双酰胺类杀虫剂主要通过激活昆虫鱼尼丁受体的钙离子通道，引起细胞内钙离子大量释放进而导致昆虫肌肉收缩、麻痹而中毒死亡^[1]，是近年研制成功的一类广谱杀虫剂，目前已上市的品种有氟虫双酰胺(flubendiamide)、氯虫苯甲酰胺(chlo-rantraniliprole)和溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)。该类杀虫剂对多种鳞翅目害虫表现出优异的防治效果，对蚜虫类、叶蝉类、飞虱类以及部分鞘翅目和双翅目害虫也具有较好的防效^[2]，对哺乳动物毒性很低^[3]，在投入市场后迅速得到了推广。随着双酰胺类杀虫剂用量和推广面积的逐年增加，由其带来的环境污染和生态安全问题已逐渐引起关注

有关双酰胺类杀虫剂对不同环境非靶标生物毒性的研究结果存在较大差异，并且已有报道中的受试生物多为天敌节肢动物类群^{[4, 5, 6, 7, 8, 9]}，对土壤和水体环境中非靶标生物毒性效应的研究较少。有研究表明，氯虫苯甲酰胺对一些天敌昆虫^{[4, 5, 6]}和传粉昆虫^[10]毒性低，但对另一些有益昆虫却表现出较高的毒性^{[11, 12]}。此外，不同的评价方法也可能导致同一药剂对非靶标生物毒性的差异。例如，Preetha等认为氯虫苯甲酰胺对黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis毒性低，是非常安全的药剂^[7]，但有学者却持相反的结论^[13]；Tohnishi等认为氟虫双酰胺对天敌节肢动物的毒性很低^[8]，但Agbohessi等发现其对鱼卵的毒性较高^[14]；Misra等认为溴氰虫酰胺对七星瓢虫Coccinella septumpunctata毒性很低^[9]，但Liu等却发现其对姬小蜂Tamarixia triozae的毒性较高^[15]。

蚯蚓、鱼类和蜜蜂等是我国农田生态系统中常见的环境非靶标生物，化学农药的广泛使用可能造成此类生物死亡^[16]，影响其自然群落的结构和功能^[17]。因此，开展双酰胺类杀虫剂对土壤生物、水生生物和资源昆虫毒性的研究及安全性评价具有重要意义。本研究采用国际国内的化学品安全性测试标准方法^{[18, 19, 20, 21, 22, 23]}，测定了20%氟虫双酰胺水分散粒剂、200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂及200 g/L溴氰虫酰胺悬浮剂3种双酰胺类杀虫制剂对土壤生物(赤子爱胜蚓)、水生生物(非洲爪蟾、斜生栅藻、大型溞、斑马鱼)和资源昆虫(意大利蜜蜂、家蚕)的半数致死浓度(剂量)，并评价了其急性毒性，以期为该类杀虫剂的环境安全性评价及合理使用提供依据。

20%氟虫双酰胺 (flubendiamide)水分散粒剂(WG，日本农药株式会社，商品名垄歌)；200 g/L氯虫苯甲酰胺 (chlorantraniliprole)悬浮剂(SC，美国杜邦公司，商品名康宽)及200 g/L溴氰虫酰胺 (cyantraniliprole)悬浮剂(SC，美国杜邦公司)。

试材饲养和试验均在福建省农业科学院植物保护研究所农药环境安全评价中心参照相关试验标准^{[18, 19, 20, 21, 22, 23]}进行，并做了部分调整。每种药剂设5个处理浓度及1个空白对照，每处理3个重复(其中大型溞试验设4个重复)，每重复10只(头)相应生物个体(其中家蚕为30头)。非洲爪蟾蝌蚪、大型溞和斑马鱼饲养和试验用水均为曝气处理24 h以上的自来水，其余为蒸馏水。假如供试农药质量浓度达到100 mg/L (蚯蚓试验为100 mg/kg干土，家蚕和蜜蜂经口试验为2 000 mg/L，蜜蜂接触试验为100 μg/bee)时，仍未见供试生物出现死亡，则试验停止，据之判断农药对该供试生物为低毒^[18]。

