枣树Ziziphus jujuba Mill是我国北方重要的经济作物。由胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeospo-rioides侵染引起的炭疽病是危害枣树的主要病害之一，严重影响枣的产量和品质^{[1, 2]}。二氰蒽醌又称二噻农，化学名称为2,3-二腈基-1,4-二硫代蒽醌(结构式见Sheme 1)，是德国默克公司于20世纪60年代开发的保护性杀菌剂，可防治多种真菌性病害，对炭疽病防效显著^{[3, 4, 5]}。吡唑醚菌酯又称唑菌胺酯，化学名称为N-甲氧基-N-2-[(N-对氯苯基)-3-吡唑氧基甲基]苯基氨基甲酸酯(结构式见Scheme 1)，是德国巴斯夫公司于1993年开发的一种新型甲氧丙烯酸酯类广谱杀菌剂，对草莓、黄瓜、大豆和山药等作物炭疽病防效较好^{[6, 7, 8]}。两者复配后用于防治枣树炭疽病，不仅能起到增效作用，还能避免或延缓抗药性的产生^[9]。

图 2

Fig. 2

Scheme 1

目前，关于二氰蒽醌的报道主要集中在水解、光解及土壤中降解吸附等方面的研究^{[10, 11]}，其残留检测方法主要是液相色谱法和液相色谱-串联质谱法^{[13, 14]}。金铨^[12]除对二氰蒽醌在辣椒表面的光解进行了研究外，还用质谱定性推导出了其可能的两种光解途径。与二氰蒽醌相比，吡唑醚菌酯在作物上的残留行为和相关检测方法研究较多。石凯威等^[15]和闫晓阳等^[16]分别采用高效液相色谱法研究了吡唑醚菌酯在苹果和烟叶中的残留及消解动态；张少军等^[17]采用高效液相色谱-紫外法研究了河北、湖南两地大白菜中吡唑醚菌酯残留规律；Ahammed等^[18]运用液相色谱-质谱联用法对在葡萄干加工过程中吡唑醚菌酯的代谢模式及安全评估进行了研究；Reddy等^[19]研究了水分、有机质和微生物种群等因素对土壤中吡唑醚菌酯消解的影响。目前，我国尚未制定二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣中的最大残留限量(MRL)值，这两种农药也未取得在枣树上的登记使用。本研究建立了采用高效液相色谱-紫外器(HPLC-VWD)检测二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣中残留量的分析方法，研究其残留消解动态、最终残留水平和膳食摄入风险，以期为合理使用及MRL值标准制定提供借鉴。

试验在山东省烟台市蓬莱市大辛店镇(2013年、2014年)、河北省石家庄市鹿泉市上寨乡(2013年)和石家庄市元氏县苏村乡(2014年)3地进行。供试枣品种为大家枣(山东)和赞皇大枣(河北)。供试农药为16%唑醚·氰蒽醌水分散粒剂(16% pyraclostrobin·dithianon WG)，巴斯夫(中国)有限公司提供。

按农药残留试验准则(NY/T 788—2004)^[20]要求，于枣炭疽病发病初期，果实长到成熟个体一半大小时，均匀喷雾施药，施药剂量为4.0 g/kg(制剂量稀释250倍)，每小区两株枣树，重复3次，分别于施药后2 h及1、3、5、7、14、21、28、35和42 d采样。以喷施清水作为空白对照。

设推荐剂量2.67 g/kg (制剂量稀释375倍)和推荐剂量的1.5倍4.0 g/kg (制剂量稀释250倍) 两个施药剂量，于果实长到成熟个体一半大小时，均匀喷雾，分别施药3和4次，重复3次，每小区2株枣树，施药间隔期7 d。分别于最后一次施药后7、14和21 d采样。以喷施清水作为空白对照。

在试验小区内枣树不同方向及上下不同部位随机取样，采集1 kg以上生长正常、无病害的枣果，去核切碎，混匀缩分至150 g装入样品容器，于-20 ℃冰柜中保存，备用。

果核质量约占全果质量的3.8%(山东点)～4.0%(河北点)，在计算枣中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的残留量时，以全果(含核)质量计。

Agilent 1100 液相色谱仪(带紫外检测器)：美国Agilent公司；IKA T25高速匀浆机：德国IKA公司；TD5A-WS离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

