茶叶是我国重要的经济作物和出口农产品，其卫生质量对保障人体健康、促进贸易增长具有重要意义。茶树上主要虫害有茶蚜、茶尺蠖和假眼小绿叶蝉等^[1]，在种植过程中需经常使用化学农药。拟除虫菊酯类(以下简称菊酯类)农药具有广谱、高效、低毒和价廉等特点，在茶园广泛使用，但此类农药对光、热稳定，在自然条件下降解慢，使用不当或安全间隔期不够即采茶，容易导致其在茶叶中的残留量超标。由于菊酯类农药可能对神经系统产生毒害作用，有些品种具有“三致”作用^[2]，长期接触可造成慢性蓄积中毒^[3]，并诱发慢性疾病^{[4, 5]}，此外还有潜在的环境雌激素活性^[6]和一定的生殖毒性^{[7, 8]}，并对免疫和心血管系统存在毒副作用^{[9, 10]}，因此，关于菊酯类农药在茶叶中的残留一直是人们关注的焦点问题。许多国家对茶叶中菊酯类农药的最大残留限量(MRL)都作了严格的规定^{[11, 12, 13]}。

目前菊酯类农药的残留检测方法主要有气相色谱-电子捕获法(GC-ECD)^{[14, 15]}、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^{[16, 17]}、液相色谱法(LC)^{[18, 19]}和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)^{[20, 21]}，其中，GC-MS和LC-MS/MS虽然既可定性又可定量，但由于仪器成本较高，对操作技术要求高，难以大范围的配备和使用；样品的净化方法则大多采用自制层析柱或者商品化的固相萃取小柱，这些净化手段虽然除杂效果好，但存在操作繁琐、溶剂用量大、耗费时间和材料成本高等缺点。而且上述文献报道的主要是针对果蔬、烟草、茶叶、水和土壤等基质^{[14, 15, 17, 19, 20, 21]}中菊酯类农药的检测，有关其在茶鲜叶中的残留研究较少。侯如燕等^[22]采用GC-ECD测定了茶鲜叶中的菊酯类农药残留，但需要自制Florisil层析柱和大量溶剂洗脱，操作繁琐费时。分散固相萃取(dispersive solid phase extraction，DSPE)是2003年美国农业部Anastassiades 等^[23]开发的一种农药残留样品制备技术，该技术利用在样品提取液中充分涡旋的分散吸附填料，可将基质中的色素、脂肪、糖类和有机酸等杂质除去，从而实现复杂样品中农药残留量的快速、高效和经济的测定，目前已广泛应用于食品^{[24, 25]}和环境^{[26, 27]}样品中的农药残留检测。本研究将DSPE方法用于茶鲜叶样品前处理，结合GC-ECD检测，建立了同时分析茶鲜叶中7种菊酯类农药残留的方法。

7890A气相色谱仪(配电子捕获检测器，GC-ECD)、HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)及Chemstation色谱工作站(美国Agilent公司)；KQ-500DE超声波清洗器(昆山超声仪器公司)；TG16-WS高速离心机(湖南湘仪实验仪器公司)；HSC-24B氮吹仪(天津恒奥科技公司)；VM-10涡旋振荡器(韩国Daihan Scientific公司)。

甲氰菊酯(fenpropathrin)、高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、氯菊酯(permethrin)、氟氯氰菊酯(cyfluthrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、氰戊菊酯(fenvalerate)和溴氰菊酯(deltamethrin)，均为标准品，质量浓度为1 000 mg/L，购于农业部环境保护科研监测所；正己烷，HPLC级(瑞典Oceanpak公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA，粒度40～60 μm)和石墨化碳黑(GCB，粒度40～120 μm)，Agela Technologies公司；十八烷基硅烷键合硅胶(C₁₈，粒度40～60 μm)，美国Sepax Technologies公司；乙腈、乙酸、无水乙酸钠和无水硫酸镁(620 ℃灼烧4 h)，均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

