引用本文
李兴海, 芮朋, 潘强, 陈小员, 祁之秋, 纪明山. 2-氧代-2-苯基乙磺酰胺化合物组合合成与杀菌活性研究[J]. 农药学学报,2016,18(1): 28-36, doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2016.0003
LI Xinghai, RUI Peng, PAN Qiang, CHEN Xiaoyuan, QI Zhiqiu, JI Mingshan. Combined synthesis and fungicidal activity evaluation of the 2-oxo-2-phenyl ethyl sulfonamide derivatives[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016,18(1): 28-36, doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2016.0003
2-氧代-2-苯基乙磺酰胺化合物组合合成与杀菌活性研究
李兴海
, 芮朋, 潘强, 陈小员, 祁之秋, 纪明山
投稿时间: 2015-12-01 录用日期: 2015-12-21 .
基金项目: 辽宁省自然科学基金(2015020766);辽宁省教育厅优秀人才项目(LJQ2012059);国家自然科学基金(31101466).
通讯作者:李兴海,男,博士,副教授,主要从事农药合成与杀菌活性研究,E-mail:xinghai30@163.com
摘要: 为了快速获得具有高效杀菌活性的先导化合物,利用组合化学与传统合成方法相结合的方案,研究了N-取代-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺类化合物对灰霉病菌的杀菌活性。首先以苯乙酮为原料,经过磺化、氯化反应,制备得到2-氧代-2-苯基乙磺酰氯,再分别与苯胺、苄胺和烷基胺组合库反应,制备了33个组合库,其中包含105个化合物,收率在60%~90%之间,纯度在70%~95%之间。筛选其中的10个活性库进行平行合成,得到29个化合物,又对其中10个活性化合物进行了纯化与结构鉴定。最后用灰霉病菌Botrytis cinerea对所有组合库与化合物进行离体与活体双重筛选,快速确定了高活性先导化合物,为进一步的结构优化奠定了基础。
关键词:
乙磺酰胺
组合化学
灰霉病菌
杀菌活性
构效关系
Combined synthesis and fungicidal activity evaluation of the 2-oxo-2-phenyl ethyl sulfonamide derivatives
LI Xinghai
, RUI Peng, PAN Qiang, CHEN Xiaoyuan, QI Zhiqiu, JI Mingshan
Plant Protection College, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
Abstract: In order to rapidly prepare novel lead compounds of fungicides, the method that involved both the combinatorial chemistry and the conventional synthesis was used. The fungicidal activity against Botrytis cinerea of the N-substituted-2-oxo-2-phenyl ethyl sulfonamide derivatives were investigated. Firstly, 2-oxo-2-phenyl ethyl sulfonyl chloride was prepared by the sulfonation and chlorination of acetophenone. Then 33 combinatorial libraries, which contained 105 compounds, were synthesized by the reaction of 2-oxo-2-phenyl ethyl sulfonyl chloride respectly with aniline, benzylamine or alkyl amine combination library. The yields ranged from 60% to 90% and the purity was 70%-95%. Twenty-nine compounds were synthesized in parallel with 10 active libraries, within which 10 active compounds were purified and identified. In vitro and in vivo, all combination libraries and compounds were screened by Botrytis cinerea. Finally, the high activity lead compound was quickly determined, which lay the foundation for further structural optimization.
