稻瘟病是由灰色大角间座壳菌(Magnaporthe grisea，无性态为Pyricularia oryzae)所引起的重要病害，在我国水稻栽培区均有发生，为水稻三大病害之首，目前的防治措施主要是抗病品种选育、药剂防治和栽培管理，其中，化学防治因经济、高效等优点而占据着不可替代的地位^[1]。但由于化学药剂的常年单一使用，已出现稻瘟病菌抗药性增强和药剂防效降低的现象，稻瘟灵、稻瘟净、异稻瘟净等药剂都已有田间抗性菌株产生^{[2, 3]}。此外，菌株经过连续驯化后对三环唑的敏感性也会降低^[4]。因此，关于稻瘟病防治新药剂的研究开发已迫在眉睫。

戊唑醇(tebuconazole)是一种高效、广谱、内吸性的DMIs类杀菌剂，对作物的多数真菌病害均有良好的防治效果。但由于DMIs类杀菌剂的作用位点单一，田间已有多种重要的植物病原真菌对该类杀菌剂产生了不同程度的抗药性^{[5, 6, 7, 8]}。西南地区是我国稻瘟病的常发区，但不同地域不同年份发病程度不一，常用的防治药剂主要有三环唑、稻瘟灵等，戊唑醇在该地区尚未大面积使用。笔者针对西南地区稻瘟病菌对戊唑醇敏感性基线的建立及抗药性监测进行了研究，以期为戊唑醇在该地区的应用前景评价及合理使用提供参考。

于2013—2014年在重庆市及四川、贵州省的16个区县采集水稻稻瘟病穗颈瘟标样，通过单孢分离纯化，共获得902个稻瘟病菌Magnaporthe grisea菌株。

97%戊唑醇(tebuconazole)原药(湖北康宝泰精细化工有限公司)，用丙酮配制为1×10⁴ μg/mL的母液，4 ℃冰箱保存，备用。

马铃薯琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL。

将戊唑醇母液用丙酮稀释成系列浓度，取100 μL分别加入至200 mL、约 55 ℃的灭菌培养基中，分装制得含药平板。

1.2.1 病原菌的分离、纯化与保存

将所采集的穗颈瘟样品用灭菌水浸泡后保湿培养2 d，在PDA平板上抖孢子培养2 d，单孢纯化。纯化后的菌株于4 ℃下保存在PDA斜面上。

从保存的菌株中随机选取30个野生菌株，于菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块，分别接种至含2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μg/mL戊唑醇的PDA平板上，以用等量丙酮配制的无药培养基作为对照，每处理重复3次。10 d后观察，以菌株未生长的最低戊唑醇浓度作为戊唑醇对稻瘟病菌野生菌株的最低抑制浓度(MIC)值。

从保存的菌株中随机选取150个野生菌株，采用菌丝生长速率法^[9]测定稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性。

将供试菌株于PDA培养基上、28 ℃黑暗培养10 d，于菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块，分别接种到含0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 及 2.0 μg/mL戊唑醇的PDA平板上，以加入等体积丙酮的平板作为对照，每处理重复 3 次。28 ℃黑暗培养，10 d后用十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算菌丝生长抑制率。 通过Excel对各处理组药剂浓度的对数(x)和菌丝生长抑制率的几率值(Y)进行线性回归分析，求出线性回归方程，计算戊唑醇对各供试菌株的抑制中浓度(EC₅₀值)。根据150株野生稻瘟病菌株对戊唑醇的敏感性频率分布，建立敏感性基线^[10]。

将全部菌株活化培养3 d后，于菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块，接种至戊唑醇质量浓度为4 μg/mL的含药平板上，以加入等体积丙酮的平板为对照。28 ℃培养10 d，观察菌株生长情况，将能在含药平板上生长的菌株重新活化，通过菌丝生长速率法测定其EC₅₀值，计算其与敏感基线的比值，得到抗性倍数(resistance factor)。 根据抗性倍数将供试菌株划分为敏感、低抗、中抗和高抗菌株。其中，抗性倍数≤3为敏感菌株；3<抗性倍数≤10为低抗菌株；10<抗性倍数≤100为中抗菌株；抗性倍数>100为高抗菌株^[11]。计算各抗性菌株的频率。

测定结果显示，供试150株稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性呈连续性分布(图 1A )，其EC₅₀值变化范围在0.047 5～0.599 6 μg/mL之间，其中最不敏感菌株的EC₅₀值是最敏感菌株的12.62倍。将其EC₅₀值划分为几个区间，统计每个区间的菌株数及发生频率，绘制菌株敏感性频率分布图(图 1B )。由图 1可见，供试稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性频率分布呈连续性单峰曲线，未出现敏感性明显下降的抗药性亚群体，因此可将此150株敏感菌株的平均EC₅₀值作为田间菌株抗性监测的参考标准。其EC₅₀平均值为(0.215 4±0.149 7) μg/mL，MIC值≤4 μg/mL，该平均EC₅₀值0.215 4 μg/mL可作为西南地区稻瘟病菌对戊唑醇敏感性基线的参考值，用于田间抗药性监测。