茶鲜叶取自苏州东洞庭山碧螺春茶园，用组织捣碎机粉碎、混匀，装入聚乙烯塑料袋，于-20 ℃贮存，备用。

称取已粉碎的茶鲜叶5.0 g，置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL V(乙酸)∶V(乙腈)=1∶99的混合溶液混匀，超声提取15 min；加入2 g无水乙酸钠和1 g无水硫酸镁，涡旋2 min；于9 000 r/min条件下离心4 min；准确吸取4 mL上层提取液加入10 mL聚四氟乙烯离心管中，待净化。

在待净化的溶液中加入0.15 g的 C₁₈、0.15 g的PSA、0.12 g的GCB和0.3 g的无水硫酸镁，涡旋2 min；于9 000 r/min条件下离心5 min；移取2.0 mL上清液，在50 ℃水浴中用氮气吹至近干，用正己烷定容至1.0 mL，在混合器上混匀，过0.22 μm有机系滤膜，得茶鲜叶样品的净化液，待GC-ECD测定。

进样口温度220 ℃；升温程序：80 ℃保持0.3 min，以30 ℃/min升温至180 ℃保持5 min，以20 ℃/min升温至260 ℃保持23 min；检测器温度300 ℃；载气为高纯氮气，流速1.0 mL/min；进样量1.0 μL，不分流进样。

分别移取1 mL 1 000 mg/L 的7种菊酯类农药标准品置于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，配成质量浓度为100 mg/L的单标溶液。根据各农药在ECD检测器上的响应值，取高效氯氟氰菊酯单标溶液0.1 mL，甲氰菊酯、氟氯氰菊酯单标溶液各0.25 mL，其余菊酯类农药单标溶液各0.5 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，得混合标准储备液，于4 ℃冰箱中保存，备用。

取空白茶鲜叶样品的净化液作为溶剂，配制7种菊酯类农药的基质匹配系列标准溶液，高效氯氟氰菊酯质量浓度为0.004、0.01、0.02、0.1、0.2和0.4 mg/L，甲氰菊酯、氟氯氰菊酯质量浓度分别为0.01、0.025、0.05、0.25、0.5和1 mg/L，氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯质量浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.5、1和2 mg/L，按1.3节条件测定。以标准溶液的质量浓度(ρ)为横坐标，峰面积响应值(A)为纵坐标，绘制各菊酯类农药的基质标准曲线。

准确称取5.0 g茶鲜叶，分别添加50、200和500 μL 的1.4节中7种菊酯类农药混合标准储备液(高效氯氟氰菊酯的添加水平分别相当于0.01、0.04和0.1 mg/kg，甲氰菊酯、氟氯氰菊酯分别相当于0.025、0.10和0.25 mg/kg，氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯分别相当于0.05、0.2和0.5 mg/kg)，混匀，静置1 h，按1.2节方法处理和1.3节条件测定，每个水平批内重复6次，批间重复3次，计算方法的准确度和精密度，准确度以平均回收率表示，精密度以相对标准偏差RSD表示。

准确吸取1.0 μL样品净化液进样，记录色谱峰保留时间和峰面积。再吸取1.0 μL基质混合标准液进样，记录保留时间和峰面积，以保留时间定性，基质外标法定量，对含有2个及2个以上异构体的菊酯类农药，以各异构体的峰面积之和计算。定量计算公式如下：