选用赤子爱胜蚓Eisenia fetida，购自厦门市兴贤昆虫养殖基地，经室内饲养一个月以上，选择体重0.3～0.6 g的成蚓供试。饲养土壤温度(23±3) ℃，相对湿度70%～90%，自然光照。试验采用药土法^{[18, 19]}，置于(20±1) ℃、相对湿度80%～85%、光照强度800 lx连续光照的人工气候箱中。分别于7和14 d时倒出瓶内土壤，检查并记录蚯蚓的中毒症状和死亡数。

选择非洲爪蟾Xenopus laevis，购自上海茂生生物科技发展有限公司，在本实验室内自行配对繁殖蝌蚪，培养至体长1.6 cm时供试，饲养水温(22±2) ℃，弱光照。采用静态法^[18]，试验水温(22±2) ℃，光周期L∶D=16 h∶8 h；分别于24和48 h时观察、记录蝌蚪的中毒症状和死亡数。

斜生栅藻Scenedesmus obliquus，购自中国科学院水生生物研究所，于培养箱内(22±1) ℃、光周期L∶D=16 h∶8 h下培养增殖。参照标准试验方法^[18]，分别于0、24、48和72 h时采用血球计数板计数每处理的细胞数。

选用大型溞Daphnia magna，由中国农业科学院植物保护研究所提供，经室内饲养一年以上，繁殖超过30代，饲养水温(20±2) ℃，自然光照。采用静态法^{[18， 20]}，置于温度为(20±1) ℃、光周期L∶D=16 h∶8 h的人工气候箱中，分别于24和48 h时观察、记录试验溞中毒症状及活动受抑制溞数。

斑马鱼Brachydanio rerio，购自福州市花鸟市场，室内驯养一个月以上，饲养及试验水温均为(23±2) ℃，光周期L∶D=16 h∶8 h。试验采用静态法^{[18,19,20,21]}，分别于24、48、72和96 h时观察、记录斑马鱼的中毒症状及死亡数。

意大利蜜蜂Apis mellifera，购自福建农林大学蜂学学院，于试验地室外饲养半年以上。经口毒性试验参照饲喂法^{[18,19,20,21,22]}，并做部分修改，将不同浓度药液 (对照为蒸馏水) 与50%的蔗糖水以体积比1∶1混匀，装入内置0.5 g脱脂棉的10 mL烧杯中，杯口向下置于试验网笼上，将供试蜜蜂引入网笼中摄食。接触毒性试验采用点滴法^{[1819,20,21,22,23]}。试验温度 (25±2) ℃，相对湿度50%～70%，黑暗条件。分别于24和48 h时观察、记录蜜蜂的中毒症状及死亡数。

家蚕Bombyx mori品种为“两广二号”，购自广西蚕业技术推广总站，在人工气候箱内孵化饲养至2龄起蚕供试，饲养及试验温度均为(25±1) ℃，相对湿度70%～80%，光周期L∶D=16 h∶8 h。采用浸叶法^[18]，分别于24、48、72和96 h时观察、记录家蚕的中毒症状及死亡数。

为检验本试验系统(包括设备、条件、方法和试材)的有效性及可靠性，预先开展赤子爱胜蚓、大型溞、斑马鱼和意大利蜜蜂4种生物试材的参比物质试验。赤子爱胜蚓的试验时间仍为14 d，而大型溞、斑马鱼和意大利蜜蜂则为24 h，其他各种试材的饲养、试验及条件控制与上述试验方法基本相同(由于相关标准中未规定非洲爪蟾、斜生栅藻和家蚕3种生物试材参比物质试验的标准浓度范围^[18]，所以本研究未开展相应生物试材的参比物质试验)。

采用SPSS 19.0统计软件计算不同杀虫剂制剂对各生物试材的半数致死浓度(LC₅₀)、半数致死剂量(LD₅₀)或半数抑制浓度(EC₅₀)，以及其95%置信区间。以LC₅₀ (LD₅₀或EC₅₀)值的95%置信区间是否重叠作为判断不同杀虫剂毒性是否存在显著差异的标准^[24]。依据《化学农药环境安全评价试验准则》^[18]中的标准，判断不同杀虫剂对几种生物试材的毒性等级。

