蜜蜂是现代农业生产中主要的授粉物种，具有重要的生态功能和经济价值。新烟碱类杀虫剂具有触杀、内吸、胃毒、拒食和驱避等作用，对哺乳动物毒性低，可有效防治同翅目和鞘翅目害虫^[1]。有关蜜蜂等授粉昆虫出现大规模种群崩溃的现象(CCD，蜂群崩溃综合症)曾引起各界的广泛关注^[2]，虽然其具体原因尚无定论，但新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的影响已被广泛认可。Desneux 等研究发现，新烟碱类杀虫剂对蜂王产卵行为以及蜜蜂幼虫发育、化蛹、学习能力、成蜂寿命、飞行定位及采集行为等方面均存在影响^[3]。欧盟委员会规定从2013 年12 月1 日起限制新烟碱类杀虫剂在夏季禾谷类作物和蜜源作物，包括向日葵、油菜、玉米和大豆等与蜜蜂相关作物上的使用。而巴西、加拿大、美国等国家正在对3种新烟碱类杀虫剂进行常规性再登记评价,以期降低或避免其对蜜蜂种群的危害^[4]。

本研究采用点滴法和饲喂管法，测定了吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺及啶虫脒4种代表性新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性，就2种检测方法的优缺点及所得结果进行了比较，并通过其危害商值(hazard quotient,HQ)初步评价了4种药剂对蜜蜂的生态风险，以期为新烟碱类杀虫剂的合理使用及再评价提供理论依据，为我国开展新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的安全性评价提供参考。

意大利蜜蜂 Apis mellifera L. 购自中国农业科学院蜜蜂研究所西山养蜂场。饲养条件为室外人工驯养。全部实验用蜂均为同一蜂群中健康、相近龄期的成年工蜂。饲喂管法试验开始前将蜜蜂在室内黑暗条件下饥饿2 h，以保证试验开始时蜜蜂处于饥饿状态。

97.3%吡虫啉(imidacloprid)、96%噻虫嗪(thiamethoxam)、97%噻虫胺(clothianidin)、96%啶虫脒(acetamiprid)原药以及参比物98%乐果(dimethoate)原药，均由农业部农药检定所提供；25%吡虫啉可湿性粉剂(WP，安徽华星化工股份有限公司)，30%噻虫嗪悬浮剂(SC，重庆种衣剂厂)，5%噻虫胺可湿性粉剂(WP，海利尔药业集团股份有限公司)，40%啶虫脒可溶性粉剂(SP，海南利蒙特生物农药有限公司)。

点滴法蜂笼：木制长方体框架，上下两面蒙有塑料纱网，纱网可打开，长13 cm×宽12 cm×高5.5 cm。饲喂管法蜂笼：钢制长方体框架，一面为可抽式玻璃，底部和顶部有孔，长13 cm×宽6 cm×高10 cm。

参照经合组织(OECD)颁布的“化学品测试准则NO.213”^[5]方法进行。将供试农药用50%蔗糖水溶液溶解并配制成5～6个浓度药液，将蜜蜂引入试验笼中，用饲喂器(注射器)分别饲喂200μL不同浓度药液，3～4 h后取出饲喂器，记录每组药液的消耗量(如果药液具有驱避作用，将导致食物消耗量减少，该情况下可适当延长饲喂时间，但药液饲喂时间最多延长至6 h，同样对食物的消耗量进行记录)。之后饲喂不含药的50%蔗糖水(不限量)。同时设置空白对照(50%蔗糖溶液)，每个处理设3次重复，每重复10只蜜蜂。试验在25～27℃、相对湿度60%～70%、黑暗条件下的人工气候室内进行。以98%乐果原药作为参比物，验证试验方法及体系的可行性。