99.9%吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)标准品和99.6%二氰蒽醌(dithianon)标准品：均由巴斯夫(中国)有限公司提供；甲醇、乙腈、丙酮和正己烷均为色谱纯：科密欧化学试剂有限公司；盐酸(A.R)：天津化学试剂一厂；氯化钠(A.R)：天津瑞金特化学品有限公司；弗罗里矽SPE小柱(500 mg，6 mL)：美国Agilent公司。

提取：准确称取20.0 g样品于150 mL三角瓶中，依次加入5 mL水、1mL盐酸溶液(6 mol/L)和40 mL乙腈，高速匀浆1 min，过滤；将滤液转入盛有氯化钠的具塞量筒中，剧烈振荡，静置分层；取2 mL上清液于鸡心瓶中减压旋蒸(不高于35 ℃)以除去乙腈溶剂，用正己烷溶解并定容至2 mL，待净化。

净化：将弗罗里矽SPE小柱分别用5 mL丙酮和5 mL正己烷活化后，加入待净化液，用10 mL V(丙酮)∶V(正己烷)=1∶9分两次洗脱；收集洗脱液减压旋蒸(不高于35 ℃)，用乙腈溶解并定容至1 mL，过0.45 μm滤膜，待测。

Inertsil ODS-SP 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温20 ℃，流速0.8 mL/min，进样量10 μL，流动相为V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶25∶30，检测波长263 nm。在此条件下二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的保留时间分别为10.1 和17.4 min 左右。

准确称取0.014 7 g二氰蒽醌或0.011 8 g吡唑醚菌酯于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，分别得到294和236 mg/L的二氰蒽醌和吡唑醚菌酯标准品母液。再用乙腈梯度稀释得到质量浓度为5.0、1.0、0.5、0.1和0.05 mg/L的系列标准工作溶液，按1.2.3节的色谱条件测定。以标准溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

取制备好的枣空白对照样品，分别添加0.1、2和5 mg/kg 3个水平的二氰蒽醌和吡唑醚菌酯标准品，每个水平重复5次。按1.2.2节的前处理方法和1.2.3节的色谱条件测定，计算添加回收率和相对标准偏差(RSD)。

不同人群平均体重及水果摄入量数据^{[21, 22]}见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 不同人群平均体重及水果摄入量 Table 1 Average body weight of the subpopulation and dietary intake of fruit 项目 Item 2～6岁 Age 2~6 7～14岁 Age 7~14 18～30岁 Age 18~30 60～70岁 Age 60~70 平均体重 Average body weight/kg 19.6 41.0 63.2 66.1 水果日均摄入量 Dietary intake of fruit/(kg/d) 0.061 0.082 0.062 0.063

表 1 不同人群平均体重及水果摄入量 Table 1 Average body weight of the subpopulation and dietary intake of fruit

慢性膳食摄入风险采用公式(1)进行评判。式中：STMR表示规范试验残留中值，mg/kg；F表示不同人群日均水果摄入量，kg/d；ADI表示每日允许摄入量，mg/kg；bw表示体重，kg。当%ADI≤100%时表示风险可以接受，当%ADI＞100%时，表示风险不可接受^[23]。

急性膳食摄入风险采用公式(2)进行评判。式中：U表示枣单果重，对试验中大家枣和赞皇大枣称重，取二者平均质量0.045 kg；HR为最高残留量，mg/kg；LP和v分别表示枣消费的大份餐(large portion)和枣个体之间的变异因子(variability factor)，根据联合国粮食及农业组织公布的数据，中国居民枣消费大份餐LP为0.286 2 kg^[24]，v为3；bw表示体重，kg；ARfD表示急性参考剂量，mg/kg。

结果表明：在0.05～5 mg/L范围内，二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的峰面积与进样浓度之间呈良好线性关系，线性方程二氰蒽醌为y=45.37x-0.242，相关系数(r=0.999 5；吡唑醚菌酯为y=29.79x-0.210，r=0.999 6。

根据文献报道^{[13, 15]}，二氰蒽醌的最大吸收波长为254 nm，吡唑醚菌酯的最大吸收波长为275 nm，兼顾两者本研究确定检测波长为260 nm。通过添加回收试验，测得方法的定量限(LOQ)均为0.1 mg/kg。相关谱图见图 1。