ω=(ρ×V×f)/m

式中：ω为样品中待测农药残留量(mg/kg)，ρ为测定值(mg/L)，m为称取的样品质量(g)，V为定容体积(mL)，f为稀释倍数。

乙腈渗透性强，对不同极性菊酯类农药溶解度好，提取效率高，且对样品基质中的蜡类和脂肪等非极性成分提取能力弱，能够有效减少提取液中杂质^[28]，因此本试验以乙腈为提取溶剂。比较了乙腈、V(乙酸)∶V(乙腈)=1∶99混合溶剂的提取效率。结果发现：V(乙酸)∶V(乙腈)=1∶99的混合溶剂提取回收率较乙腈高，且平行性较好；提取剂用量为10 mL，即体积相当于2倍量的样品质量，既保证了目标农药的充分提取，又节省了试剂，减少环境污染；采用超声波提取方式，操作简单，所需时间短(本试验超声时间为15 min)，提取效率高，可实现批量样品的同时处理。

采用DSPE净化方法，简单、经济、快速。DSPE常用的分散吸附剂有PSA、C₁₈和GCB等。PSA可以有效地去除脂肪酸、有机酸和一些糖类物质，但去除色素效果一般；C₁₈去除维生素、甾醇、油脂的能力较强；GCB能够强烈吸附色素类物质，对基质的颜色净化效果较好^{[29, 30]}。由于茶鲜叶中含有甾醇、脂肪酸、油类和蜡类等杂质，且色素含量高，因此试验选用PSA、C₁₈ 和GCB 3种吸附剂混合净化，并考察其不同用量的净化效果及对目标农药回收率的影响。取4.0 mL空白样品提取液，加入50 μL的7种菊酯类农药的混合标准储备液，混匀后经不同质量(50～250 mg)的3种吸附剂涡旋净化。结果表明：当PSA、C₁₈用量为150 mg、GCB用量为120 mg时，7种农药的平均回收率在82%～104%之间(n=3)；随着3种吸附剂用量的增加，提取液中色素等杂质的干扰峰虽明显减少，但农药的回收率有所降低。为最大程度地净化样品提取液并保证回收率，本研究选择在4.0 mL提取液中加入150 mg的PSA、150 mg的C₁₈和120 mg的GCB吸附杂质，同时加入300 mg 无水硫酸镁除去溶剂中水分。由图1可以看出：7种菊酯类农药的分离效果较好，且目标组分出峰处无明显的干扰杂峰，说明本方法的色谱条件及样品前处理条件选择合适。

图 1

1.甲氰菊酯(fenpropathrin, 0.025 mg/kg); 2.高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin, 0.01 mg/kg); 3.氯菊酯(permethrin, 0.05 mg/kg); 4.氟氯氰菊酯(cyfluthrin, 0.025 mg/kg); 5.氯氰菊酯(cypermethrin, 0.05 mg/kg); 6.氰戊菊酯(fenvalerate, 0.05 mg/kg); 7.溴氰菊酯(deltamethrin, 0.05 mg/kg)。 图 1 7种菊酯类农药在茶鲜叶中的添加回收(A)及茶鲜叶空白样品(B)色谱图 Fig. 1 Gas chromatogram of fortified pyrethroid pesticides in fresh tea leaves (A) and control of fresh tea leaves(B)

采用气相色谱法检测农药残留时，待测农药极易受到样品基质效应的影响^[31]，故对正己烷混合标准溶液和基质匹配标准溶液进行了对比检测(平行测定3次)。结果(图2)表明：除甲氰菊酯、氯菊酯外，其他5种菊酯类农药基质匹配标准溶液的峰面积均明显高于正己烷混合标准溶液的峰面积，表明在检测茶鲜叶中这7种菊酯类农药时存在基质增强效应。故在用外标法定量时，用空白基质净化液为溶剂配制标准溶液，以消除基质干扰，减少误差。

图 2

注：各农药的质量浓度高效氯氟氰菊酯为0.04 mg/L， 甲氰菊酯、氟氯氰菊酯为0.1 mg/L，其余均为0.2 mg/L。 Note:the concentration of lambda-cyhalothrin 0.04 mg/L, fenpropathrin and cyfluthrin 0.1 mg/L and other pyrethroids 0.2 mg/L. 图 2 7种菊酯类农药在茶鲜叶中的基质效应 Fig. 2 Matrix effect of 7 pyrethroid pesticides in fresh tea leaves