参照OECD颁布的“化学品测试准则NO.214”^[6]方法进行。将供试农药用丙酮溶解并配制成5～6个浓度的药液。贮蜂笼内的蜜蜂用氮气麻醉后，分别将1.0 μL各浓度药液点滴于蜜蜂中胸背板，待药液晾干后转入试验笼中，用脱脂棉浸泡适量50%蔗糖水饲喂。同时设空白对照(蒸馏水)，必要时加设溶剂对照(丙酮)，每个处理3次重复，每重复10只蜜蜂。试验条件同1.2.1节。同样以乐果作为参比物。

于试验开始后24 和48 h，分别观察并记录蜜蜂死亡数、中毒症状及行为。

用SPSS 17.0统计软件对数据进行回归分析，计算不同浓度药剂对蜜蜂的24和48 h回归方程、卡方值、差异显著性、LD₅₀值及其95%置信限。

点滴法和饲喂管法试验结果的毒性分级均参照我国《化学农药环境安全评价试验准则》^{[7, 8]}进行划分：农药对蜜蜂的急性接触毒性共分为4个等级(以有效成分计)：低毒(LD₅₀＞11.0μg/蜂)；中等毒(2.0μg/蜂＜LD₅₀≤11.0μg/蜂)；高毒(0.001μg/蜂＜LD₅₀≤2.0μg/蜂)；剧毒(LD₅₀≤0.001μg/蜂)。

采用危害商值(HQ) 对供试农药的田间风险进行初步评价^[9]。对蜜蜂而言，HQ_oral=AR/LD_50-oral；HQ_contact=AR/LD_50-contact。其中AR 代表农药的田间推荐施用量(单位: g/hm²)；LD_50-oral和LD_50-contact分别代表饲喂管法和点滴法的LD₅₀值(单位:μg/蜂)。HQ＜50，农药对蜜蜂为低风险；50≤HQ≤2 500 为中等风险；HQ＞2 500为高风险^{[10, 11]}。本文分别采用饲喂管法和点滴法测得的48 h-LD₅₀值计算HQ值。

药剂各处理组蜜蜂前期均表现为激烈挣扎、兴奋等中毒症状，后期表现为活动力减弱或仰躺、抽搐、行动缓慢、反应迟钝等中毒症状，高浓度处理组表现尤为明显。死亡蜜蜂身体蜷缩、体色变深、翅膀呈“一”或“V”字形展开。空白对照组和有机溶剂对照组均未表现出上述症状。

由饲喂管法测定结果(表 1)可知：参比物质乐果的急性经口毒性24 h-LD₅₀值为有效成分0.262 μg/蜂；97.3%吡虫啉原药、25%吡虫啉可湿性粉剂、96%噻虫嗪原药、30%噻虫嗪悬浮剂、97%噻虫胺原药、5%噻虫胺可湿性粉剂、96%啶虫脒原药及40%啶虫脒可溶性粉剂对蜜蜂的急性经口毒性48 h-LD₅₀值分别为有效成分8.04×10^-3、9.46×10^-3、7.04×10^-3、4.64×10^-3、11.8×10^-3、5.25×10^-3、5.22和6.31 μg/蜂。根据农药对蜜蜂的急性经口毒性分级标准^[8]，啶虫脒原药的毒性为中等毒，其他药剂均为高毒。其中原药的毒性从大到小依次为：噻虫嗪>吡虫啉>噻虫胺>啶虫脒；制剂毒性从大到小依次为：30%噻虫嗪悬浮剂>5%噻虫胺可湿性粉剂>25%吡虫啉可湿性粉剂>40%啶虫脒可溶性粉剂。

表 1(Table 1)