Key words:
ethyl sulfonamide
combinatorial chemistry
Botrytis cinerea
fungicidal activity
structureactivity relationship
2-氧代环烷基磺酰胺类化合物 (1) 具有良好的杀菌活性[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]。将化合物 1 中的环状结构改为链状结构，2008 年笔者合成并报道了 14 个 N-取代苯基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺类化合物 (2)，发现其具有更加优异的杀菌活性[10]，但苯基上取代基的变化相对较少。笔者曾经利用组合化学的方法成功地研究了2-酰氧基环己烷基磺酰胺类化合物的杀菌活性[11]。
为了进一步研究该类化合物与杀菌活性之间的构效关系，快速寻找到具有更高杀菌活性的新化合物，本研究将组合化学的方法应用到 N-取代-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺类化合物的合成与杀菌活性研究中，逐步采用混合物合成、平行合成和传统合成相结合的方案构建组合库与合成化合物。以灰霉病菌为供试靶标，分别采用菌丝生长速率法和黄瓜活体叶片法对合成的组合库及化合物进行杀菌活性测定，探究 N 上取代基分别为取代苯基、苄基和烷基时与杀菌活性之间的关系。组合库与化合物的合成路线见图式 1。
1 材料与方法
1.1 仪器与药剂
X-5 型熔点测定仪 (温度计未校正)。Bruker 300-MHz 型核磁共振仪 (TMS 为内标，溶剂为 CDC13) Spectrum65 傅立叶红外变换光谱仪 (KB 压片法)。日立 L-2100 高效液相色谱仪 (HPLC))：Kromasil 5U- C18 色谱柱 (4.6 mm × 250 mm)；柱温 35 ℃；流速 1 mL/min；紫外检测波长 254 nm；进样体积 100 μL。流动相：色谱甲醇和娃哈哈纯净水，采用梯度洗脱，调整检测器流动相为：甲醇 60%～75% 20 min，75%～85% 5 min，85%～95% 5 min，95%～60% 5 min。R-210 旋转蒸发仪 (Buchi Rotavapor)。WD-9403A 型紫外-荧光分析仪 Agilent 7890A 5975MSD 气相色谱-质谱联用仪。70.25 μm)；载气为氦气，流速 1 mL/min；进样口温度 250 ℃；检测器温度 280 ℃；升温程序：初始温度2530 ℃/min 的速率升至 298 ℃，保持 8 min；柱流量为 1 mL /min；进样体积 1 μL (不分流进样)。质谱条件：接口温度 280 ℃，离子源温度 230 ℃；电离方式 EI；电离能量 70 eV；溶剂延迟：5 min；全扫描监测模式。
1.2 供试菌株
黄瓜灰霉病菌 Botrytis cinereaPers.，由沈阳农业大学植物保护学院农药科学教研室采集、分离、培养并保存。
1.3 合成试验
1.3.1 组合库的合成
参照文献[10]的方法制备 2-氧代-2-苯基乙磺酸钾 (I)。室温下，将化合物 (I) 3.2 g (0.013 5 mol)、无水二氯甲烷 32 mL 和 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 0.3 mL 加入 100 mL 三口瓶中，搅拌 10 min 后加入草酰氯 1.3 mL (0.014 9 mol)，反应 3 h，抽滤得磺酰氯 (II) 的二氯甲烷溶液。在另一 100 mL 三口烧瓶中，依次加入 2-甲基苯胺、3-甲基苯胺、4-甲基苯胺各 0.33 g (0.003 mol)、三乙胺 2.3 mL (0.016 4 mol) 和二氯甲烷 15 mL，冰浴冷却至 0 ℃。滴加上步制得的磺酰氯 (II) 溶液，控制温度 < 5 ℃。滴毕自然升温到室温继续搅拌 3 h，采用薄层层析 (TLC) 法[V (石油醚) :V (乙酸乙酯) = 3:1]确定原料反应完全后，停止反应。将所得溶液转入分液漏斗，依次用 6 mol/L 的 盐酸 15 mL、饱和碳酸氢钠溶液 20 mL、水 20 mL × 2 洗涤后，用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩后得组合库 III-1，计算收率，用 HPLC 分析组合库中目标化合物的含量。
参照此方法合成其他组合库。组合库分为 4 种类型，分别为：N-单取代苯基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库(苯环上单取代基的结构相同而取代位置不同)；N-多取代苯基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库(苯环上多取代基的类型相同而取代位置不同)；N-取代苄基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库(苄基苯环上取代基的性质相近)；N-取代烷基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库。组合库中化合物的结构见表 1～表 3。
表 1
(Table 1)
