芒果Mangifera indica Linn已成为世界五大水果之一^[1]，主要分布在印度、泰国、中国、墨西哥、印尼、菲律宾、越南和巴西等热带国家和地区。我国芒果种植主要集中在海南、广东、台湾和四川等热带地区，产量居世界第二。热带地区高温高湿的气候特点使得病虫害在农作物上的发生较为普遍，由于芒果缺乏优良的抗病品种，炭疽病、黑斑病和白粉病发病较为常见。吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇(结构式见Scheme 1)均为内吸传导型杀菌剂，用于防治芒果炭疽病、叶斑病、黑星病、白粉病和霜霉病等^{[2, 3, 4, 5]}，使用不合理会造成在芒果果实中的累积，导致其残留量超标，引发农产品质量安全问题^[6]。欧盟制定了芒果中吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇的最大残留限量标准(MRLs)分别为0.05、0.5和0.01 mg/kg，我国制定了芒果中吡唑醚菌酯的MRLs为0.05 mg/kg^{[7, 8]}。

图 4

Fig. 4

Scheme 1

Anastassiades等^[9]于2003年提出的QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe)方法，具有回收率高、速度快、操作简单和可分析的农药范围广等优点，但净化能力较弱。为了提高净化能力，除N-丙基-乙二胺(PSA)外，研究人员在寻找更多吸附剂，如C₁₈粉、石墨化碳黑粉末(GCB)和氨丙基粉等^{[10, 11, 12]}。PSA能去除强极性的有机酸和酚类及部分糖和脂类干扰物，C₁₈可以去除非极性的糖类、脂类等，GCB能去除色素。目前，国内外已有利用气相色谱法检测腈苯唑和液相色谱法检测吡唑醚菌酯在芒果中残留的报道^{[13, 14, 15, 16, 17]}，但尚未见同时检测芒果中吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇3种杀菌剂残留的报道。本研究拟利用QuEChERS方法净化芒果提取液，采用UPLC-MS/MS同时检测芒果中吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇3种杀菌剂的残留。

Waters超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(ACQUITY UPLC/Quattro Premier^TM XE)配有电喷雾离子源(ESI)和Masslynx^TM 4.0 工作站、ACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈(2.1 mm× 100 mm，1.7 μm)色谱柱，美国Waters公司；电子分析天平，瑞典梅特勒托利多公司；离心机，上海安亭科学仪器厂。

99.0%吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、98.7%腈苯唑(fenbuconazole)和99.0%烯唑醇(dinicona-zole)标准品，农业部环境保护科研监测所；甲醇和乙腈均为色谱纯，美国Fisher公司； PSA吸附剂，美国Agilent公司；C₁₈吸附剂和GCB粉末，上海安谱科学仪器有限公司；试验用水为Milli-Q净化系统经0.22 μm滤膜过滤的纯化水。

芒果样品购自海南省海口市南北水果批发市场，去核取可食部分，用组织捣碎机捣碎，于-18 ℃下密封保存，备用。

准确称取10.00 g芒果样品于50 mL具塞离心管中，加入10.0 mL乙腈、3.0 g 硫酸镁、1.0 g 氯化钠，于18 000 r/min下均质1 min，再于5 000 r/min下离心5 min。取1.00 mL上清液置于预先加有35 mg PSA、35 mg C₁₈及150 mg 硫酸镁的离心管中，涡旋60 s，再于5 000 r/min下离心5 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，待UPLC-MS/MS分析。

将吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇标准品用甲醇溶解，配制成质量浓度为100 μg/mL的混合标准储备液，于-18 ℃避光保存，有效期3个月。

取芒果样品按1.2节的方法进行前处理，制得空白芒果基质溶液。将1.3.1节的混合标准储备液用空白芒果基质溶液稀释成质量浓度为5.0、10、20、50、100、200和500 ng/mL的系列混合标准溶液，现配现用。

色谱条件：流动相A为甲醇，流动相B为1 mmol/L的乙酸铵水溶液；柱温35 ℃；样品室温度10 ℃；进样体积5 μL；流速0.25 mL/min。梯度洗脱程序见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program 时间 Time/ min 流速 Flow rate/ (mL/min) 流动相 Mobile phase/% A(甲醇 Methanol) B(1 mmol/L的乙酸铵水溶液 1mol/L ammonium acetate aqueous solution) 0 0.25 10.0 90.0 1.50 0.25 70.0 30.0 5.50 0.25 70.0 30.0 6.00 0.25 90.0 10.0 6.50 0.25 90.0 10.0 6.60 0.25 70.0 30.0 7.00 0.25 10.0 90.0 8.50 0.25 10.0 90.0