图 1

Fig. 1

A.枣空白样品;B.枣中添加二氰蒽醌和吡唑醚菌酯(2.0 mg/kg) A.Blank sample of the jujube; B.The jujube sample with dithianon and pyraclostrobin (2.0 mg/kg) 图 1 枣空白样品和添加回收谱图 Fig. 1 Blank sample of the jujube and chromatogram of recovery

由表 2可知：在0.1、2和5 mg/kg 3个添加水平下，二氰蒽醌回收率在76%～98%之间，相对标准偏差(RSD)在1.3%～6.8%之间；吡唑醚菌酯回收率在87%～112%之间，RSD在1.1%～9.6%之间，符合农药残留检测的要求^[20]。

表 2 (Table 2)

表 2 二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣中的添加回收率和 相对标准偏差(n=5) Table 2 Recoveries and RSDs for dithianon and pyraclostrobin in the jujube (n=5) 农药 Pesticide 添加水平 Spiked level /(mg/kg) 平均回收率 ±标准差 Recovery±SD/% RSD/ % 二氰蒽醌dithianon 0.1 86±4 4.1 2 82±6 6.8 5 97±1 1.3 吡唑醚菌酯pyraclostrobin 0.1 95±8 8.8 2 102±10 9.6 5 97±1 1.1

表 2 二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣中的添加回收率和 相对标准偏差(n=5) Table 2 Recoveries and RSDs for dithianon and pyraclostrobin in the jujube (n=5)

本研究发现：C₁₈或PSA粉末对枣基质的除杂效果不理想，而且使用PSA粉末净化，二氰蒽醌回收率不高；采用Florisil SPE柱净化，温度是影响二氰蒽醌回收率的主要因素之一，在脱除溶剂的过程中，水浴温度最好控制在35～40 ℃之间，并且选择V(正己烷)∶V(丙酮)=9∶1作为淋洗剂，10 mL洗脱，除杂效果好。在此条件下，二氰蒽醌和吡唑醚菌酯回收率稳定，灵敏度高。

消解动态试验结果表明： 二氰蒽醌在枣上的消解半衰期2.0～2.4 d，施药后5 d，消解率在80%以上；吡唑醚菌酯在枣上的消解半衰期12.4～18.4 d，施药后28 d，消解率在80%以上。二氰蒽醌和吡唑醚菌酯均属于易降解农药(t_1/2<30 d)，其中二氰蒽醌较吡唑醚菌酯的消解速率快，两者消解动态均符合一级动力学方程；两年两地消解行为差异不明显(表 3)。

表 3 (Table 3)

表 3 二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣中的消解动态方程、相关系数及半衰期 Table 3 The regression equation,correlation efficient and half lives of dithianon and pyraclostrobin in the jujube 地点 Location 药剂 Pesticide 年份 Year 消解动态方程 Regression equation 相关系数r 半衰期/d Half-life 山东 Shandong 二氰蒽醌 dithianon 2013 ct=1.11 e-0.349 1t -0.965 8 2.0 2014 ct=0.64 e-0.293 1t -0.790 3 2.4 吡唑醚菌酯 pyraclostrobin 2013 ct=1.01 e-0.055 68t -0.923 1 12.4 2014 ct=0.75e-0.041 20t -0.904 7 16.8 河北 Hebei 二氰蒽醌 dithianon 2013 ct=1.55e-0.464 3t -0.986 7 1.5 2014 ct=0.59e-0.274 0t -0.948 2 2.5 吡唑醚菌酯 pyraclostrobin 2013 ct=1.02e-0.045 36t -0.712 1 15.3 2014 ct=0.82e-0.037 68t -0.988 5 18.4

表 3 二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣中的消解动态方程、相关系数及半衰期 Table 3 The regression equation,correlation efficient and half lives of dithianon and pyraclostrobin in the jujube

