乙虫腈 (ethiprole) 是由拜耳作物科学公司开发的第二代苯基吡唑类杀虫剂，化学名称 (R,S)-5-氨基-1-(2,6-二氯-对三氟甲基苯基)-4-乙基亚磺 (硫) 酰基吡唑-3-腈基，其分子中具有一个不对称亚砜 (SOC₂H₅) 基团，存在一对手性对映体(图式 1)^[1]，通常以外消旋体的形式生产和使用。乙虫腈与第一代苯基吡唑类杀虫剂氟虫腈的不同之处仅在于由乙基亚磺酰基团取代了三氟甲基亚磺酰基团，因此具有与氟虫腈相似的光化学、代谢活动及杀虫能力^[2]。苯基吡唑类杀虫剂可与昆虫 γ-氨基丁酸 (GABA) 受体非竞争性结合，干扰神经系统门控氯离子通道，引起昆虫神经和肌肉的过度兴奋直至死亡^{[3, 4]}。其中，乙虫腈和氟虫腈是有效控制水稻、玉米、大豆、储粮等已对传统农药产生抗药性害虫的重要杀虫剂，并且对哺乳动物的毒性较低^{[2, 5, 6]}。但由于氟虫腈对甲壳类水生生物和蜜蜂具有高风险性，我国农业部于 2009 年第 1157 号公告中已禁止其在大部分作物上应用^[7]。因此，乙虫腈作为氟虫腈的替代药剂表现出了广泛的应用前景。目前，乙虫腈已在日本取得茶树上使用的登记，在印度尼西亚、巴西、日本、泰国、越南及中国取得了水稻上使用的登记^{[8, 9]}。但国内外对乙虫腈的研究仍主要局限于生物活性、药效、残留分析方法、环境行为及生物体内代谢等方面^{[1, 2, 6, 10, 11, 12, 13]}，尚未见有关其对环境非靶标生物毒性的研究报道。为明确乙虫腈对环境非靶标生物的影响，笔者测定了其对意大利蜜蜂、家蚕和蚯蚓的急性毒性，并就其风险进行了初步评价，以期为乙虫腈的合理使用提供科学依据。

图式 1

Scheme 1

图式 1 乙虫腈对映体分子结构 Scheme 1 Molecular structure of ethiprole enantiomers

手性农药对映体之间虽然具有相同的理化性质，但在生物活性、代谢及毒性等方面往往存在显著差异^[7]。已有研究表明^{[7, 14, 15, 16, 17]}，氟虫腈手性对映体对网纹水蚤 Ceriodaphnia dubia、草虾 Palaemonetes pugio 和克氏原鳌虾 Procambarus clarkii 等表现出了明显的选择性毒性差异，而对意大利蜜蜂 Apis melliferaL.、稻螟赤眼蜂 Trichogramma japonicum Ashmead、非洲爪蟾 Xenopus laevis 和斑马鱼 Danio rerio 等则无明显的毒性差异。目前，有关乙虫腈对映体对环境非靶标生物的选择性毒性差异也尚未见报道。因此，本研究同时从对映体水平比较了乙虫腈对意大利蜜蜂 (成年工蜂)、家蚕 (2 龄起蚕)和蚯蚓 (成蚓) 的急性毒性，探讨了其对映体的选择性毒性差异。

乙虫腈 (ethiprole) 外消旋体标准品 (纯度 98.0%，德国 Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司)；S-(+)-乙虫腈标准品及 R-(-)-乙虫腈标准品[光学纯度均 > 98%，大赛璐药物手性技术 (上海) 有限公司]。

意大利蜜蜂 Apis mellifera L. 由浙江省义乌市佛堂镇王焕兴养蜂场提供，养殖于浙江省农业科学院内。从同一蜂群中选取大小一致、健康的成年工蜂供试。

家蚕 Bombyx mori 品种为秋风 × 白玉，由浙江省农业科学院蚕桑研究所提供。用常规方法催青并饲养至 2 龄起蚕时供试，饲喂桑叶品种为农桑 12 号，采自浙江省农业科学院桑园。

赤子爱胜蚯蚓 Eisenia foetida 由浙江大学动物科学学院蚯蚓养殖场提供，预养于浙江省农业科学院内。挑选 2 月龄以上、体重 400～500 mg 且有明显环带的健康成蚓，在试验条件下清肠 24 h 后供试。

