苯肽胺酸(phthalanilic acid，结构式见(Scheme 1)化学名称N-苯基邻苯二甲酸单酰胺，是一种植物生长调节剂，于1982年由匈牙利Neviki化学工业研究所开发，1993年商业化生产并投入使用^[1]。已有文献报道了苯肽胺酸在水果及蔬菜上的残留分析方法^[2]，但尚未见关于土壤中苯肽胺酸残留分析方法的研究报道。

Scheme 1

淋溶是农药物理迁移的重要途径，也是评价农药会否对地下水产生污染的重要参数^[3]。研究农药在不同土壤中的迁移行为，可预测其对地下水的影响，进而对其施用范围和强度进行必要的限定^{[4, 5, 6]}

本研究建立了我国3种典型土壤中苯肽胺酸残留量的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS) 分析方法，并基于该方法，结合土壤薄层层析试验研究了苯肽胺酸在我国典型土壤中的淋溶特性，以期为准确预测及评价其在土壤中的迁移行为提供参考。

1 材料与方法 1.1 主要仪器及试剂

Acquity UPLC-TQD 超高效液相色谱-串联质谱仪及Acquity UPLC HSST3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)(美国Waters公司)；0.22 μm滤膜(美国Millipore公司)；Milli-Q超纯水发生仪。

苯肽胺酸(phthalanilic acid)标准品(纯度97.0%，陕西上路之路有限公司)。色谱纯乙腈、甲醇、甲酸，分析纯无水硫酸镁、氯化钠，净化剂N-丙基乙二胺(PSA)、C₁₈和石墨化炭黑(GCB)，均购自天津博纳艾杰尔科技有限公司。

所用土壤样品为黑土、红土和水稻土，分别采自吉林、湖南和江苏3省。土样经自然风干后过2.5 mm 筛，待用。土壤基本理化性质见表1。

表 1(Table 1)

表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 The physical and chemical characteristics of the soil 土壤类型 Soil type 来源Source pH 有机质质量分数 OM/% 黏粒质量分数 Clay/% 阳离子交换量 C.E.C/(cmol/kg) 水稻土Rice soil 江苏Jiangsu 7.5 1.00 24.1 19.0 红土Red soil 湖南Hunan 7.9 1.27 22.7 15.2 黑土Black soil 吉林Jilin 8.1 1.40 22.5 16.4

表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 The physical and chemical characteristics of the soil

准确称取1 g土样于10 mL离心管中，加入0.3 mL 超纯水和2 mL含体积分数0.4%甲酸的乙腈，涡旋提取3 min；加入0.3 g氯化钠，涡旋1 min；于 5 000 r/min 离心5 min，抽取上层有机相1.0 mL于内含50 mg PSA和100 mg无水硫酸镁的2 mL离心管中，涡旋1 min；于5 000 r/min离心5 min，取上清液，过0.22 μm滤膜，待测。

准确称取0.013 1 g苯肽胺酸标准品，用10 mL色谱纯乙腈配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液。试验时再用乙腈逐级稀释成1、0.5、0.1、0.05、0.025、0.01 mg/L的系列标准工作溶液；基质匹配标准溶液则通过向已知浓度的标准工作溶液中分别添加相应量的空白红土、黑土和水稻土提取液制得。配制好的标准工作溶液和基质匹配标准溶液均避光保存于0～4 ℃冰箱，待用。

超高效液相色谱条件：Acquity UPLC HSST3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相为甲醇-超纯水，流速0.3 mL/min；进样量1 μL；柱温 40 ℃，进样室温度4 ℃。梯度洗脱程序：0 min，V(甲醇)∶V(超纯水)=10∶90；2 min，V(甲醇)∶V(超纯水)=90∶10；3 min，V(甲醇)∶V(超纯水)=90∶10；3.1 min，V(甲醇)∶V(超纯水)=10∶90；5 min，V(甲醇)∶V(超纯水)=10∶90。