表 1 N-取代苯基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库合成结果与杀菌活性
Table 1 Synthesis and fungicidal activity of libraries of N-substituted phenyl-2-oxo-2-phenyl ethylsulfonamide
 |
| 库编号Library number |
库化合物结构(R3)Structure of compounds in library (R3) |
合成结果Synthetic result |
杀菌活性Fungicidal activity |
| 1 |
2 |
3 |
收率Yield/% |
库化合物含量Percentage composition of single component/% |
EC50/(μg/mL) |
抑制率Inhibition rate/%(叶片法, Leaf method) |
| III-1 |
2-CH3 |
3-CH3 |
4-CH3 |
89.5 |
26:27:36 |
11.89 |
56.95 |
| III-2 |
2-OCH3 |
3-OCH3 |
4-OCH3 |
92.3 |
27:32:29 |
63.52 |
36.72 |
| III-3 |
2-OCF3 |
3-OCF3 |
4-OCF3 |
90.5 |
32:33:32 |
12.60 |
60.61 |
| III-4 |
2-F |
3-F |
4-F |
91.2 |
31:32:30 |
2.54 |
75.26 |
| III-5 |
2-Cl |
3-Cl |
4-Cl |
88.6 |
35:29:31 |
37.33 |
43.78 |
| III-6 |
2-Br |
3-Br |
4-Br |
93.4 |
21:36:30 |
17.35 |
47.20 |
| III-7 |
2-CF3 |
3-CF3 |
4-CF3 |
94.1 |
34:28:33 |
11.28 |
41.43 |
| III-8 |
2-CN |
3-CN |
4-CN |
91.3 |
29:38:30 |
51.52 |
79.96 |
| III-9 |
2-NO2 |
3-NO2 |
4-NO2 |
92.2 |
16:27:52 |
19.81 |
77.32 |
| III-10 |
2-OH |
3-OH |
4-OH |
95.1 |
35:24:30 |
44.67 |
88.91 |
| III-11 |
4-Br-2-OCF3 |
3-Cl-4-OCF3 |
2-F-5- OCF3 |
74.3 |
23:27:41 |
7.03 |
91.35 |
| III-12 |
2,4-F2 |
2,5-F2 |
3,4-F2 |
78.6 |
38:29:20 |
13.23 |
92.86 |
| III-13 |
2,4-Cl2 |
2,5-Cl2 |
3,4-Cl2 |
83.6 |
31:30:33 |
3.68 |
96.43 |
| III-14 |
4-Br-2-F |
4-Br-3-F |
2-Br-4-F |
79.9 |
32:24:33 |
12.31 |
82.57 |
| III-15 |
4-F-2-CF3 |
2-F-3-CF3 |
2-F-5-CF3 |
82.4 |
19:32:28 |
6.04 |
69.29 |
| III-16 |
2-CF3-4-Cl |
2-Cl-4-CF3 |
2-Cl-5-CF3 |
73.9 |
26:38:33 |
8.40 |
89.43 |
| III-17 |
2-Br-5-CF3 |
4-Br-3-CF3 |
4-Br-2-CF3 |
89.3 |
34:30:29 |
6.53 |
88.62 |
| III-18 |
2,4-(CF3)2 |
2,5-(CF3)2 |
3,5-(CF3)2 |
85.1 |
21:29:34 |
2.25 |
75.26 |
| III-19 |
2-F-5-NO2 |
2-Cl-4-NO2 |
4-Br-2-NO2 |
80.4 |
22:34:40 |
4.12 |
65.86 |
| III-20 |
2,3,4-F3 |
2,4,5-F3 |
2,4,5-Cl3 |
82.2 |
31:26:37 |
4.51 |
69.56 |
| III-21 |
4,5-F2-2-NO2 |
2,6-F2-4-CF3 |
2,6-Cl2-4-OCF3 |
79.1 |
22:33:38 |
7.92 |
68.27 |
| III-22 |
4-OH-2-F |
4-OH-3-F |
2-OH-4-F |
80.7 |
23:30:37 |
11.21 |
62.15 |
| III-23 |
3-CN-4-F |
2-CN-3-F |
4-CN-2-F |
82.6 |
32:28:30 |
20.97 |
72.16 |
| 腐霉利 procymidone |
|
|
|
|
1.70 |
93.45 |
| 啶酰菌胺 boscalid |
|
|
|
|
1.10 |
98.68 |
|
表 1 N-取代苯基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库合成结果与杀菌活性