结果(表1)表明：7种菊酯类农药的质量浓度(ρ)与色谱峰面积(A)间呈良好的线性关系，相关系数为0.999 3～0.999 9。以最小添加水平色谱图中信噪比的3倍确定各农药的检出限(LOD)，以最小添加水平确定其定量限(LOQ)，结果见表1。

Table 1表 1(Table 1)

表 1 7种菊酯类农药的基质匹配标准曲线、线性范围、相关系数、检出限和定量限 Table 1 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, LOD and LOQ for 7 pyrethroid pesticides 农药 Pesticides 线性范围 Linear ranges /(mg/L) 线性方程 Linear equations 相关系数 Correlation coefficient,r 检出限 LOD/ (mg/kg) 定量限 LOQ/ (mg/kg) 甲氰菊酯fenpropathrin 0.01～1.0 A=28 603ρ-237.21 0.999 5 0.003 0.025 高效氯氟氰菊酯 lambda-cyhalothrin 0.004～0.4 A=82 591ρ-606.68 0.999 3 0.002 0.01 氯菊酯 permethrin 0.02～2 A=10 010ρ+242.7 0.999 7 0.02 0.05 氟氯氰菊酯 cyfluthrin 0.01～1 A=68 506ρ-1 256.1 0.999 4 0.005 0.025 氯氰菊酯 cypermethrin 0.02～2 A=63 290ρ-844.55 0.999 9 0.009 0.05 氰戊菊酯 fenvalerate 0.02～2 A=54 914ρ-1 057.7 0.999 9 0.009 0.05 溴氰菊酯 deltamethrin 0.02～2 A=62 942ρ-2 401.4 0.999 5 0.008 0.05

表 1 7种菊酯类农药的基质匹配标准曲线、线性范围、相关系数、检出限和定量限 Table 1 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, LOD and LOQ for 7 pyrethroid pesticides

结果(表2)显示：在0.01～0.5 mg/kg 范围内，7种菊酯类农药在茶鲜叶中的平均回收率在80%～101%之间，日内相对标准偏差(RSD)为2.8%～8.4%(n=6)，日间RSD为3.3%～9.3%(n=3)，均符合农药残留检测的要求^[32]。

Table 2表 2(Table 2)

表 2 7种菊酯类农药在茶鲜叶中的平均回收率和相对标准偏差 Table 2 Average recoveries and relative standard deviations of 7 pyrethroid pesticides in fresh tea leaves 农药 Pesticides 添加水平 Spiked level/ (mg/kg) 日内(n=6) Intra-day(n=6) 日间(n=3) Inter-day (n=3) 平均回收率 Average recovery/% 相对标准偏差 RSD/% 平均回收率 Average recovery/% 相对标准偏差 RSD/% 甲氰菊酯 fenpropathrin 0.025 98 6.9 94 7.3 0.1 86 4.0 84 6.5 0.25 95 4.9 93 7.2 高效氯氟氰菊酯 lambda-cyhalothrin 0.01 94 8.4 90 7.7 0.04 80 4.7 81 5.5 0.1 93 7.3 94 9.1 氯菊酯 permethrin 0.05 96 7.7 96 7.2 0.2 86 4.8 87 5.4 0.5 91 6.7 92 3.8 氟氯氰菊酯 cyfluthrin 0.025 93 6.5 90 6.6 0.1 80 4.8 83 3.3 0.25 91 6.7 94 4.2 氯氰菊酯 cypermethrin 0.05 101 6.3 97 6.3 0.2 82 2.8 86 4.7 0.5 93 6.1 98 9.2 氰戊菊酯 fenvalerate 0.05 97 4.6 93 3.5 0.2 84 5.7 86 6.2 0.5 93 5.4 94 5.4 溴氰菊酯 deltamethrin 0.05 91 6.2 90 8.3 0.2 83 6.0 86 9.3 0.5 97 5.6 94 5.5