质谱检测条件：电喷雾ES(-)扫描模式；毛细管电压3.0 kV；离子源温度120 ℃；去溶剂温度350 ℃；去溶剂气流量600 L/h；锥孔电压33 V；碰撞气为氩气；母离子m/z=240，定量离子m/z=196，定性离子m/z=118。外标法定量，进样量1 μL。

在此条件下，苯肽胺酸的保留时间为2.2 min。

分别取0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1 mg/L 的标准工作溶液和基质匹配标准溶液，在1.5节条件下进行检测，重复3次。以进样质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，得到线性回归方程及决定系数(R²)。向空白土壤样品中分别添加0.1、1和10 mg/kg 3个水平的苯肽胺酸，测定其回收率和相对标准偏差(RSD)，重复5次。以最小添加水平(0.1 mg/kg)信噪比S/N=3及S/N=10 分别计算得苯肽胺酸在3种土壤中的检出限(LOD)和定量限(LOQ)^[7]。

以基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率计算基质效应(matrix effect，ME)：ME > 1.1，为基质增强效应；ME < 0.9，为基质减弱效应；0.9 < ME < 1.1，则基质效应可以忽略^[8]。

依照《化学农药环境安全评价试验准则》^[9]中有关土壤淋溶试验的要求进行。准确称取12 g过0.25 mm筛的土样于烧杯中，加超纯水搅拌(其中黑土和水稻土加8 mL，红土加8.5 mL)至均匀的泥浆状，均匀涂布于层析玻璃板上，25 ℃下避光晾干。在距薄板底部1.5 cm处点 1 000 mg/L的药液10 μL，对照点等体积的乙腈。以超纯水为展开剂，在室温(20 ℃)下展开。当展开剂到达薄板前沿13.5 cm处，取出晾干。将展开后的土样均匀分成6段(每段2 cm，约1 g)，参照1.3及1.5节所建立的样品提取及残留分析方法，检测每段土壤中苯肽胺酸的含量。

2 结果与分析 2.1 方法的线性关系、灵敏度、基质效应、准确度和精密度

由表2可知：在0.005～1 mg/L范围内，苯肽胺酸在3种土壤中的峰面积与其质量浓度之间线性关系良好，决定系数R²均大于0.99；LOQ和LOD分别为1.8～3.0 μg/kg和0.6～1.0 μg/kg；3种土壤均呈基质减弱效应。

表 2(Table 2)

表 2 不同基质中苯肽胺酸的线性方程、决定系数、基质效应、定量限和检测限 Table 2 Regression equations, coefficient of determination, LOD, LOQ and matrix effect of phthalanilic acid 基质 Matrix 回归方程 Regression equation 决定系数 Coefficient of determination, R2 基质效应 Matrix effect 定量限 LOQ/(μg/kg) 检出限LOD/(μg/kg) 乙腈Acetonitrile y=21 600x+98.8 0.999 2 - - - 黑土Black soil y=7 190.2x+57.0 0.999 9 0.3 1.8 0.6 红土Red soil y=6 679.7x+334.4 0.994 2 0.3 2.0 0.7 水稻土Rice soil y=6 705.6x+77.8 0.999 1 0.3 3.0 1.0

表 2 不同基质中苯肽胺酸的线性方程、决定系数、基质效应、定量限和检测限 Table 2 Regression equations, coefficient of determination, LOD, LOQ and matrix effect of phthalanilic acid

添加回收试验结果见表3，表明所建立方法的准确性和精密度均能满足农药残留分析的要求(70% < 回收率 < 110%，RSD < 20%)。最小添加水平0.1 mg/kg下的相关色谱图见图1(以吉林黑土为例)。

表 3(Table 3)

表 3 苯肽胺酸在 3 种土壤中的添加回收试验结果 Table 3 Recoveries of phthalanilic acid in three types of soil 基质 Matrix 添加水平 Spiked level/ (mg/kg) 平均回收率 Mean recoveries/% 相对 标准偏差 RSD/% 黑土Black soil 0.1 77.3 5.4 1.0 99.4 1.7 10 94.3 4.6 红土Red soil 0.1 88.5 4.8 1.0 83.6 1.3 10 78.3 2.7 水稻土Rice soil 0.1 87.6 11.4 1.0 80.8 2.6 10 85.2 1.5