表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program

质谱条件：正离子电离模式；毛细管电压3.00 kV；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流量900 L/h；锥孔气流量50 L/h；离子源温度110 ℃；碰撞气流速0.21 mL/min。多反应监测(MRM)分析的质谱参数见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 多反应监测模式下的质谱参数 Table 2 MS conditions under MRM mode 杀菌剂 Fungicides 保留时间 Retention time/min 母离子 Parention, m/z 锥孔电压 CV/V 子离子1/碰撞能量 Daughter ion 1, (m/z/CE)/eV 子离子2/碰撞能量 Daughter ion 2, (m/z/CE)/eV 吡唑醚菌酯 pyraclostrobin 5.78 388 20 194*/15 163/15 腈苯唑 fenbuconazole 4.58 337.1 36 125*/30 70/30 烯唑醇 diniconazole 6.84 326.1 35 70*/25 159/23 *为定量离子。 *Quantitative ion.

表 2 多反应监测模式下的质谱参数 Table 2 MS conditions under MRM mode

基质效应是指样品分析液中除分析物以外的共流出组分改变了分析物的响应值，从而影响定量分析的准确度和重现性，其机制可能是共流出组分影响了电喷雾接口的离子化效率^[18]。本研究通过测定各农药在基质匹配溶液中的响应值(A)及其在纯溶剂中的响应值(B)，得到基质效应(Matrix Effect,ME)/%=[(A-B)/B]×100。ME为正值表示基质增强效应，ME为负值表示基质抑制效应。

本研究考察了PSA、PSA+GCB、C₁₈、C₁₈+GCB、PSA+C₁₈和PSA+C₁₈+GCB等净化芒果提取液。结果(图 1)表明：添加GCB，烯唑醇的回收率低于60%，达不到分析方法的要求；分别添加PSA+C₁₈、PSA和C₁₈，3种农药的回收率在70%～115%之间，其中以C₁₈粉末作为吸附剂时，烯唑醇回收率低于以等当量的PSA和PSA + C₁₈为吸附剂的回收率，其原因可能是C₁₈的净化能力弱于等当量的PSA，导致烯唑醇的基质效应更大；单独使用PSA或C₁₈时，净化液呈黄色，而使用PSA+C₁₈时净化液澄清透明，净化效果较好。故最终选择PSA+C₁₈作为吸附剂来净化芒果提取液。

图 1

Fig. 1

1: 70mg PSA;2: 35mg PSA + 25mg GCB;3: 70mg C18; 4: 35mg C18 + 25mg GCB;5: 35mg PSA + 35mg C18; 6: 35mg PSA + 35mg C18 + 25mg GCB. 图 1 不同净化条件下3种杀菌剂的回收率 Fig. 1 Recoveries of three fungicides under different cleaning conditions

在电喷雾离子源电离模式下，以流动注射方式分别对吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇的单一标准溶液进行母离子全扫描，再对各自的子离子进行全扫描，每个化合物选择两对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对，并进行MRM参数的优化，优化结果见表 2。在1.4节的色谱条件下，以甲醇和1 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相，吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇可获得较好的分离度及较高的响应值。图 2为标准溶液(质量浓度为100 ng/mL)的总提取离子色谱图。

图 2

Fig. 2

图 2 标准溶液的总提取离子色谱图 Fig. 2 Total ion chromatograms of the standard solution

取1.3.2节中配制的基质匹配标准溶液按1.4节的方法测定，绘制标准曲线。结果(表 3)表明：在5.00 ～ 500 ng/mL 范围内，以仪器响应峰面积对各目标药剂的质量浓度进行线性回归，发现吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇均呈良好线性关系。方法中吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇的检出限(LOD，S/N=3)分别为0.2、0.6和0.3 μg/kg，定量限(LOQ)分别为0.5、1.0和0.5 μg/kg。

表 3 (Table 3)

表 3 3种杀菌剂的线性方程、相关系数和线性范围 Table 3 The linear equations,correlation coefficient and linear range for three fungicides 杀菌剂 Fungicides 线性方程 Linear equations 相关系数 Correlation coefficient,r 线性范围 Linear range/ (ng/mL) 吡唑醚菌酯 pyraclostrobin y=2 671 530x+1 499.7 0.999 4 5.00～500 腈苯唑 fenbuconazole y=1 005 920x+974.4 0.998 6 5.00～500 烯唑醇 diniconazole y=1 491 340x + 1 908.5 0.999 8 5.00～500

