莲雾Syzygium samarangense，原产马来西亚、印度尼西亚和印度，为桃金娘科蒲桃属热带常绿乔木果树。17世纪我国台湾最早引种，是著名的热带水果^[1]。我国广东、海南、福建、广西、云南和四川等省区均有栽培。莲雾性喜高温、高湿气候，种植过程中易发生炭疽病、果腐病、藻斑病、果蝇、金龟子及蚧壳虫等病虫害，多用化学农药进行防治^[2]。在防治过程中，种植者往往会选用一些混配农药，或多种农药混合施用。由于莲雾皮可食，若农药残留超标则存在较大的质量安全风险。因此，建立可同时测定莲雾中常见农药残留量的分析方法非常必要。

多菌灵，化学名称为N-(2-苯并咪唑基)-氨基甲酸甲酯，是一种广谱性杀菌剂，对多种作物的病害有防治效果^{[3, 4]}；噻菌灵，化学名称为2-(4-噻唑基)-1H-苯并咪唑，属苯咪唑类杀菌剂，能防治多种作物的真菌病害，亦可用于防治水果和蔬菜采后的某些病害^{[5, 6]}；甲霜灵，化学名称为D，L-N-(2，6-二甲基苯基)-N-(2-甲氧基乙酰)，是特效杀菌剂，可有效防治多种作物霜霉病，瓜果蔬菜类的疫霉病、谷子白发病^{[7, 8]}。多菌灵、噻菌灵及甲霜灵的结构式^{[9, 10, 11]}见Scheme 1。目前关于多菌灵、噻菌灵和甲霜灵的检测方法主要有液相色谱法^{[3, 7, 12]}、气相色谱法^{[5, 13]}、液相色谱-串联质谱法^{[4, 8, 14]}以及气相色谱-串联质谱法^{[6, 15]}，但所测基质与莲雾存在很大差异，其前处理方法并不适于莲雾中农药残留的提取。张群等^[16]运用气相色谱-串联质谱法测定了莲雾中灭蚁灵和哒螨灵的残留，但其前处理采用了毒性较高的甲苯，且操作相对繁琐。目前，针对于莲雾中多菌灵、噻菌灵和甲霜灵同时测定的检测方法未见报道。近几年，农药残留分析的样品前处理趋于简单化和环境友好，本研究采用乙腈提取样品，定容后直接用高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析，简化了前处理步骤，操作简单，提取效率高，且试剂消耗少，在5 min内即可完成莲雾中多菌灵、噻菌灵和甲霜灵残留的定性与定量检测。

Scheme 1

Waters ACQUITY UPLC/Quattro Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)；EB-280-12电子顶载天平(日本岛津公司)；QL-901旋涡混合器(江苏海门其林医用仪器厂)；0.22 μm有机系滤膜(天津美瑞泰克公司)。

多菌灵(carbendazim)、噻菌灵(thiabendazole)和甲霜灵(metalaxyl)标准品，纯度≥99%，农业部环境质量监督检验测试中心(天津)；乙腈和甲醇，HPLC级，美国Fisher公司；C₁₈色谱柱，美国Waters公司；乙酸铵，分析纯，广州试剂公司；Milli-Q超纯水，美国Millipore公司。

Waters ACQUITY_UPLCTM BEH C₁₈色谱柱(100 mm×2.1mm，1.7 μm)；柱温35 ℃；进样量5 μL；流动相及梯度洗脱条件见表 1。

Table 1">表 1(Table 1)

表 1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution parameters 时间 Time/ min 流速 Flow rate/ (mL/min) 流动相体积分数 Mobile phase/% 1.0 mmol/L 乙酸铵水溶液 1.0 mmol/L Ammonium acelate aqueous solution 甲醇 Methanol 0.0 0.25 90 10 1.0 0.25 30 70 3.5 0.25 30 70 4.0 0.25 90 10 5.0 0.25 90 10

表 1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution parameters

离子源：电喷雾电离(ESI⁺)；毛细管电压3.0 kV；离子源温度110 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流量900 L/h；锥孔气流量50 L/h；碰撞气流量0.21 mL/min；3种农药的质谱采集参数见表 2。

Table 2">表 2(Table 2)