参照经济合作与发展组织 (OECD) 颁布的“化学品测试准则 No. 214” 中的点滴法^[18]，并稍加改进。将乙虫腈外消旋体及两个光学纯对映单体分别用丙酮稀释为 4.48、6.72、10.1、15.1、22.7 和 34.0 mg/L 的系列质量浓度溶液。将蜜蜂转移至塑料网袋并轻轻固定于点滴框上，通过点滴框上纱网孔对准蜜蜂前胸背板处，用微量点滴注射器分别点滴 1.0 μL 不同浓度药液，待丙酮挥发完后立即转入试验笼 (10 cm × 10 cm × 10 cm)中，在 (25 ± 2) ℃、相对湿度 50%～70%、微光照条件下用 50% 蔗糖水饲喂。以纯丙酮处理为溶剂对照，不经任何处理为空白对照，每处理 3 个重复，每重复 10 只蜜蜂。在对照组蜜蜂死亡率小于 10% 的情况下，观察并记录蜜蜂 24 及 48 h 的中毒症状及死亡率，通过寇氏法^[19]计算半数致死剂量 (LD₅₀ 值) 及 95% 置信限。

参照我国《化学农药环境安全评价试验准则》第 11 部分中的食下毒叶法^{[20, 21]}，并稍加改进。将乙虫腈外消旋体及两个光学纯对映单体分别经丙酮溶解后，用含 0.1% Tween-80 的水溶液分别稀释为 21.2、35.4、59.0、98.3、164 和 273 mg/L 的系列质量浓度溶液。分别取 10 g 无污染的桑叶，于 10 mL 各浓度药液中浸渍 10 s，晾干后放入直径为 9 cm 的培养皿中，接入 2 龄起蚕，于 (25 ± 1) ℃、相对湿度 70%～85%、光周期为 14 h︰10 h (光照︰黑暗) 条件下饲养。每处理 3 个重复，每重复 20 头蚕。以含有相同量丙酮的 Tween- 80水溶液处理作为溶剂对照，蒸馏水处理作为空白对照。在对照组家蚕死亡率小于 10% 情况下，观察并记录家蚕 24、48、72 及 96 h 的中毒症状及死亡率，通过寇氏法计算半数致死浓度 (LC₅₀ 值) 及 95% 置信限。

参照 OECD “化学品测试准则 No. 207” 中的滤纸法^[22]，并稍加改进。将乙虫腈外消旋体及两个光学纯对映单体分别用丙酮稀释为 2.50、5.00、10.0、20.0、40.0 和 80.0 g/L 的系列质量浓度药液。分别取 2 mL 各浓度药液均匀滴于培养皿中的滤纸上，置于通风橱中 24 h，待丙酮挥发完后加 2 mL 蒸馏水润湿滤纸，将清肠后的蚯蚓用去离子水冲洗干净并吸干身体表面多余水分，放入培养皿中，用扎好孔的塑料薄膜封口，于 (20 ± 1) ℃、相对湿度 80%～85%、黑暗条件下饲养。以纯丙酮处理为溶剂对照，不经任何处理为空白对照。每处理设 30 个重复，每重复 1 条蚯蚓。在对照组蚯蚓死亡率小于 10% 情况下，观察并记录蚯蚓 24 和 48 h 的中毒症状及死亡率，通过寇氏法计算半数致死用量 (LR₅₀ 值) 及 95% 置信限。

于给药后 4 h 开始观察，药剂处理组蜜蜂出现振动翅膀、爬行不稳等主要中毒症状，高浓度组个别蜜蜂出现蹬腿挣扎、抽搐等症状。计算得到S-(+)-乙虫腈、R-(-)-乙虫腈及其外消旋体对意大利蜜蜂的 48 h-LD₅₀ 值分别为 0.018 1、0.018 8 和 0.018 7 μg/bee (表 1)。参照我国《化学农药环境安全评价试验准则》中农药对蜜蜂的毒性等级划分标准^[23] (剧毒：LD₅₀ ≤ 0.001 μg/bee；高毒：0.001 μg/bee < LD₅₀ ≤ 2.0 μg/bee；中等毒：2.0 μg/bee < LD₅₀ ≤ 11.0 μg/bee；低毒：LD₅₀ > 11.0 μg/bee)，乙虫腈两个对映单体及外消旋体对蜜蜂的急性毒性均为高毒级。以 LD₅₀ (或 LC₅₀) 值的 95% 置信限是否有重叠作为判断毒性差异是否显著的标准^[24]，发现乙虫腈两个对映单体及外消旋体的 LD₅₀ 值相差不大，且其 95% 置信限有显著的重合，因此可认为乙虫腈两个对映单体和外消旋体对意大利蜜蜂的毒性无显著差异。

表 1 (Table 1)

表 1 乙虫腈外消旋体及其两个对映单体对意大利蜜蜂的 48 h-LD50 值、95% 置信限及危害商值 Table 1 The 48 h-LD50 value, 95% confidence level and hazard quotient of ethiprole and its enantiomers to A. mellifera 对映体 Enantiomers LD50/(μg/bee) 95% 置信限 95%CL/(μg/bee) 危害商值 Hazard quotient，HQ S-(+) 0.018 1 0.016 1～0.020 2 3 315 R-(-) 0.018 8 0.016 7～0.021 1 3 191 外消旋体 Racemic (R,S) 0.018 7 0.016 5～0.021 1 3 209