Table 1 Synthesis and fungicidal activity of libraries of N-substituted phenyl-2-oxo-2-phenyl ethylsulfonamide
|
表 2
(Table 2)
表 2 N-取代苄基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库的合成结果与杀菌活性
Table 2 Synthesis and fungicidal activity of libraries of N-substituted benzyl-2-oxo-2-phenyl ethylsulfonamide
 |
| 库编号Library number |
库化合物结构(R4)Structure of compounds in library (R4) | |
合成结果Synthetic result |
|
杀菌活性Fungicidal activity |
| 1 |
2 |
3 |
4 |
收率Yield/% |
库化合物含量Percentage composition ofsingle component/% |
EC50/(μg/mL) |
抑制率Inhibition rate/%(叶片法,Leaf method) |
| III-24 |
2-CH3 |
2-OCH3 |
/ |
/ |
|
74.6 |
46:41 |
|
50.44 |
78.57 |
| III-25 |
3-OCH3 |
/ |
/ |
/ |
82.1 |
87 |
469.0 |
79.28 |
| III-26 |
4-CH3 |
4-OCH3 |
4-OH |
/ |
85.2 |
25:22:24 |
79.11 |
67.86 |
| III-27 |
2-F |
2-Cl |
2-CF3 |
/ |
84.3 |
32:23:25 |
22.31 |
51.87 |
| III-28 |
3-F |
3-Cl |
3-CF3 |
/ |
89.8 |
38:23:24 |
174.6 |
64.28 |
| III-29 |
4-F |
4-Cl |
4-CF3 |
4-Br |
79.6 |
21:24:17:20 |
20.58 |
54.24 |
| III-30 |
2,5-(OCH3)2 |
2,4-Cl2 |
/ |
/ |
82.5 |
57:35 |
50.44 |
78.57 |
| 腐霉利 procymidone |
|
1.70 |
93.45 |
| 啶酰菌胺 boscalid |
|
1.10 |
98.68 |
|
表 2 N-取代苄基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库的合成结果与杀菌活性
Table 2 Synthesis and fungicidal activity of libraries of N-substituted benzyl-2-oxo-2-phenyl ethylsulfonamide
|
表 3
(Table 3)
表 3 N-烷基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库合成结果与活性
Table 3 Synthesis and fungicidal activity of libraries of N-alkyl-2-oxo-2-phenyl ethylsulfonamide
 |
| 库编号Library number |
库化合物结构Structure of compounds in library |
|
合成结果Synthetic result |
|
杀菌活性Fungicidal activity |
| 1 |
|
2 |
|
3 |
|
4 |
收率Yield/% |
库化合物含量Percentage compositionof single component/% |
EC50/(μg/mL) |
抑制率Inhibition rate/%(叶片法, Leaf method) |
| Ra |
Rb |
Ra |
Rb |
Ra |
Rb |
Ra |
Rb |
| III-31 |
H |
CH3 |
|
H |
C2H5 |
|
H |
C3H7-n |
|
H |
C3H7-i |
|
84.3 |
23:28:18:19 |
|
6.86 |
68.71 |
| III-32 |
H |
C4H9-n |
|
H |
Cyclo-C6H12 |
|
H |
C8H17-n |
|
/ |
|
85.0 |
27:35:30 |
|
43.9 |
82.14 |
| III-33 |
C4H9-n |
C4H9-n |
|
C3H7-n |
C3H7-n |
|
/ |
|
/ |
|
89.4 |
46:49 |
|
138.7 |
96.43 |
| 腐霉利 procymidone |
|
|
1.7 |
93.45 |
| 啶酰菌胺 boscalid |
|
|
1.1 |
98.68 |
|
表 3 N-烷基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库合成结果与活性
Table 3 Synthesis and fungicidal activity of libraries of N-alkyl-2-oxo-2-phenyl ethylsulfonamide