图 1

Fig. 1

图 1 稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性(A)及频率分布(B) Fig. 1 Sensitivity (A) and distribution (B) of EC50

表 1 (Table 1)

表 1 部分地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性比较 Table 1 Sensitivity (EC50 value) of M.grisea from different areas to tebuconazole 采集地 Location 菌株数 Isolates EC50值范围 Range of EC50 values/(μg/mL) EC50平均值 Average of EC50 values/(μg/mL) 四川宣汉 Sichuan Xuanhan 10 0.236 0～0.599 5 0.443 6±0.128 9 a 贵州六枝特区 Guizhou Liuzhi Tequ 8 0.324 4～0.581 8 0.457 0±0.085 5 a 重庆涪陵 Chongqing Fulin 13 0.134 4～0.555 7 0.369 7±0.141 9 b 四川雅安 Sichuan Yaan 12 0.078 2～0.348 8 0.187 4±0.084 9 c 重庆永川 Chongqing Yongchuan 20 0.055 8～0.434 7 0.154 6±0.086 9 cd 重庆璧山 Chongqing Bishan 17 0.064 3～0.374 3 0.146 5±0.072 6 cd 四川阆中 Sichuan Langzhong 13 0.072 6～0.318 7 0.143 2±0.073 3 cd 重庆酉阳 Chongqing Youyang 8 0.071 0～0.247 3 0.140 9±0.061 9 cd 四川岳池 Sichuan Yuechi 18 0.047 5～0.274 9 0.114 5±0.061 4 cd 四川绵阳 Sichuan Mianyang 12 0.047 8～0.204 3 0.087 2±0.046 1 d 注: 表中同列数据后不同字母表示采用Duncan氏新复极差法检验数值间差异显著 (P＞0.05)。 Note：Data in the same column followed by different letters are significantly different by Duncans new multiple range test (P＞0.05).

表 1 部分地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性比较 Table 1 Sensitivity (EC50 value) of M.grisea from different areas to tebuconazole

通过SPSS软件分析了西南地区10个区县的田间稻瘟病菌菌株对戊唑醇的敏感性，结果(表 1)表明，不同地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性存在显著性差异。其中，四川绵阳菌株最敏感，其平均EC₅₀值为(0.087 2±0.046 1) μg/mL；贵州六枝特区和四川宣汉的菌株最不敏感，平均EC₅₀值分别为(0.457 0±0.085 5)和(0.443 6±0.128 9) μg/mL；四川绵阳菌株与四川宣汉菌株的敏感性相差5.09倍。

以MIC值作为田间稻瘟病菌对戊唑醇抗性的区分剂量，对分离于重庆市(永川、酉阳、璧山、武隆、涪陵、忠县、石柱)、四川省(都江堰、宣汉、阆中、绵阳、岳池、雅安、武胜)和贵州省(盘县、六枝特区)16个区县的902株稻瘟病菌菌株进行抗性监测。结果表明，所采集的病原菌仅四川宣汉和重庆涪陵各有1株能在含4 μg/mL戊唑醇的PDA平板上生长，视为疑似抗性菌株。

测定该疑似抗性菌株对戊唑醇的敏感性，得其EC₅₀值分别为0.651 2和0.655 7 μg/mL，抗性倍数分别为3.02和3.04。由此可见，西南地区稻瘟病菌对戊唑醇多数仍为敏感菌株，仅极少数出现了低水平抗性。

DMIs类农药属于较易产生抗性的中等风险杀菌剂，而稻瘟病菌属于易产生抗性的高风险病原菌^[12]。建立病原菌对杀菌剂的敏感性基线是研究田间菌株敏感性变化的重要步骤，也是进行抗药性风险分析的基础^[13]。本研究采用菌丝生长速率法，测定了采自西南地区未使用戊唑醇区域的150株野生稻瘟病菌菌株对戊唑醇的EC₅₀值，其平均EC₅₀值为0.215 4 μg/mL，该值与Yan等^[14]测定的稻瘟病菌野生敏感菌株对戊唑醇的EC₅₀值相近，因此可将其作为田间稻瘟病菌对戊唑醇抗性监测的参考标准。在敏感性基线建立过程中，最敏感菌株与最不敏感菌株EC₅₀值差异达12.62倍，分别出现在四川岳池与重庆涪陵，且各区县之间的平均EC₅₀值存在显著性差异，说明不同地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性并不一致，推测这可能与各地病原菌本身的差异性有关。

同时，本研究采用4 μg/mL作为区分剂量，对西南地区采集的稻瘟病菌进行了田间抗性监测，其中采自四川省和重庆市的菌株对戊唑醇的抗性频率分别为0.33%和0.21%，表明供试菌株对戊唑醇多数仍表现为敏感，仅极少数为低水平抗性，即戊唑醇在西南地区稻瘟病防治中具有较好的应用价值。因此，戊唑醇可作为西南地区稻瘟病防治的候选药剂，但需做好田间抗药性监测，并注意与作用机制不同的药剂混合或交替使用，以延缓抗性的产生，延长药剂使用寿命。