表 1 乙虫腈外消旋体及其两个对映单体对意大利蜜蜂的 48 h-LD50 值、95% 置信限及危害商值 Table 1 The 48 h-LD50 value, 95% confidence level and hazard quotient of ethiprole and its enantiomers to A. mellifera

依据欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)提出的“危害商值” (hazard quotient，HQ，即田间施药量与 LD₅₀ 值的比值) 可初步确定农药对蜜蜂的急性毒性风险：HQ < 50 时，农药对蜜蜂为低风险；50 ≤ HQ ≤ 2 500 为中等风险；HQ > 2 500 为高风险^[25]。依照外消旋体乙虫腈在我国登记的田间最大使用剂量 60 g/hm²，计算可得 S-(+)-乙虫腈、R-(-)-乙虫腈及外消旋体对意大利蜜蜂的 HQ 均＞ 2 500 (表 1)，由此可判断乙虫腈对映单体及外消旋体对蜜蜂均具有高风险性。

给药后不同时间观察，药剂处理组家蚕出现静卧、取食少、体缩等主要中毒症状，高浓度组个别家蚕出现吐液等症状。S-(+)-乙虫腈、R-(-)-乙虫腈及外消旋体对家蚕的 96 h-LC₅₀ 值分别为 63.7、70.3 及 66.9 mg/L (表 2)。参照农药对家蚕的毒性等级划分标准^{[21, 26, 27]} (剧毒：LC₅₀ ≤ 0.5 mg/L；高毒：0.5 mg/L < LC₅₀ ≤ 20 mg/L；中毒：20 mg/L < LC₅₀ ≤ 200 mg/L；低毒：LC₅₀ > 200 mg/L)，乙虫腈两个对映单体及外消旋体对家蚕的急性毒性均为中毒级。从表 2 中可看出，乙虫腈两个对映单体及外消旋体的 LC₅₀ 值相差不大，且其 95% 置信限有显著的重合，因此可认为乙虫腈两个对映单体和外消旋体对家蚕的毒性无显著性差异。

表 2 (Table 2)

表 2 乙虫腈外消旋体及其两个对映单体对家蚕的 96 h-LC50 值和 95% 置信限 Table 2 The 96 h-LC50 value and 95% confidence level of ethiprole and its enantiomers to B. mori 对映体 Enantiomers LC50/(mg/L) 95%置信限 95%CL/(mg/L) S-(+) 63.7 58.4～69.4 R-(-) 70.3 64.7～76.4 外消旋体 Racemic(R,S) 66.9 61.4～73.0

表 2 乙虫腈外消旋体及其两个对映单体对家蚕的 96 h-LC50 值和 95% 置信限 Table 2 The 96 h-LC50 value and 95% confidence level of ethiprole and its enantiomers to B. mori

给药后不同时间观察，药剂处理组蚯蚓出现身体瘫软、蜷缩及活动减弱等主要中毒症状，高浓度组个别蚯蚓身体有黄色液体渗出。S-(+)-乙虫腈、R-(-)-乙虫腈及外消旋体对蚯蚓的 48 h-LR₅₀ 值分别为 488、547 和 511 μg/cm² (表 3)。参照滤纸法测定中农药对蚯蚓的急性毒性等级划分标准^[28] (LR₅₀ 值 ≤ 1.0 μg/cm² 为剧毒；1.0 μg/cm² < LR₅₀ 值 ≤ 10 μg/cm² 为高毒；10 μg/cm² < LR₅₀ 值 ≤ 100 μg/cm² 为中毒；100 μg/cm² < LR₅₀ 值 ≤ 1 000 μg/cm² 为低毒；LR₅₀ 值 > 1 000 μg/cm² 为微毒)，乙虫腈两个对映单体及外消旋体对蚯蚓的急性毒性均为低毒级。从表 3 中可看出，乙虫腈两个对映单体及外消旋体的 LR₅₀ 值相差不大，且其 95% 置信限有显著的重合，因此可认为乙虫腈两个对映单体和外消旋体对蚯蚓的毒性无显著性差异。

表 3 (Table 3)

表 3 乙虫腈外消旋体及其两个对映单体对蚯蚓的 48 h-LR50 值和 95% 置信限 Table 3 The 48 h-LR50 value and 95% confidence level of ethiprole and its enantiomers to E. foetida 对映体 Enantiomers LR50/(μg/cm2) 95%置信限 95%CL/(μg/cm2) S-(+) 488 375～633 R-(-) 547 431～695 外消旋体 Racemic(R,S) 511 405～644