表 3 苯肽胺酸在 3 种土壤中的添加回收试验结果 Table 3 Recoveries of phthalanilic acid in three types of soil

图 1

A. 黑土空白样品；B. 0.1 mg/L标准品；C. 0.1 mg/kg 添加水平黑土样品。 A. Blank black soil sample； B. Standard sample at 0.1 mg/L； C. Black soil sample spiked at 0.1 mg/kg. 图 1 苯肽胺酸在乙腈和黑土样品中的典型色谱图 Fig. 1 Typical LC-MS/MS chromatogram of phthalanilic acid in acetonitrile and black soil

采用比移值(R_f)作为衡量农药在土壤中移动性的指标^[9]。苯肽胺酸在不同类型土壤中的淋溶特性研究结果见表4，从中可看出：苯肽胺酸在3种土壤中的移动性差异较大，其在吉林黑土中的R_f值最高，为0.83，在江苏水稻土和湖南红土中的R_f值分别为0.61和0.62。根据《化学农药环境安全评价试验准则》^[9]标准，苯肽胺酸在黑土中的移动性为可移动，在水稻土和红土中为中等移动。

表 4(Table 4)

表 4 以超纯水为展开剂时苯肽胺酸在3种土壤中的薄层层析结果 Table 4 The result of thin layer board with the different soil 土壤薄层分段 Soil thin layer section/cm 土壤中苯肽胺酸质量分数Mass fraction of phthalanilic acid in soil /(μg/kg)，n=3 黑土Black soil 水稻土Rice soil 红土Red soil 1 2 3 CK 1 2 3 CK 1 2 3 CK 1～2 ND 0.1 0.1 ND 0.7 0.6 0.2 ND ND 0.1 0.1 ND 3～4 0.1 0.4 0.1 ND 0.7 1.1 0.3 ND 0.6 0.1 0.5 ND 5～6 0.2 0.2 0.1 ND 0.7 0.8 1.7 ND 1.42 1.8 2.0 ND 7～8 1.7 0.5 0.2 ND 1.5 1.2 1.2 ND 2.08 2.7 2.6 ND 9～10 2.5 2.0 1.4 ND 1.5 1.3 1.3 ND 1.89 1.5 2.5 ND 11～12 2.4 2.7 3.8 ND 0.9 1.0 0.5 ND ND 0.1 0.2 ND Rf 0.83 0.84 0.83 — 0.60 0.59 0.62 — 0.61 0.62 0.63 — *ND为低于定量限。*ND was lower than the LOQ.

表 4 以超纯水为展开剂时苯肽胺酸在3种土壤中的薄层层析结果 Table 4 The result of thin layer board with the different soil

农药在土层中的淋溶深度及污染地下水的潜在可能性受众多因素影响^{[10, 11]}，本研究中主要与 3 种土壤的理化性质有着密切关系。研究显示：土壤pH值越高，苯肽胺酸的移动能力越强，黑土的pH值最高，其R_f值最大，与于爱琛等研究毒死蜱在海南几种典型土壤中淋溶迁移的结果一致^[12]；水稻土中黏粒含量最高，其R_f值最小，证明土壤黏粒含量高会阻碍苯肽胺酸在土壤中的迁移，这与孙扬等研究毒死蜱和氰戊菊酯在土壤中吸附与迁移的结果一致^[13]。

利用UPLC-MS/MS建立了苯肽胺酸在红土、黑土和水稻土 3 种典型土壤中的残留分析方法。结果表明，苯肽胺酸在 3 种土壤中的平均回收率范围为77.3%～99.4%，相对标准偏差为1.3%～11.4%，LOQ和LOD分别为1.8～3.0 μg/kg和0.6～1.0 μg/kg。土壤薄层层析试验结果表明，苯肽胺酸在黑土、水稻土和红土中的R_f 值分别为0.83、0.61和0.62，在黑土中的移动性为可移动， 在水稻土和红土中为中等移动。影响土壤中苯肽胺酸淋溶特性的主要因素是土壤pH值及黏粒含量。