2.1 不同试材的参比物质试验结果参比物质试验中，氯乙酰胺对赤子爱胜蚓的14 d-LC₅₀值为16.93 mg/kg干土；重铬酸钾对大型溞的24 h-EC₅₀值为0.87 mg/L，对斑马鱼的24 h-LC₅₀值为212.18 mg/L；乐果对意大利蜜蜂的24 h-LD₅₀值为0.19 μg/bee。试验结果均在《化学农药环境安全评价试验准则》^[18]规定的浓度范围内，表明在本系统内开展的急性毒性试验条件符合规范，所用生物试材质量达标，所采用的仪器设备及方法可靠。

结果见表 1。其中，氟虫双酰胺对赤子爱胜蚓、非洲爪蟾蝌蚪、斜生栅藻、斑马鱼和意大利蜜蜂的急性毒性均显示为“低毒”，但其对大型溞、家蚕的急性毒性均为“剧毒”。暴露早期大型溞出现原地打转等中毒症状；家蚕出现停止取食、抽搐、蚕体萎缩、吐出黄色体液等中毒症状。

表 1 (Table 1)

表 1 供试3种双酰胺类杀虫剂制剂对不同环境非靶标生物的急性毒性 Table 1 Acute toxicity of three diamide insecticide preparations to different environmental nontarget organisms 试验生物 Test organisms 参数Median lethal parameter 20%氟虫双酰胺水分散粒剂 flubendiamide 20% WG 200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂 chlorantraniliprole 200 g/L SC 200 g/L溴氰虫酰胺悬浮剂 cyantraniliprole 200 g/L SC 测定值(95%置信限) Test value(95% CL) 毒性等级Toxicity grade 测定值(95%置信限)Test value(95% CL) 毒性等级Toxicity grade 测定值(95%置信限)Test value(95% CL) 毒性等级Toxicity grade 赤子爱胜蚓 E.fetida LC50(14 d)/(mg/kg soil) > 100 低毒 Low toxicity > 100 低毒Low toxicity > 100 低毒Low toxicity 非洲爪蟾蝌蚪Tadpole of X.laevis LC50(48 h)/(mg/L) > 100 低毒 Low toxicity 31.38(30.19～32.84) 低毒Low toxicity 24.03(21.93～26.69) 低毒 Low toxicity 斜生栅藻 S.obliquus EC50(72 h)/(mg/L) > 100 低毒Low toxicity > 100 低毒Low toxicity > 100 低毒Low toxicity 大型溞 D.magna EC50(48 h)/(mg/L) 1.51×10-2(1.18×10-2～1.96×10-2) 剧毒Extreme toxicity 2.58×10-3(1.90×10-3 ～3.53×10-3) 剧毒Extreme toxicity 7.63×10-2(5.91×10-2～0.10) 剧毒Extreme toxicity 斑马鱼B.rerio LC50(96 h)/(mg/L) > 100 低毒Low toxicity 40.18(36.60～44.47) 低毒Low toxicity 63.75(58.05～69.58) 低毒Low toxicity 意大利蜜蜂A.mellifera(经口 Oral) LC50(48 h)/(mg/L) > 2 000 低毒Low toxicity > 2 000 低毒Low toxicity 2.90 (2.40～3.49) 高毒 High toxicity 意大利蜜蜂A.mellifera(接触 Contact) LD50(48 h)/(μg/bee) >100 低毒Low toxicity > 100 低毒Low toxicity 3.71×10-2(2.97×10-2～ 4.64×10-2) 高毒High toxicity 家蚕B.mori LC50(96 h)/(mg/L) 6.11×10-2(4.36×10-2～8.33×10-2) 剧毒Extreme toxicity 0.12(6.91×10-2～0.20) 剧毒Extreme toxicity 0.30(0.26～0.33) 剧毒Extreme toxicity

表 1 供试3种双酰胺类杀虫剂制剂对不同环境非靶标生物的急性毒性 Table 1 Acute toxicity of three diamide insecticide preparations to different environmental nontarget organisms

氯虫苯甲酰胺对赤子爱胜蚓、斜生栅藻、意大利蜜蜂、非洲爪蟾蝌蚪和斑马鱼的急性毒性均为“低毒”，但在高浓度时非洲爪蟾蝌蚪和斑马鱼出现了侧卧缸底和游动缓慢等中毒症状；其对大型溞和家蚕的急性毒性均为“剧毒”，暴露早期大型溞出现原地打转等中毒症状，家蚕出现停止取食、抽搐、蚕体萎缩、吐出黄色体液等中毒症状。