|
1.3.2 活性库的平行合成
合成方法同 1.3.1 节，用 HPLC 检测产物的含量，结果见表 4。
表 4
(Table 4)
表 4 平行合成结果与杀菌活性
Table 4 Result and fungicidal activity of parallel synthesis
| 库化合物编号Number of Libraries |
Ra |
Rb |
物态(室温)State (r. t. ) |
收率Yield/% |
质量分数/%Percentage composition |
EC50/(μg/mL) |
抑制率Inhibition ratie/%(叶片法, Leaf method) |
| III-4-1 |
H |
2-FC6H4 |
黄色固体Yellow solid |
90.2 |
84.0 |
70.81 |
36.53 |
| III-4-2 |
H |
3-FC6H4 |
黄色固体Yellow solid |
88.3 |
87.2 |
66.64 |
30.86 |
| III-4-3 |
H |
4-FC6H4 |
红棕色固体Red brown solid |
87.5 |
91.7 |
49.43 |
44.44 |
| III-10-1 |
H |
2-OHC6H4 |
深红色固体Deep red solid |
79 |
78.8 |
20.04 |
25.31 |
| III-10-2 |
H |
3-OHC6H4 |
红棕色固体Red brown solid |
83.4 |
84.3 |
62.38 |
15.43 |
| III-10-3 |
H |
4-OHC6H4 |
黄色固体Yellow solid |
89.5 |
86.2 |
22.42 |
24.07 |
| III-11-1 |
H |
2-OCF3-4-BrC6H3 |
红棕色液体Red brown liquid |
80.2 |
82.8 |
70.81 |
36.53 |
| III-11-2 |
H |
3-Cl-4-OCF3C6H3 |
红棕色固体Red brown solid |
81.3 |
85.9 |
66.64 |
30.86 |
| III-11-3 |
H |
2-F-5-OCF3C6H3 |
红棕色液体Red brown liquid |
82.4 |
86.1 |
49.43 |
44.44 |
| III-12-1 |
H |
2,4-F2C6H3 |
棕色固体Brown solid |
79.5 |
78.3 |
204.56 |
25.31 |
| III-12-2 |
H |
2,5-F2C6H3 |
红棕色固体Red brown solid |
74.6 |
82.6 |
84.65 |
65.43 |
| III-12-3 |
H |
3,4-F2C6H3 |
红棕色固体Red brown solid |
78.9 |
69.4 |
22.42 |
74.07 |
| III-13-1 |
H |
2,4-Cl2C6H3 |
浅灰色固体Light gray solid |
80.1 |
83.5 |
10.59 |
56.80 |
| III-13-2 |
H |
2,5-Cl2C6H3 |
灰色固体Gray solid |
85.3 |
82.9 |
5.39 |
67.90 |
| III-13-3 |
H |
3,4-Cl2C6H3 |
白色固体White solid |
88.1 |
84.2 |
6.33 |
76.54 |
| III-14-1 |
H |
2-F-4-BrC6H3 |
红棕色固体Red brown solid |
75.9 |
83.7 |
30.87 |
68.14 |
| III-14-2 |
H |
3-F-4-BrC6H3 |
红棕色固体Red brown solid |
78.6 |
81.3 |
12.67 |
70.94 |
| III-14-3 |
H |
4-F-2-BrC6H3 |
红棕色固体Red brown solid |
80.1 |
81.4 |
38.42 |
54.94 |
| III-16-1 |
H |
2-CF3-4-ClC6H3 |
红棕色固体Red brown solid |
85.3 |
83.6 |
20.50 |
75.97 |
| III-16-2 |
H |
2-Cl-4-CF3C6H3 |
红棕色固体Red brown solid |
84.2 |
86.9 |
18.42 |
57.16 |
| III-16-3 |
H |
2-Cl-5-CF3C6H3 |
浅黄色固体Light yellow solid |
83.5 |
80.7 |
8.88 |
44.44 |
| III-18-1 |
H |
2,4-(CF3)2C6H3 |
红棕色液体Red brown liquid |
76.2 |
79.1 |
8.30 |
58.40 |
| III-18-2 |
H |
2,5-(CF3)2C6H3 |
红棕色固体Red brown solid |
78.3 |
85.3 |
10.99 |
49.14 |
| III-18-3 |
H |
3,5-(CF3)2C6H3 |
浅黄色固体Light yellow solid |
80.4 |