表 3 3种杀菌剂的线性方程、相关系数和线性范围 Table 3 The linear equations,correlation coefficient and linear range for three fungicides

取空白芒果样品，在0.50(腈苯唑为1.0)、2.5、5.0、50 μg/kg 4个添加水平下，按1.2节的方法进行前处理，平行测定5次。结果(表 4)显示：平均添加回收率在70%～105%之间，相对标准偏差(RSD)在0.90% ～ 4.6% 之间，符合方法学要求^[19]。图 3为在0.5 μg/kg(腈苯唑为1.0 μg/kg)添加水平下的MRM谱图。

表 4 (Table 4)

表 4 样品添加回收率及相对标准偏差(n=5) Table 4 Recovery and relative standard deviation of the method(n=5) 杀菌剂 Fungicides 添加水平 Spiked level/ (μg/kg) 平均回收率 Average recovery/% 相对标 准偏差 RSD/% 吡唑醚菌酯 pyraclostrobin 0.5 95 1.9 2.5 92 3.3 5.0 100 1.6 50.0 103 2.8 腈苯唑 fenbuconazole 1.0 73 2.6 2.5 84 3.3 5.0 90 4.6 50.0 104 0.9 烯唑醇 diniconazole 0.5 82 3.9 2.5 70 4.3 5.0 94 2.6 50.0 105 2.2

表 4 样品添加回收率及相对标准偏差(n=5) Table 4 Recovery and relative standard deviation of the method(n=5)

图 3

Fig. 3

1：定性离子对；2：定量离子对。 A：烯唑醇；B：腈苯唑；C：吡唑醚菌酯。 1: qualitative ion pair; 2:quantitative ion pair. A: diniconazole; B: fenbuconazole; C: pyraclostrobin. 图 3 多反应监测模式下样品添加(吡唑醚菌酯和烯唑醇 为0.5 μg/kg，腈苯唑为1.0 μg/kg)的选择离子色谱图 Fig. 3 Selected ion chromatogram of the spiked sample (spiked level: pyraclostrobin and diniconazole 0.5 μg/kg; fenbuconazole 1.0 μg/kg) under multiple reaction monitoring (MRM) mode

结果(表 5)表明：在5.00 ～ 100 ng/mL范围内，吡唑醚菌酯的基质效应小于10%，对结果影响较小，可以忽略。腈苯唑和烯唑醇的基质效应在10.1%～30.2%之间，对结果影响较大，需要使用基质标准曲线进行校准。

表 5 (Table 5)

表 5 3种杀菌剂在芒果提取液中的基质效应 Table 5 Matrix effects of three fungicides in mango extraction 农药质量浓度 Pesticide concentration/ (μg/mL) 基质效应 ME/% 吡唑醚菌酯 pyraclostrobin 腈苯唑 fenbuconazole 烯唑醇 diniconazole 0.005 -2.9 -25.5 -30.2 0.010 7.0 -10.1 -17.6 0.020 -0.8 -11.0 -18.1 0.050 -9.2 -27.9 -29.9 0.100 -9.3 -28.2 -30.2

表 5 3种杀菌剂在芒果提取液中的基质效应 Table 5 Matrix effects of three fungicides in mango extraction

在我国芒果中，有注册登记并制定了最大残留限量标准的农药仅有8种，但实际在芒果树上使用的农药却很多。通过对热带水果质量安全普查发现，吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇经常用于防治芒果炭疽病、叶斑病、黑星病、白粉病和霜霉病等，但目前只有吡唑醚菌酯进行了注册登记^[6]。采用本研究建立的方法对采集于海口市南北水果批发市场的23份芒果样品进行检测，均未检出吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇残留。

本研究建立了一种基于QuEChERS原理的前处理方法，结合UPLC-MS/MS的高分辨能力快速检测芒果中吡唑醚菌酯、腈苯唑和烯唑醇3种杀菌剂的残留量。试验优化了超高效液相色谱与质谱的采集参数，确定了吸附剂的种类及用量，并考察了3种杀菌剂的基质效应。方法学考察及实际样品测定证明该方法前处理简单、快速，操作简便易行，且准确度、灵敏度高，重复性好，检出限低，可用于同时检测芒果中吡唑醚菌酯的残留量。