表 3 乙虫腈外消旋体及其两个对映单体对蚯蚓的 48 h-LR50 值和 95% 置信限 Table 3 The 48 h-LR50 value and 95% confidence level of ethiprole and its enantiomers to E. foetida

本研究结果显示，乙虫腈对意大利蜜蜂的急性毒性为高毒级，与笔者等^[7]前期采用相同方法测得氟虫腈对意大利蜜蜂的 48 h-LD₅₀ 值为 0.003 83 μg/bee 相比，可知乙虫腈对意大利蜜蜂的毒性较氟虫腈显著降低。在采用危害商值法初步评估乙虫腈对意大利蜜蜂的风险时，为保证评估结果的可靠性，采用了乙虫腈在水稻上的最大登记剂量进行计算，结果表明其对意大利蜜蜂具有高风险性。

测定结果表明，乙虫腈对家蚕的急性毒性为中毒级。朱金文等^[29]及吴声敢等^[30]采用与本文相同的方法及相同龄期家蚕，测得氟虫腈的 LC₅₀ 值分别为 4.89 mg/L (48 h) 和 1.60 mg/L (72 h)，若将试验终点延长至 96 h，其 LC₅₀ 值应小于等于此结果。与上述报道相比，本研究中乙虫腈对家蚕的毒性较氟虫腈显著降低。乙虫腈在我国仅登记用于防治水稻稻飞虱，根据其在水稻上的最大登记使用剂量 60 g/hm² 及尽可能少的田间用水量 450 L/hm² 计算，其最大施用质量浓度约为 133 mg/L。由于稻飞虱发生时期与家蚕饲养期重叠时间长，且乙虫腈在水稻上的最大施用质量浓度约为其对 2 龄起蚕 96 h-LC₅₀ 值的 2 倍左右，因此，在稻-桑混栽区的水稻上使用乙虫腈对附近家蚕可能存在一定风险。

试验测得乙虫腈对蚯蚓的急性毒性为低毒级。冯秀斌等^[31]采用与本文相同的方法，测得氟虫腈外消旋体对蚯蚓的 48 h-LC₅₀ 值为 321.28 mg/L，折算为 48 h-LR₅₀ 值为 10.23 μg/cm²。与之相比，本研究中乙虫腈外消旋体对蚯蚓的毒性较氟虫腈显著降低。由于滤纸法试验过程是农药与蚯蚓直接接触，可以快速地初步反映农药的固有毒性和对蚯蚓的潜在毒性，但无法模拟蚯蚓的真实生活环境。当农药施用于田间后，土壤表面的农药会被土壤胶体和有机质吸附，并通过光、化学氧化和微生物等途径降解，使蚯蚓与农药接触的效率大大降低，故使用滤纸法测定的数据评价药剂对蚯蚓的毒性风险更为可靠^[32]。但目前尚未见采用滤纸法测得的毒性数据进行风险评估的相关标准及报道，且稻田也并非蚯蚓的主要栖息地，故本研究未就乙虫腈对蚯蚓的风险进行评价。

综上所述，乙虫腈作为第二代苯基吡唑类杀虫剂，其对意大利蜜蜂、家蚕及蚯蚓 3 种非靶标生物的急性毒性较第一代的氟虫腈均有显著降低，但初步的风险评估表明其对意大利蜜蜂仍具有高风险性，因此还需进一步通过半田间、田间等高级风险评估程序确定其对蜜蜂的风险。田间使用乙虫腈时应注意风向，防止药剂漂移至周围桑园对桑叶造成污染，同时应避免在作物花期施药，以减少其对家蚕和蜜蜂的危害。本研究仅针对乙虫腈对意大利蜜蜂、家蚕和蚯蚓的急性毒性进行了分析，但农药对非靶标生物除急性毒性外，还可能存在亚致死效应、慢性毒性及种群影响等多方面作用，如影响非靶标生物的生长发育、繁殖情况、生命周期及种群密度等，因此还需进一步就上述问题进行深入研究，才能全面评价乙虫腈对非靶标生物的影响。

此外，本研究中乙虫腈对意大利蜜蜂、家蚕和蚯蚓的急性毒性均未表现出明显的对映体选择性，因此对映单体的应用并不能降低其对上述 3 种非靶标生物的危害。但由于生物种类对手性农药对映体的选择性具有很大影响，本结果并不能证明乙虫腈对鸟类、鱼类、两栖类、甲壳类、溞类及天敌类等其他环境生物是否具有对映体选择性，因此，下一步还需进行乙虫腈对其他非靶标生物的对映体毒性差异研究，以便更科学、合理地评价乙虫腈对非靶标生物的毒性及风险。