84.9 |
17.62 |
67.28 |
| III-20-1 |
H |
2,3,4-F3C6H2 |
红棕色固体Red brown solid |
78.6 |
79.8 |
33.05 |
54.07 |
| III-20-2 |
H |
2,4,5-F3C6H2 |
浅黄色固体Light yellow solid |
71.2 |
83.1 |
18.72 |
67.17 |
| III-20-3 |
H |
2,4,5-Cl3C6H2 |
红棕色固体Red brown solid |
76.6 |
82.2 |
7.35 |
68.65 |
| III-33-1 |
C4H9-n |
C4H9-n |
无色晶体Colorless crystals |
82.1 |
84.8 |
24.24 |
78.64 |
| III-33-2 |
C3H7-n |
C3H7-n |
淡黄色液体Pale yellow liquid |
80.3 |
91.5 |
49.55 |
73.25 |
| 啶酰菌胺boscalid |
|
|
|
|
|
1.12 |
97.53 |
| 腐霉利procymidone |
|
|
|
|
|
1.73 |
94.44 |
|
表 4 平行合成结果与杀菌活性
Table 4 Result and fungicidal activity of parallel synthesis
|
1.3.3 活性化合物的纯化与结构鉴定
采用硅胶柱层析对活性化合物进行纯化，用 1H NMR、IR 和 HPLC-MS 进行结构鉴定。
1.4 杀菌活性筛选方法
参照文献[11]方法进行。
1.4.1 菌丝生长速率法
采用菌丝生长速率法[12]测定组合库及各化合物对番茄灰霉病菌的活性。以 97% 腐霉利 (procymidone) 原药和 98% 啶酰菌胺 (boscalid) 原药为对照药剂。按照组合库中化合物的总含量计算有效浓度，分别设置 n × 50 μg/mL、n × 12.5 μg/mL、n × 3.125 μg/mL 3 个质量浓度梯度，其中 n 是库中化合物的个数，计算 EC50 值并考察杀菌活性。
1.4.2 黄瓜活体叶片法
将组合库与各供试化合物分别配制成质量分数为 5% 的乳油：准确称取 0.025 g 供试化合物，用 0.05 mL 甲醇溶解后，加入 3.75 mg 农乳 500 与 21.25 mg 农乳 600，混匀后用二甲苯补足到 0.5 mL，即为 5% 的乳油制剂。用水稀释得到 n × 500 μg/mL，其中 n 是库中化合物的个数。待黄瓜幼苗长至两片子叶时，将配制好的药液均匀喷洒到黄瓜叶片上。每处理设 5 个重复。待药液自然晾干后，在每片子叶中部接种一块直径为 5 mm 的灰霉病菌菌饼。以 5% 啶酰菌胺乳油和 5% 腐霉利乳油为对照药剂，以喷洒不含目标化合物的乳油水溶液为空白对照。将处理后的叶片置于智能人工气候箱内，在 24 ℃ ± 1 ℃、相对湿度 90% 以上及黑暗:光照 = 12 h:12 h 条件下培养，待空白对照充分发病后测量病斑直径，以抑制率大小考察防治效果。
2 结果与分析
2.1 2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库合成与杀菌活性
经 TLC 检测确认组合库中已无原料胺，同时 IR 谱图中，在 1 650～1 700 cm-1 之间有明显的羰基吸收峰，说明原料已充分反应。采用 HPLC 对合成的 33 个组合库进行含量分析，结果 (表 1～ 表 3) 表明：组合库中各化合物的含量均在 80% 以上，而且其含量比较接近。这主要是因为，在本研究中将含有相同取代基或同类型取代基的苯胺、苄胺和烷基胺组合成相应的原料库，由于其与磺酰氯的反应活性接近，从而保证了组合库中各化合物的含量接近。这一结果对正确选择活性库非常重要。组合库 III-3 与 III-33 的 HPLC 色谱图见图 1。
菌丝生长速率法测得的 33 个组合库杀菌活性结果见表 1～表 3。从组合库类型来看，整体上活性大小顺序是 N-多取代苯基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺组合库 (III-11～III-23) > N-单取代苯基组合库 (III-1～III-10) > N-取代烷基组合库 (III-31～III-33) > N-取代苄基组合库 (III-24～III-30)。N-单取代苯胺类组合库中的结果具有一致性，从苯环上取代基类型看，取代基的活性关系为 F > CF3 > OCF3 > Br > NO2 > CH3 > Cl > OH > CN > OCH3，可见当苯环上含有氟元素时，有助于提高活性。在 N-多取代苯基组合库中，当苯环上取代基为 (CF3)2、Cl 和 NO2 时有助于活性的提高；在 N-取代烷基组合库中，当烷基为较小基团如-CH3 和-C2H5 时有助于提高活性；N-取代苄基组合库的杀菌活性普遍较差。
活体叶片法测定的结果见表 1～表 3。从组合库类型来看，整体活性大小顺序为 N-多取代苯基组合库 > N-取代烷基组合库 > N-取代苄基组合库 > N-单取代苯基组合库。在 N-单取代苯基组合库中，含有极性亲水基团 OH、CN和 NO2 的组合库表现出了较好的防治效果，这与菌丝生长速率法的试验结果相反。分析其原因：可能是由于离体试验体现的是药剂与病菌两者之间的关系，应该是微观和生化层面的活性，能够确定化合物对病原菌的直接抑制活性是有效的；而活体盆栽试验体现的是药剂、病原菌和植物3者之间的关系，与药剂在植株体上的附着、吸收、传导乃至抗病诱导等性能有密切关系。从结构优化角度分析，在苯环上不仅要引入 F、CF3和OCF3 等疏水性基团，还要引入 OH、CN和NO2 等亲水性基团，这样的分子结构可能会具有更好的离体与活体的活性。