两年两地的试验结果表明：16%唑醚·氰蒽醌水分散粒剂分别按2.67和4.0 g/kg剂量对枣树施药3~4次，采收距最后一次施药7、14、21 d时，枣中二氰蒽醌残留量分别为0.161～3.83、<0.10～0.926和<0.10～0.754 mg/kg，吡唑醚菌酯残留量分别为0.177～3.07、0.119～0.768和<0.10～0.596 mg/kg。详细数据见表 4。虽然田间试验结果受很多自然因素影响，如光照、风速、降雨以及人为施药和采样的不均匀性，但从二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣上的最终残留结果来看，枣中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯残留量总体随施药量和施药次数的增加而增加，随采样间隔期的延长而降低。

表 4 (Table 4)

表 4 二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣中最终残留量(n=3) Table 4 The final residue of dithianon and pyraclostrobin in the jujube(n=3) 农药 Pesticide 年度 Year 施用剂量 Application dose/(g/kg) 施药 次数 Spraying times 施药间隔期 Spraying intervals/d 采收间隔期 Harvest intervals/d 残留量 Residue/(mg/kg) 山东 Shandong 河北 Hebei 二氰蒽醌 dithianon 2013 2.0 3 7 7 0.314 0.161 14 0.136 <0.10 21 <0.10 <0.10 2.0 4 7 7 0.227 0.827 14 0.117 0.223 21 0.104 0.158 3.0 3 7 7 0.358 0.450 14 0.123 0.300 21 <0.10 0.254 二氰蒽醌 dithianon 3.0 4 7 7 0.380 1.55 14 0.240 0.926 21 0.144 0.754 2014 2.0 3 7 7 0.265 0.309 14 <0.10 <0.10 21 <0.10 <0.10 2.0 4 7 7 0.520 0.585 14 0.111 0.132 21 <0.10 <0.10 3.0 3 7 7 1.45 0.160 14 0.208 0.230 21 <0.10 <0.10 3.0 4 7 7 3.24 3.83 14 0.555 0.595 21 0.132 0.144 吡唑醚菌酯 pyraclostrobin 2013 0.67 3 7 7 0.716 0.177 14 0.585 0.119 21 0.383 0.212 0.67 4 7 7 0.899 0.317 14 0.471 0.133 21 0.410 <0.10 1.0 3 7 7 0.455 0.274 14 0.476 0.210 21 0.440 0.213 1.0 4 7 7 0.771 1.02 14 0.643 0.412 21 0.596 0.514 2014 0.67 3 7 7 0.344 0.300 14 0.190 0.172 21 0.114 0.107 0.67 4 7 7 0.524 0.456 14 0.254 0.221 21 0.173 0.156 1.0 3 7 7 1.04 0.886 14 0.484 0.413 21 0.190 0.172 1.0 4 7 7 3.07 2.59 14 0.768 0.630 21 0.487 0.419 注：采收间隔7、14、21 d，二氰蒽醌在枣中残留中值(STMR)和残留最大值(HR)分别为:0.417和3.83 mg/kg；0.174和0.926 mg/kg；<0.10和0.754 mg/kg。吡唑醚菌酯在枣中残留中值(STMR)和残留最大值(HR)分别为:0.616和3.07 mg/kg；0.409和0.772 mg/kg；0.219和0.596 mg/kg。 Note: At the 7th,14th,21th day after the last application,the supervised trials median residue(STMR) and the highest residue(HR) value of dithianon in the jujube were as follows: 0.417 and 3.83 mg/kg,0.174 and 0.926 mg/kg,<0.10 and 0.754 mg/kg. The value of pyraclostrobin were 0.616 and 3.07 mg/kg,0.409 and 0.772 mg/g,0.219 and 0.596 mg/kg.

表 4 二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣中最终残留量(n=3) Table 4 The final residue of dithianon and pyraclostrobin in the jujube(n=3)

二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的ADI值分别为0.01和0.03 mg/kg^[25]，ARfD值分别为0.1和0.05 mg/kg^[26]。风险评估结果表明(表 5和表 6)：距最后一次施药间隔期7、14和21 d时，枣中二氰蒽醌对4类人群的急(慢)性膳食摄入风险均低，其%ADI值和%ARfD值均未超过100；而吡唑醚菌酯在距最后一次施药间隔期7 d时，对2～6岁的幼儿可能存在不可接受的急性膳食摄入风险(%ARfD＞100)，14和21 d时，对4类人群的急(慢)性膳食摄入风险均较低。因此建议16%唑醚·氰蒽醌水分散粒剂在推荐用药量2.67 g/kg、施药间隔期7 d及施药3次的情况下，采收间隔期为14 d较为适宜。