表 1 乐果和4种新烟碱类杀虫剂原药及制剂对意蜂的急性经口毒性 (饲喂管法) Tab. 1 LD50 values of dimethoate and neonicotinoid pesticides to honeybees by‘oral-feeding tube’ method 供试药剂 Tested pesticides 时间 Time/h 毒力回归方程 Regression equations 卡方值 Chi-square 显著性值 Sig LD50 (95%置信限, 95% CL)，a.i. /(μg /bee) 97.3% 吡虫啉原药 97.3% imidacloprid technical 24 Y=2.904+1.547x 4.411 0.492 1.33×10-2 (1.13×10-2～1.56×10-2) 48 Y=2.657+1.313x 3.069 0.546 8.04×10-3 (7.82×10-3～1.15×10-2) 25%吡虫啉可湿性粉剂 25% imidacloprid WP 24 Y=3.985+2.022x 5.456 0.363 10.7×10-3 (9.41×10-3～12.2×10-3) 48 Y=3.012+1.562x 3.022 0.554 9.46×10-3 (8.27×10-3～10.9×10-3) 96%噻虫嗪原药 96% thiamethoxam technical 24 Y=4.268+2.038x 5.572 0.233 8.06×10-3 (7.45×10-3～9.23×10-3) 48 Y=4.316+2.006x 5.300 0.380 7.04×10-3 (6.17×10-3～8.06×10-3) 30%噻虫嗪悬浮剂 30% thiamethoxam SC 24 Y=3.289+1.457x 3.349 0.646 5.52×10-3 (4.68×10-3～6.52×10-3) 48 Y=3.676+1.575x 6.723 0.242 4.64×10-3 (3.97×10-3～5.42×10-3) 97%噻虫胺原药 97%clothianidin technical 24 Y=2.687+1.445x 6.658 0.247 1.38×10-2 (1.17×10-2～1.65×10-2) 48 Y=3.012+1.562x 6.534 0.258 11.8×10-3(10.1×10-3～13.8×10-3) 5%噻虫胺可湿性粉剂 5%clothianidin WP 24 Y=4.150+1.844x 4.770 0.445 5.62×10-3 (4.90×10-3～6.46×10-3) 48 Y=4.084+1.791x 5.442 0.364 5.25×10-3 (4.56×10-3～6.04×10-3) 96%啶虫脒原药 96% acetamiprid technical 24 Y=-1.540+1.920x 2.255 0.414 6.34 (5.46～7.43) 48 Y=1.407+1.960x 1.569 0.666 5.22 (4.52～6.06) 40%啶虫脒可溶性粉剂 40% acetamiprid SP 24 Y=-1.613+1.902x 1.415 0.493 7.05 (5.99～8.65) 48 Y=-1.655+2.068x 3.569 0.312 6.31 (5.46～7.48) 98%乐果原药 98% dimethoate technical 24 Y=1.400+2.410x 3.171 0.366 0.262 (0.234～0.297)

表 1 乐果和4种新烟碱类杀虫剂原药及制剂对意蜂的急性经口毒性 (饲喂管法) Tab. 1 LD50 values of dimethoate and neonicotinoid pesticides to honeybees by‘oral-feeding tube’ method

由点滴法测定结果(表 2)可知：参比物质乐果的急性接触毒性24 h-LD₅₀值为有效成分0.260 μg/蜂；97.3%吡虫啉原药、25%吡虫啉可湿性粉剂、96%噻虫嗪原药、30%噻虫嗪悬浮剂、97%噻虫胺原药、5%噻虫胺可湿性粉剂、96%啶虫脒原药及40%啶虫脒可溶性粉剂对蜜蜂的急性接触毒性48 h-LD₅₀值分别为有效成分2.46×10^-2、1.33×10^-2、1.52×10^-2、9.27×10^-3、3.63×10^-2、2.21×10^-2、5.82和5.07μg/蜂。根据农药对蜜蜂的急性接触毒性分级标准^[8]，96%啶虫脒原药和40%啶虫脒可溶性粉剂为中等毒，其他药剂均为高毒。供试原药及制剂的毒性顺序与饲喂管法测定结果相同。

表 2(Table 2)