基于以上分析，合成了一些含有 OCF3、CF3、Br、NO2、F、Cl、CH3、OCH3、OH、CN 和 NO2 取代基的二取代和三取代苯基的新化合物库，并进行了杀菌活性评价。N-多取代苯基组合库的活体防效普遍较高，其中 III-11、III-12 和 III-13 对黄瓜灰霉病菌的防效达到了 90% 以上，接近对照药剂腐霉利和啶酰菌胺；N-取代苄基组合库的活体防效普遍低于 80%，苯环上取代基与活性之间没有明显的构效关系；N-取代烷基组合库只有 3 个，但其中 III-33 对黄瓜灰霉病菌的抑制率达到 96.43%，其氮上无活泼氢，取代基分别为两个-C4H9-n 或 -C3H7-n。这一结构与常见的具有良好杀菌活性的 N,N-二甲氨基磺酰胺的结构类似。
2.2 2-氧代-2-苯基乙磺酰胺的平行合成与杀菌活性
根据离体与活体杀菌活性测定结果，选取了 10 个组合库，库中化合物被一一平行合成出来，收率普遍较高，基本都在 69% 以上，多数在 80% 左右，其含量普遍在 78.3%～93.7% 之间。化合物的颜色和物态与取代基的类型和位置有关。当取代基为 F、Cl、Br 时化合物的颜色为黄色或淡黄色，当取代基为两个 F 或为 F 和 Br 时，化合物的颜色为红棕色。每个化合物的理化数据及杀菌活性见表 4。从 EC50 值来看，在 29 个化合物中，有 5 个小于 10 μg/mL，EC50 值在 10～30 μg/mL 之间的有 11 个，有 6 个化合物的 EC50 值在 30～50 μg/mL 之间，有 7 个化合物的 EC50 值在 50 μg/mL 以上。单个化合物的杀菌活性与对照药剂相比，普遍低于啶酰菌胺和腐霉利。其中 EC50 值较小的 5 个化合物为 N-多取代苯基-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺类化合物，这一研究结果与前面组合库的杀菌效果一致。从构效关系来看，当苯环上含两个 Cl，含 Cl和 CF3 以及含 3 个 F 时有助于活性的提高。活体杀菌活性测定结果表明，有 12 个化合物的活体防效超过 60%，多数化合物的活体杀菌活性与离体活性之间具有相关性。
2.3 活性化合物的纯化、结构鉴定与杀菌活性
采用硅胶柱层析法对 10 个高活性平行合成化合物进行了纯化，分别采用 1H NMR、IR 和 HPLC-MS 进行了结构鉴定，结果见表 5。杀菌活性测定结果见表 6。10 个化合物中，III-13-2、III-16-1、III-18-3 和 III-20-2 的 EC50 值小于 10 μg/mL。从 EC80 值来看，化合物 III-13-2、III-18-3 和 III-20-2 的杀菌活性更优。利用 SPSS 22.0 软件对采用黄瓜活体叶片法测得的结果进行分析表明：在 500 μg/mL 下，化合物 III-16-1 和 III-20-2 对灰霉病菌的防效达 70% 以上，与对照药剂腐霉利无显著性差异。构效关系结果表明，苯环上含有氟原子或三氟甲基时，化合物的杀菌活性高，含取代烷基的活性最低。
表 5
(Table 5)
表 5 活性化合物的 1H NMR 和 IR 数据
Table 5 1H NMR, IR and MS data of active compounds
| III-12-3 |
4.55 (s, 2H, CH2), 7.04～7.94 (m, 9H, C6H5 + C6H3 + NH) |
3 277 (NH), 1 677 (C=O) |
312.20 (M+ + 1) |
| III-13-2 |
4.73 (s, 2H, CH2), 7.08～7.92 (m, 9H, C6H5 + C6H3 + NH) |
3 320 (NH), 1 681 (C=O) |
343.18 (M+) |
| III-13-3 |
4.57 (s, 2H, CH2), 7.00～7.92 (m, 9H, C6H5 + C6H3 + NH) |
3 272 (NH), 1 686 (C=O) |
343.18 (M+) |
| III-14-2 |
4.56 (s, 2H, CH2), 7.05 (br, 1H, NH), 7.20～7.93 (m, 8H, C6H5 + C6H3) |
3 277 (NH), 1 674 (C=O) |
372.12 (M+) |
| III-16-1 |
4.75 (s, 2H, CH2), 7.33 (br, 1H, NH), 7.50～7.93 (m, 8H, C6H5 + C6H3) |
3 296 (NH), 1 685 (C=O) |
378.17 (M+) |
| III-18-3 |
4.62 (s, 2H, CH2), 7.47～7.94 (m, 9H, C6H5 + C6H3 + NH) |
3 204 (NH), 1 658 (C=O) |
412.20 (M+ + 1) |
| III-20-1 |
