准^[3]中农药最大残留限量值均在 0.01 mg/kg 以上)，满足农药最大残留限量的要求，同时通过优化离子对的选择，较好地排除了基质干扰，实现了对基质干扰下出峰不佳农药的准确可靠的分析。该法可应用于葵花籽中农药残留的定性与定量检测，为农药残留的监控和风险评估提供了一种可靠的分析途径。