表 2 3种农药质谱采集参数 Table 2 Mass spectrum acquisition parameters of 3 pesticides 农药 Pesticide 保留时间 Retention time/min 定量离子对 Quantitative ion pair，m/z 定性离子对 Qualitative ion pair，m/z 锥孔电压 DP/V 碰撞电压 CE/V 多菌灵carbendazim 2.31 192.0/160.1 192.0/132.1 33 18/28 噻菌灵thiabendazole 2.44 202.1/175.1 202.1/131.1 35 33/25 甲霜灵metalaxyl 2.87 280.1/220.0 280.1/192.1 20 15/15

表 2 3种农药质谱采集参数 Table 2 Mass spectrum acquisition parameters of 3 pesticides

参考文献^{[17, 18]}的方法。将莲雾鲜果于食品料理机中搅碎，混匀；准确称取25.00 g样品于烧杯中，加入50.0 mL乙腈，高速匀浆2 min，静置30 s；过滤至装有7～10 g氯化钠的具塞量筒中，剧烈振摇2 min，静置30 min；准确吸取0.50 mL上层乙腈溶液，加入0.5 mL的V(甲醇)∶V(水)=1∶1溶液，过0.22 μm滤膜后，按1.2节条件测定。

分别准确吸取多菌灵、噻菌灵和甲霜灵标准品(精确至0.01 mL)，以甲醇溶解配制成100 μg/mL的单标储备液，于-18 ℃冷冻避光保存；使用时准确移取适量单标储备液，用甲醇将其分别稀释成10.00和1.00 μg/mL的混合标准储备液，于-18 ℃冷冻避光保存，备用。

取空白样品基质提取液逐级稀释混合标准储备液，配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 μg/mL的基质标准工作液。同时，用V(甲醇)∶V(水)=1∶1溶液逐级稀释混合标准储备液，配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 μg/mL的试剂标准工作液。按1.2节条件测定。分别以多菌灵、噻菌灵和甲霜灵质量浓度(x)为横坐标，对应色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。

称取不含上述3种农药的空白样品25.00 g，分别以0.04、0.4和2 mg/kg 3个添加水平进行添加回收试验，每个水平重复5次。按1.3节的方法提取和1.2节的条件测定，计算添加回收率和相对标准偏差。

本研究考察了丙酮、甲醇、乙腈和乙酸乙酯4种溶剂的提取效果。结果表明：以丙酮和甲醇作为提取溶剂时，其提取范围较广，质谱测定的基质影响较大；乙酸乙酯在水中的溶解度很小，而这3种农药的极性均较强，很难转移到有机相中，回收率不理想；以乙腈作为提取溶剂，基质干扰较小，且回收率、灵敏度、精密度均满足残留分析的要求。因此本方法最终选择乙腈作为提取溶剂。

本研究使用C₁₈色谱柱进行分离，并对流动相进行了筛选：分别以乙腈-超纯水、甲醇-超纯水、乙腈-1 mmol/L的乙酸铵和甲醇-1 mmol/L的乙酸铵作为流动相；为了降低杂质干扰，采用梯度洗脱法对标准溶液进行进样分析。结果发现：以甲醇-1 mmol/L的乙酸铵为流动相进行梯度洗脱时，响应值最高。因此选用甲醇-1 mmol/L的乙酸铵作为流动相，详见表 1。

分别配制1 μg/mL的多菌灵、噻菌灵和甲霜灵标准溶液，在电喷雾离子正离子模式下，采用全扫描和子离子扫描方式进行分析，分别得到母离子和子离子，然后优化各自锥孔电压和碰撞能量。选择特征离子峰进行二级质谱分析，以响应值最大的碎片离子(子离子)为定量离子，次级响应离子为定性离子。经反复测试和优化，得到3种农药的质谱条件(表 2)。对3种农药的定量离子对及定性离子对进行质谱扫描分析(图 1)。从图 1可以看出：各农药化合物的峰形尖锐、确证性强、灵敏度高。运行过程中采用柱后阀切换模式进样质谱，有助于降低对离子源的污染。

图 1

图 1 3种农药的定量(a)与定性(b)离子图 Fig. 1 The mass fragmentation ions for quantitation(a) and identification(b) of the 3 pesticides

结果(表 3)显示：在0.01～0.5 μg/mL范围内，3种农药标准溶液的质量浓度与峰面积间呈良好的线性关系。

Table 3">表 3(Table 3)