表 5 (Table 5)

表 5 不同采样间隔期下二氰蒽醌和吡唑醚菌酯慢性膳食摄入风险 Table 5 Chronic dietary intake risk of dithianon and pyraclostrobin at different intervals 人群 Subpopulation 慢性膳食摄入风险ADI Chronic dietary intake risk ADI 二氰蒽醌 dithianon 吡唑醚菌酯 pyraclostrobin 7 d 14 d 21 d 7 d 14 d 21 d 2～6岁 age 2-6 13.0 5.4 — 6.4 4.2 2.3 7～14岁 age 7-14 8.3 3.5 — 4.1 2.7 1.5 18～30岁 age 18-30 4.1 1.7 — 2.0 1.3 0.7 60～70岁 age 60-70 4.0 1.7 — 2.0 1.3 0.7 “—”表示二氰蒽醌残留量低于检出限，风险很低。 “—”indicates the residues of dithianon was less than the limit of quantification,the risk was low.

表 5 不同采样间隔期下二氰蒽醌和吡唑醚菌酯慢性膳食摄入风险 Table 5 Chronic dietary intake risk of dithianon and pyraclostrobin at different intervals

表 6 (Table 6)

表 6 不同采样间隔期下二氰蒽醌和吡唑醚菌酯急性膳食摄入风险 Table 6 Acute dietary intake risk of dithianon and pyraclostrobin at different intervals 人群 Subpopulation 慢性膳食摄入风险ADI Chronic dietary intake risk ADI 二氰蒽醌 dithianon 吡唑醚菌酯 pyraclostrobin 7 d 14 d 21 d 7 d 14 d 21 d 2～6岁age 2-6 73.5 17.8 14.5 117.9 29.64 22.88 7～14岁age 7-14 35.1 8.50 6.92 56.34 14.17 10.94 18～30岁age 18-30 22.8 5.51 4.49 36.55 9.19 7.10 60～70岁age 60-70 21.8 5.27 4.29 34.95 8.79 6.78

表 6 不同采样间隔期下二氰蒽醌和吡唑醚菌酯急性膳食摄入风险 Table 6 Acute dietary intake risk of dithianon and pyraclostrobin at different intervals

根据联合国粮食及农业组织公布的数据，中国居民枣消费大份餐LP为0.286 2 kg^[21]，可能包括了鲜食枣、干枣和其他枣产品的总质量，本研究只针对我国鲜食枣中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的膳食摄入风险进行评估，实际消费的鲜食枣大份餐质量可能比联合国公布的数据要小。引用该数据虽然符合风险评估风险最大化原则，但要进一步准确评估枣中吡唑醚菌酯的膳食摄入风险需要综合考虑鲜食枣、干枣和其他枣产品的实际消费和食用情况。另外，考虑后续加工因素干枣中的残留量可能要远远低于鲜食枣，膳食摄入风险可能大大降低。

通过田间试验，利用本研究所建立的高效液相色谱紫外检测方法，研究了二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣中的消解规律、最终残留水平以及膳食摄入风险。结果表明：二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在枣中降解规律符合一级动力学指数模型，其消解半衰期分别为1.5～2.5和12.4～18.4 d。16%唑醚·氰蒽醌水分散粒剂分别以推荐剂量2.67 g/kg和推荐剂量的1.5倍4.0 g/kg施药3～4次，施药间隔7 d，采收距最后一次施药7 d时，枣中二氰蒽醌残留量为0.161～3.83 mg/kg，吡唑醚菌酯为0.177～3.07 mg/kg。急(慢)性膳食风险评估结果表明：吡唑醚菌酯的最高残留量对2～6岁的幼儿存在不可接受的急性膳食摄入风险，对其他人群的风险较低；采收距最后一次施药14和21 d时，枣中二氰蒽醌残留量为<0.10～0.926 mg/kg，吡唑醚菌酯为<0.10～0.768 mg/kg，两者对4类人群的急(慢)性膳食摄入风险均较低，因此建议16%唑醚·氰蒽醌水分散粒剂施用剂量2.67 g/kg，施药3次，间隔期7 d，采收间隔期为14 d，可以有效保护各类消费者健康。