4.69 (s, 2H, CH2), 7.25～9.80 (m, 8H, C6H5 + C6H2 + NH) |
3 291 (NH), 1 685 (C=O) |
330.19 (M+ + 1) |
| III-20-2 |
4.67 (s, 2H, CH2), 6.99～7.93 (m, 8H, C6H5 + C6H2 + NH) |
3 296 (NH), 1 683 (C=O) |
330.19 (M+ + 1) |
| III-33-1 |
0.86 (t, 6H, J = 7.8 Hz, 2CH3), 1.21～1.27 (m, 4H, 2CH2), 1.42～1.47 (m, 4H, 2CH2), 2.99 (t, 4H, J = 7.8 Hz, 2CH2), 4.61 (s, 2H, CH2), 7.41～8.05 (m, 5H, C6H5) |
2 958, 2 931, 2 870 (C4H9), 1 682 (C=O) |
312.32 (M+ + 1) |
| III-33-2 |
0.83 (t, 6H, J = 7.8 Hz, 2CH3), 1.47～1.53 (m, 4H, 2CH2), 2.96 (t, 4H, J = 7.8 Hz, 2CH2), 4.62 (s, 2H, CH2), 7.41～8.05 (m, 5H, C6H5) |
2 965, 2 934, 2 872 (C3H7), 1 650 (C=O) |
284.29 (M+ + 1) |
|
表 5 活性化合物的 1H NMR 和 IR 数据
Table 5 1H NMR, IR and MS data of active compounds
|
表 6
(Table 6)
表 6 活性化合物对黄瓜灰霉病菌的杀菌活性
Table 6 Fungicidal activity of active compounds against B．cinerea
| 化合物 Compd |
菌丝生长速率法Mycelial growth rate method |
抑制率 Inhibition rate/% (叶片法, Leaf method) (500 μg/mL) |
| EC50 (95%CL) μg/mL |
EC80 (95%CL) μg/mL |
| III-12-3 |
27.03 (20.43～35.75) |
> 100 |
30.9 c |
| III-13-2 |
5.65 (4.24～7.53) |
23.94 (17.97～31.89) |
-43.7 g |
| III-13-3 |
16.24 (9.89～26.67) |
> 100 |
35.0 c |
| III-14-2 |
17.25 (12.65～23.52) |
57.34 (42.05～78.18) |
23.7 cd |
| III-16-1 |
9.19 (6.01～14.06) |
68.59 (44.86～104.88) |
70.0 b |
| III-18-3 |
3.43 (2.53～4.61) |
17.63 (13.07～23.80) |
21.0 c |
| III-20-1 |
64.00 (27.06～151.34) |
> 100 |
36.0 c |
| III-20-2 |
5.71 (4.03～8.08) |
23.29 (24.94～49.95) |
74.0 b |
| III-33-1 |
46.07 (34.17～62.11) |
> 100 |
9.5 de |
| III-33-2 |
> 100 |
> 100 |
-24.4 f |
| 腐霉利 procymidone |
2.68 (2.00～3.59) |
9.04 (6.76～12.11) |
74.0 b |
| 啶酰菌胺 boscalid |
0.65 (0.43～1.00) |
3.96 (2.59～6.06) |
100.0 a |
|
注:同列数据后不同小写字母表示不同处理组间差异显著(P ＜0. 05)。 |
|
Note: Different lowercase letters followed by the data in the same column indicate significant difference between treatments (P ＜0. 05)．
|
|
表 6 活性化合物对黄瓜灰霉病菌的杀菌活性
Table 6 Fungicidal activity of active compounds against B．cinerea
|
3 结论
对于新农药的开发，采用组合化学进行研究的优点在于其可平衡化学合成与活性测定之间的工作重心，可将更多的精力用于高活性化合物的快速获得和活性系统评价上。本研究过程分为 3 步：混合物合成；平行合成；传统合成。混合物合成大大降低了化合物合成和生物活性筛选的工作量，快速获得了少数几个活性组合库，明显提高了效率；通过平行合成与筛选，进一步缩小了活性化合物的范围，在提高效率的同时，能够获得比较准确的活性结果；传统合成与筛选以纯物质来评价化合物的活性，结果更加准确，最终可以确定高活性化合物。经过以上的合成与筛选过程，比较全面地获得了 N 上取代基为苯基、苄基和烷基时 2-氧代-2-苯基乙磺酰胺类化合物的构效关系，为进一步结构衍生与优化奠定了基础。
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