溴氰虫酰胺对赤子爱胜蚓、斜生栅藻、非洲爪蟾蝌蚪和斑马鱼的急性毒性均显示为“低毒”，但在高浓度时非洲爪蟾蝌蚪和斑马鱼均出现了游动缓慢等中毒症状；其对意大利蜜蜂的急性毒性为“高毒”，并在处理早期时导致蜜蜂出现乱飞、抽搐、伸吻，后期出现爬行缓慢、伸吻不收回和体色加深等中毒症状；其对大型溞和家蚕的急性毒性均为“剧毒”，暴露早期大型溞出现原地打转、无蜕皮等中毒症状，家蚕出现停止取食、抽搐、蚕体萎缩、吐出黄色体液等中毒症状。

双酰胺类杀虫剂不仅可通过叶面喷雾，还可施用于土壤或灌溉水中，通过作物根部吸收而达到防治害虫的目的^[1]。因此，探讨该类杀虫剂对资源昆虫、土壤生物和水生生物的毒性意义重大。研究结果表明，供试3种双酰胺类杀虫剂制剂对土壤生物(蚯蚓)的急性毒性均很低。这可能与该类杀虫剂水溶性低、易被土壤吸附等理化特性有关。然而，由于该类杀虫剂在土壤中的残留期较长，移动性也较强^[25]，因此长期大量使用可能导致土壤中杀虫剂的浓度升高，因富集作用而对蚯蚓等土壤生物产生慢性毒性危害。

供试3种杀虫药剂对斜生栅藻的急性毒性很低，这可能是由于藻类缺少鱼尼丁受体或相似受体^[26]，无法与双酰胺类杀虫剂结合。同时也发现，3种杀虫剂对斑马鱼和非洲爪蟾蝌蚪为“低毒”，但对大型溞的急性毒性为“剧毒”。有研究认为，无脊椎动物的鱼尼丁受体仅有一个基因型^{[27, 28]}，大型溞与昆虫的鱼尼丁受体可能具有相似的氨基酸序列，能与该类杀虫剂形成具有相似亲和性的结合位点，进而激活鱼尼丁受体，控制钙离子从体细胞内不断释放，引起大型溞中毒和死亡。然而该类杀虫剂对无脊椎动物和脊椎动物毒性差异的原因尚未见报道，是否是由于鱼类和两栖类动物肌肉的鱼尼丁受体类型或亚型与无脊椎动物不同^{[29, 30]}，或者是由于脊椎动物鱼尼丁受体的氨基酸序列与无脊椎动物的相似程度低^[31]，从而导致杀虫剂与受体的亲和性出现差异，还有待于继续研究。

研究表明，3种杀虫剂对家蚕和蜜蜂的急性毒性存在差异，但对家蚕的急性毒性均为“剧毒”。由于该类杀虫剂的主要靶标生物就是鳞翅目昆虫的幼虫^{[32, 33]}，因此其对家蚕具有很高的毒性之前已有研究证实^[9]。其中，溴氰虫酰胺对意大利蜜蜂的48 h经口LC₅₀值和接触LD₅₀值均最小，其毒性在氟虫双酰胺和氯虫苯甲酰胺的100倍以上(表 1)。导致3种杀虫剂对蜜蜂毒性差异的原因，可能是由于氟虫双酰胺和溴氰虫酰胺鱼尼丁受体上的结合位点不同^[28,34,35]。当然，仅通过室内急性毒性试验并不能全面了解该类杀虫剂对家蚕和蜜蜂的毒性风险，因此进一步的风险评估和机理分析是今后研究的重点。

综上所述，虽然双酰胺类杀虫剂对人类和其他脊椎动物的毒性较低，但其对不同天敌节肢动物、土壤生物、水生生物和资源昆虫的毒性存在明显差异，尤其对家蚕的毒性较高。因此，建议其在桑蚕产区和桑粮混栽区要谨慎使用，同时在水体附近应尽量避免使用3种供试药剂，尤其是氯虫苯甲酰胺，以免药液通过灌溉或雨水冲刷，影响“藻类-大型溞-鱼类”这一食物链的能量传递而破坏水生生态系统平衡。此外，残留在土壤、水体环境以及植物组织中的双酰胺类杀虫剂对环境非靶标生物发育、繁殖和取食以及行为等方面的影响还有待深入研究。