表 2 乐果和4种新烟碱类杀虫剂原药及制剂对蜜蜂的急性接触毒性 (点滴法) Tab. 2 LD50 values of dimethoate and neonicotinoid pesticides to honeybees by topical application method 供试药剂 Tested pesticides 时间 Time/h 毒力回归方程 Regression equations 卡方值 Chi-square 显著性值 Sig LD50 (95%置信限, 95% CL),a.i. /(μg /bee) 97.3% 吡虫啉原药 97.3% imidacloprid technical 24 Y=3.611+2.405x 6.734 0.151 3.15×10-2(2.82×10-2～3.59×10-2) 48 Y=4.406+2.738x 5.942 0.204 2.46×10-2(2.24×10-2～2.72×10-2) 25%吡虫啉可湿性粉剂 25% imidacloprid WP 24 Y=2.516+1.524x 3.448 0.486 2.23×10-2(1.87×10-2～2.72×10-2) 48 Y=1.357+1.551x 3.808 0.433 1.33×10-2(1.13×10-2～1.58×10-2) 96%噻虫嗪原药 96% thiamethoxam technical 24 Y=2.385+1.533x 5.586 0.232 2.78×10-2(2.35×10-2～3.07×10-2) 48 Y=3.048+1.677x 4.991 0.288 1.52×10-2(1.30×10-2～1.78×10-2) 30%噻虫嗪悬浮剂 30% thiamethoxam SC 24 Y=3.278+1.724x 6.097 0.192 1.25×10-2(1.07×10-2～1.46×10-2) 48 Y=3.923+1.930x 2.819 0.589 9.27×10-3(7.98×10-3～10.7×10-3) 97%噻虫胺原药 97%clothianidin technical 24 Y=2.823+1.960x 1.403 0.705 5.32×10-2(4.60×10-2～6.20×10-2) 48 Y=2.375+1.865x 0.930 0.920 3.63×10-2(3.13×10-2～4.26×10-2) 5%噻虫胺可湿性粉剂 5%clothianidin WP 24 Y=-0.771+2.116x 3.800 0.284 2.31×10-2(2.01×10-2～2.66×10-2) 48 Y=3.471+2.097x 4.191 0.381 2.21×10-2(1.94×10-2～2.53×10-2) 96%啶虫脒原药 96% acetamiprid technical 24 Y=-1.599+1.748x 3.538 0.316 8.22(7.00～9.78) 48 Y=-1.376+1.799x 4.288 0.368 5.82(37.8～46.8) 40%啶虫脒可溶性粉剂 40% acetamiprid SP 24 Y=-1.476+1.817x 8.187 0.042 6.49(4.19～10.9) 48 Y=-1.380+1.958x 6.879 0.957 5.07(4.37～5.87) 98%乐果原药 98% dimethoate technical 24 Y=1.478+2.531x 2.101 0.552 0.260(0.233～0.293)

表 2 乐果和4种新烟碱类杀虫剂原药及制剂对蜜蜂的急性接触毒性 (点滴法) Tab. 2 LD50 values of dimethoate and neonicotinoid pesticides to honeybees by topical application method

由饲喂管法及点滴法测得的48 h-LD₅₀值计算得到4种新烟碱类杀虫剂制剂对蜜蜂的危害商值(HQ)(表 3)。其中，除40%啶虫脒可溶性粉剂的经口和接触HQ值小于50外，吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺制剂的经口和接触HQ值均大于2 500。表明40%啶虫脒可溶性粉剂对蜜蜂为低风险，其他3种供试药剂均为高风险。

表 3(Table 3)