表 3 3种农药的线性方程及其决定系数 Table 3 Linear equations and determination coefficient for the tested pesticides 农药 Pesticide 线性范围 Linear/ (μg/mL) 线性方程 Linear equations 决定系数 Coefficient of determination，R2 多菌灵 carbendazim 0.01～0.5 y=2.84×106x+14 254 0.990 噻菌灵 thiabendazole 0.01～0.5 y=2.80×106x+24 985 0.991 甲霜灵 metalaxyl 0.01～0.5 y=4.74×106x+15 629 0.996

表 3 3种农药的线性方程及其决定系数 Table 3 Linear equations and determination coefficient for the tested pesticides

分别以3倍信噪比和10倍信噪比确定作为被测物质的检出限和定量限，莲雾中3种农药的检出限均为0.001 mg/kg，定量限均为0.003 mg/kg。根据实际添加回收试验，确定多菌灵、噻菌灵和甲霜灵的定量限均为0.04 mg/kg，平均添加回收率分别为107%、75%和80%，相对标准偏差分别为6.1%、4.6%和3.8%(n=5)(表 4)。

Table 4">表 4(Table 4)

表 4 3种农药的添加平均回收率和相对标准偏差(n＝5) Table 4 Average recovery and RSDs for the tested pesticides(n＝5) 农药 Pesticide 添加水平 Spiked level/(mg/kg) 平均回收率 Average recovery/% 相对标 准偏差 RSD/% 多菌灵 carbendazim 0.04 107 6.1 0.4 81 2.4 2 97 8.9 噻菌灵 thiabendazole 0.04 75 4.6 0.4 91 2.0 2 101 2.0 甲霜灵 metalaxyl 0.04 80 3.8 0.4 78 7.8 2 87 4.1

表 4 3种农药的添加平均回收率和相对标准偏差(n＝5) Table 4 Average recovery and RSDs for the tested pesticides(n＝5)

结果(表 4)表明：在0.04、0.4和2 mg/kg 3个添加水平下，3种农药的平均回收率在75%～107%之间，相对标准偏差(RSD)在2.0%～8.9%之间，均满足农药残留分析的要求^[19]。对相同浓度的标准溶液进行稳定性测试，同日内每间隔2 h的时间段10次重复进样，多菌灵、噻菌灵和甲霜灵峰面积的相对标准偏差分别为4.2%、2.3%和1.8%，表明本方法的重复性良好。

在相同的色谱条件下，对基质标准工作液和试剂标准工作液进行分析，制作拟合曲线方程，根据公式(1)用斜率比(M_E)来评价基质效应^[20]。若M_E值大于100%，说明基质增强了待测物的离子响应强度，为基质增强效应；反之，若M_E值小于100%则为基质减弱效应^[21]。

式中：B为基质标准工作液曲线斜率，A为试剂标准工作液曲线斜率。

从表 5可以看出：多菌灵、噻菌灵M_E值均大于100%，说明存在基质增强效应；而甲霜灵的M_E值小于100%，表明存在基质减弱效应。从M_E值的大小来看，虽然基质效应不是十分明显，但为了提高定量的准确性，本试验仍采用基质标准工作液对样品进行定量分析。

Table 5">表 5(Table 5)

表 5 基质效应 Table 5 Matrix effects 农药 Pesticide 基质 Matrix 线性方程 Linear equations 基质效应 Matrix effect, ME/% 多菌灵 carbendazim 甲醇-水 Methanol-water y=2.09×106x+16 214 - 莲雾 Wax-apple y=2.84×106x+14 254 136 噻菌灵 thiabendazole 甲醇-水 Methanol-water y=2.69×106x+25 251 - 莲雾 Wax-apple y=2.80×106x+24 985 104 甲霜灵 metalaxyl 甲醇-水 Methanol-water y=5.04×106x+14 058 - 莲雾 Wax-apple y=4.74×106x+15 629 94.0

表 5 基质效应 Table 5 Matrix effects

运用本研究建立的方法对海口市售的10个莲雾样品进行测定，均未检出多菌灵、噻菌灵和甲霜灵。今后还会继续加强对莲雾样品中多菌灵、噻菌灵和甲霜灵残留情况的监测。

本研究建立了莲雾中多菌灵、噻菌灵和甲霜灵残留的UPLC-MS/MS快速检测分析方法。样品无需经过复杂的前处理，提取后即可进样测定。该方法操作简单、高效快捷、灵敏度高、准确性强，在实际检测中具有较强的可行性和实用性，是莲雾中多菌灵、噻菌灵和甲霜灵残留检测比较理想的方法。