表 2 7种菊酯类农药在茶鲜叶中的平均回收率和相对标准偏差 Table 2 Average recoveries and relative standard deviations of 7 pyrethroid pesticides in fresh tea leaves

用所建立的方法对采自苏州东洞庭山某碧螺春茶园的茶鲜叶样品进行了检测。结果(图3)表明：16份茶鲜叶样品中，检出含有甲氰菊酯、溴氰菊酯和高效氯氟氰菊酯的样品各1份，其含量分别为0.023 5、0.051 1和0.043 1 mg/kg，均低于我国、欧盟和国际食品法典委员会规定的MRL值(表3)。

图 3

图 3 实际茶鲜叶样品色谱图 Fig. 3 Gas chromatogram of fresh tea leaves sample

Table 3表 3(Table 3)

表 3 中国、欧盟和国际食品法典委员会规定的茶叶中农药最大残留限量标准 Table 3 MRL set on tea by China, EU and CAC 农药 Pesticides MRL值MRL value/(mg/kg) 中国[33] China 欧盟委 员会[34] EU 国际食品法典 委员会[35] CAC 甲氰菊酯fenpropathrin 5 2 2 高效氯氟氰菊酯 lambda-cyhalothrin 15 1 — 氯菊酯permethrin 20 0.1 20 氟氯氰菊酯cyfluthrin 1 0.1 — 氯氰菊酯cypermethrin 20 0.5 15 氰戊菊酯fenvalerate — 0.1 — 溴氰菊酯deltamethrin 10 5 5

表 3 中国、欧盟和国际食品法典委员会规定的茶叶中农药最大残留限量标准 Table 3 MRL set on tea by China, EU and CAC

采用V(乙酸)∶V(乙腈)=1∶99混合溶剂超声提取，PSA、C₁₈和GCB混合吸附剂分散萃取净化，GC-ECD检测，建立了同时测定茶鲜叶中7种菊酯类农药残留的分析方法。该方法具有操作简便、定量准确、溶剂用量少、所用装置简单和易于掌握普及的特点，在茶鲜叶中7种供试菊酯类农药的检出限(LOD)为0.002～0.02 mg/kg，定量限(LOQ)为0.01～0.05 mg/kg，能够满足分析要求，且对检测硬件要求低，适用于茶鲜叶中菊酯类农药残留的分析。在0.01～0.5 mg/kg添加水平下，7种供试农药的平均回收率在80%～101%之间，相对标准偏差(RSD)≤9.3%。

本研究选用超声法提取样品，速度快、效率高、操作简单，提取过程无需人员看守，适合于大批量样品的快速处理。采用DSPE方法净化样品提取液，并对不同吸附剂用量进行优化，与传统的SPE小柱或自制层析柱等净化方法相比，可省去装柱、过柱及大量溶剂洗脱等操作，提高了样品制备的速度，节约了分析成本，而且降低了待测农药组分的损失，检测结果更准确。采用GC-MS和LC-MS/MS等检测方式虽然既可定性又可定量，但仪器价格昂贵，对操作技术要求高，不利于方法的推广使用。GC-ECD作为菊酯类农药的经典检测手段，仪器价格便宜，操作维护简单，是一种可以广泛推广的检测方法。虽然GC-ECD受待测物背景的影响较大，定性可靠性不如质谱方法高，但从茶鲜叶样品净化后色谱图(图1)可以看出，7种供试农药分离较好，在待测组分出峰处无杂质干扰，不影响其定性分析的准确性，而且菊酯类农药属强电负性化合物，在ECD检测器上具有较高的响应值，利用GC-ECD检测灵敏度高，定量效果好，故本研究选用GC-ECD进行检测。

该方法的建立对茶叶菊酯类农药的过程监测，从源头控制茶叶农药残留问题，提高饮茶安全性提供了一定的参考。