表 3 供试4种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的危害商值 Tab. 3 Hazard quotient of 4 kinds of neonicotinoid pesticides to honeybees 供试药剂 Tested pesticides 田间推荐剂量 AR/(g/hm2) 试验类型 Test type 48 h-LD50，a.i./ (μg /bee) 危害商值 Hazard quotient，HQ 25%吡虫啉可湿性粉剂 25% imidacloprid WP 45 接触 Contact 1.33×10-2 3 383 经口Oral 8.04×10-3 5 597 30%噻虫嗪悬浮剂 30% thiamethoxam SC 25 接触 Contact 9.27×10-3 2 697 经口Oral 4.64×10-3 5 388 5%噻虫胺可湿性粉剂 5% clothianidin WP 60 接触 Contact 2.21×10-2 2 715 经口Oral 5.25×10-3 11 429 40%啶虫脒可溶性粉剂 40% acetamiprid SP 30 接触 Contact 5.07 5.92 经口Oral 6.31 4.75

表 3 供试4种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的危害商值 Tab. 3 Hazard quotient of 4 kinds of neonicotinoid pesticides to honeybees

本研究选取98%乐果原药作为参比物，饲喂管法及点滴法测得其对蜜蜂的经口及接触毒性24 h-LD₅₀值分别为有效成分0.262和0.260μg/蜂，结果均符合我国^[8]和OECD“化学品测试准则”中乐果对蜜蜂的24 h-LD₅₀急性毒性范围^{[5, 6]}，表明试验体系及方法可靠。

本研究表明：两种方法均测得原药毒性从大到小依次为噻虫嗪>吡虫啉>噻虫胺>啶虫脒，制剂毒性从大到小依次为30%噻虫嗪悬浮剂>5%噻虫胺可湿性粉剂>25%吡虫啉可湿性粉剂>40%啶虫脒可溶性粉剂。由表 2中数据发现，在处理时间相同的情况下，点滴法测得4种杀虫剂制剂的LD₅₀值均略低于其对应原药，说明制剂的接触毒性均高于对应的原药。而表 1中饲喂管法试验数据并未表现出此规律。究其原因，可能与制剂加工过程中的工艺和使用的助溶剂不同有关。点滴法是实验人员定量强制给蜜蜂染毒，而饲喂管法中药剂可能会对蜜蜂产生驱避作用，从而导致LD₅₀值偏高。因此，通过饲喂管法量化评价供试农药对蜜蜂的经口毒性效应，可以同时得到药剂对蜜蜂的适口性信息。

危害商值(HQ)的大小一方面取决于农药的田间推荐施用量，另一方面取决于农药对蜜蜂的急性经口和接触毒性LD₅₀值。本研究发现，40%啶虫脒可溶性粉剂在饲喂管法和点滴法下的HQ值均小于50，因此啶虫脒对蜜蜂为低风险；其他3种药剂的HQ值均大于2 500，说明其对蜜蜂均为高风险。目前吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺主要登记用在水稻、棉花、玉米、果蔬等主要经济及蜜粉源作物上^[12]，因此建议在蜜源植物花期或流蜜期时应避免使用吡虫啉、噻虫嗪和噻虫啉，或尽量使用对蜜蜂风险性较低的啶虫脒。

新烟碱类杀虫剂被广泛用于种子、土壤和茎叶处理，其中最主要的用途为种子包衣防治地下害虫。笔者认为：新烟碱类杀虫剂的内吸性决定了药剂可通过植物根系转移到花粉、花蜜及吐露中，但含量较低，可能不会对采集蜂造成急性毒性影响；但考虑到不同龄期蜜蜂接触药剂的途径(如成蜂进食花蜜多于花粉，幼虫则相反)和不同蜜蜂对药剂的敏感性 [哺育蜂(也叫工勤蜂)和幼虫对农药更为敏感] 存在较大差异，因此残留在花粉、花蜜和吐露中的新烟碱类农药是否会对哺育蜂和幼虫造成影响，仍需进行更为深入的研究；对于吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺等对蜜蜂具有高风险性的农药，应该进行更高阶段的风险评估；通过借鉴国际先进的农药对环境生物的安全性评价技术，完善农药对蜜蜂整个世代影响的评估方法，探索并建立符合我国特点的农药对蜜蜂安全性评价方法和体系显得尤为重要。